目的  基于网络药理学和动物实验探究茅苍术醇提物对胆管结扎肝纤维化小鼠肝功能的保护作用及可能分子机制。

方法  选取经文献和实验验证的茅苍术主要活性成分苍术素、白术内酯I、Ⅱ、Ⅲ，通过SwissTargetPrediction数据库获取其靶点；通过在线人类孟德尔遗传数据系统（OMIM）、DisGeNET、GeneCards数据库获取肝纤维化疾病靶点。将靶点导入微生信平台，获取茅苍术抗肝纤维化的交集靶点；采用Cytoscape 3.10.1构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图、蛋白-蛋白相互作用核心靶点网络图，进行GO功能富集分析和KEGG通路分析，并将活性成分与核心靶点进行分子对接。采用胆管结扎构建肝纤维化小鼠模型，进行肝功能相关指标检测。

结果  共得到苍术素、白术内酯I、Ⅱ、Ⅲ对应靶点91个，肝纤维化疾病靶点9 296个，交集靶点74个，核心靶点31个；KEGG富集分析显示，主要涉及的信号通路有表皮生长因子受体（EGFR）及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等炎症通路；分子对接结果显示其活性成分与核心靶点蛋白之间具有较强的结合活性。动物实验结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠的肝损伤明显，肝脏指数、脾脏指数、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、肝纤维化程度、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原α1（COL1A1）的mRNA和蛋白表达水平以及IⅤ型胶原α₂（COL4A2）的mRNA表达水平显著升高，胸腺指数显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，茅苍术给药组小鼠肝损伤情况减轻，肝脏指数、脾脏指数、血清ALT、AST活性、肝纤维化程度、α-SMA、COL1A1的mRNA和蛋白表达水平以及COL4A2的mRNA表达水平显著降低，胸腺指数显著升高（P＜0.05）。

结论  茅苍术可改善肝功能，减轻肝纤维化小鼠组织病理损伤，这可能与激活PI3K/Akt等通路、抑制氧化应激和炎症反应，进而干预肝纤维化有关。

肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化、肝癌所共有的病理改变，也是其病理发展必经阶段中唯一可被逆转的过程[1-2]。目前，临床治疗肝纤维化的药物如干扰素、皮质类固醇等存在长期服用后毒性大、不良反应多等问题。采用中医药治疗肝纤维化，因运用了辨证论治，具备整体观和多靶点的药理作用，且安全性较高，具有显著的优势，有进一步发展的潜力[3]。

《金匮要略》中“见肝之病，知肝传脾”，肝脏疾病常累及脾脏，导致脾运失调，现代中医药研究表明，肝纤维化的治疗病机复杂，而肝郁脾虚是肝纤维化最常见的证型，故治疗肝纤维化中医建议以疏肝健脾为主[4-6]。苍术，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾的功效。且应用历史悠久，清朝黄元御撰《玉楸药解》曰：“苍术走而不守……泄水开郁，苍术独长”，朱丹溪亦指出苍术“能解诸郁”[7-8]。而郁证以肝郁多见，提示苍术可能有疏肝解郁的功效，具有抗肝纤维化的潜力。且在具有解六郁之功效的解郁行气经典名方越鞠丸中，苍术处于重要地位[9]。另有越鞠丸加方被验证具有调节肝功能、抗肝纤维化的作用[10]。近年来有研究表明，苍术的有效成分具有抗炎和保肝活性，如：苍术素、白术内酯Ⅲ具有改善非酒精性脂肪肝病和抑制肝纤维化的药理作用[11-13]；白术内酯I可以改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤，降低肝脏炎症[14-15]；白术内酯Ⅱ能改善自发性高血压病大鼠纤维化和氧化应激[16]等，具有良好的保肝活性。但其保护肝功能的可能分子机制尚不明确。基于此，本研究拟采用网络药理学结合动物实验，探究茅苍术缓解肝纤维化组织病理性学改变、减轻肝损伤及肝功能保护可能作用的靶点和通路，以期为茅苍术抗肝纤维化的临床应用提供实验依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

FA1004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BTC-8J超声波清洗机（鼎泰生化科技设备制造有限公司）；Eclipse Ci型正置荧光显微镜（日本尼康公司）；1580R型多功能离心机（韩国Gene Company Limited）；Nano-600型超微量核酸蛋白测定仪（上海嘉鹏科技有限公司）；qTOWER3G型荧光定量PCR仪（德国Analytik Jena AG公司）。

1.2 主要药品与试剂

茅苍术购自湖北英山，经湖北中医药大学杨红兵教授鉴定为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea（Thunb.）DC.的干燥根茎，按照《中国药典（2020年版）》标准将茅苍术药材加工制成茅苍术饮片；天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST，批号：C010-2-1）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT，批号：C009-2-1）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Masson三色染色试剂盒（批号：G1340）和苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号：G1120）购自北京索莱宝科技有限公司；天狼星红染色试剂盒（海懋康生物科技有限公司，批号：MM1004）；ECL化学发光试剂（批号：E422-01）、TRIzol试剂盒（批号：R401-01）、QRT SuperMix for qPCR（批号：R433-01）和SYBR qPCR Master Mix（批号：Q312-02）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PCR引物由擎科生物合成；一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH，批号：60004-1-Ig）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，批号：14395-1-AP）、I型胶原α1（recombinant collagen type I alpha 1，COL1A1，批号：67288-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；β-肌动蛋白（β-actin，爱博泰克生物科技有限公司，批号：9100026001）；二抗兔抗（北京兰杰柯科技有限公司，批号：BL003A）；二抗鼠抗（武汉艾美捷科技有限公司，批号：BS12478）。

1.3 动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，8周龄，体重18~20 g，购自生物科技技术股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK（鄂）2017-0067。小鼠饲养于室温21~25℃、12 h明暗交替照明的分笼内，可自由进食饮水，适应性喂养1周后进行后续实验。本文所涉及的动物实验操作符合湖北中医药大学动物伦理委员会规定（伦理批件号：HUCMS202209003）。

1.4 方法

1.4.1 茅苍术的活性成分选择和靶点预测

结合文献及前期研究基础，选取茅苍术中主要活性成分苍术素、白术内酯I、Ⅱ和Ⅲ，将其结构导入SwissTargetPrediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/），设置物种为“HomoSapiens”，筛选出潜在靶点（P＞0），并使用蛋白质信息数据库UniProt（https://www.uniprot.org/）获得潜在靶点对应的基因名。

1.4.2 肝纤维化靶点的收集

于在线人类孟德尔遗传数据库（On-line Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/）、基因疾病关联数据库（DisGeNET，https://www.disgenet.org/）及人类基因注释数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）检索关键词“Liverfibrosis”和“Hepaticfibrosis”获得肝纤维化的相关靶点。将3个数据库的结果合并，并删除重复靶点，最终获得肝纤维化的相关靶点。将茅苍术活性成分潜在靶点与肝纤维化疾病靶点在微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）绘制韦恩图，得到交集靶点，即茅苍术干预肝纤维化的作用靶点，并运用Cytoscape 3.10.1软件构建药物-活性成分-靶点-疾病网络图。

1.4.3 靶点蛋白-蛋白相互作用网络

将交集靶点上传至String数据库（https://cn.string-db.org/），设置物种为“Homosapiens”，其他均为默认条件，得到蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络并导入Cytoscape 3.10.1软件中，通过Centiscape 2.2插件进行核心靶点的筛选。以插件中的“度（degree）”值进行筛选，最终得到核心靶点。将核心靶点导入到String数据库中，默认条件，再将得到的网络图导入Cytoscape 3.10.1软件进行可视化中，得到核心靶点PPI网络图。

1.4.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

将“1.4.3”项下最终筛选得到的核心靶点上传至DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）数据库（https://david.ncifcrf.gov/），设置相关参数：物种选择为“Homosapiens”，列表类型设置为“Genelist”，设置SELECT identifier为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。GO和KEGG分析分别选择P值排名前10和前20的结果，通过微生信平台进行可视化。

1.4.5 活性成分与靶点蛋白的分子对接

从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的结构文件，蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB，https://www.rcsb.org/）下载degree值前10的关键靶点的蛋白3D结构文件，通过AutoDock Tools 1.5.6处理并保存为pdbqt文件。使用AutoDock Vina 1.1.2将配体与受体进行分子对接，计算活性成分与靶点蛋白的最低结合效能，在PyMol软件中对结果进行可视化。

1.4.6 动物实验验证

①茅苍术醇提物的制备与给药剂量换算。将100 g生茅苍术饮片粉碎，过2号筛，用10倍体积的80%乙醇浸泡过夜；第2天将浸泡后的样品超声（功率：400 W）提取3次，每次2  h，过滤，合并滤液；滤液在旋转蒸发器中浓缩；真空干燥，称重，计算醇提物得率 [17]。《中国药典（2020版）》中茅苍术的临床用量为3~9  g，9  g为60 kg的成人剂量，每日用量为150 mg/kg，故计算得小鼠的等效剂量为150  mg/ kg×12.3=1 845 mg/kg；因茅苍术80%乙醇提取物得率为32.57%，计算得茅苍术给药剂量为1 845 mg/ kg×32.57%≈601 mg/kg。

②动物分组、造模及给药。将30只C57BL/6小鼠随机分为3组：假手术组、模型组、茅苍术组（601 mg/kg），每组10只。其中模型组和茅苍术组小鼠进行胆总管结扎术，采用苯巴比妥对小鼠进行腹腔麻醉，沿小鼠腹中线剪开后，用不可吸收的外科缝线双重结扎胆管，全程均采用无菌器械；假手术组小鼠除结扎胆管外，其余步骤同上[18]。将茅苍术醇提物溶于生理盐水，按1  mL/100 g予以茅苍术组小鼠灌胃，1次/d，连续2周；假手术组和模型组小鼠予以同体积的双蒸水灌胃。

③免疫器官指数检测。小鼠造模后第14天，称量体重，处死后分别摘取肝脏、脾脏和胸腺，用磷酸盐缓冲液冲洗后吸干，用天平称量湿重，计算免疫器官指数，包括肝脏指数、脾脏指数和胸脾指数。计算公式为：免疫器官指数（%）=器官湿重/体重×100%。

④血清学指标检测。小鼠摘除眼球取血约0.5  mL，4 ℃静置过夜后，754.65×g离心10  min，取上清100 µL，按试剂盒说明书测定血清中ALT和AST活性。

⑤肝组织病理学观察。小鼠肝脏经4%多聚甲醛固定24 h后，进行常规石蜡包埋，切片机切取4 µm薄片，进行HE、Masson和天狼星红染色后，于显微镜下观察肝细胞变性坏死情况、炎症程度、肝脏组织结构和胶原纤维增生情况。使用Ishak评分系统评定HE染色后肝组织纤维化分期情况。

⑥qRT-PCR检测肝组织中α-SMA、COL1A1和ⅠⅤ型胶原α₂的mRNA水平。取小鼠肝组织50 mg于1.5 mL的无酶EP管中，使用TRIzol试剂提取总RNA，并在无RNA酶的条件下使用带有基因组DNA清除剂的逆转录试剂盒将逆转录为cDNA。引物序列如表1所示，利用SYBR qPCR检测基因扩增量，PCR循环过程为：95 ℃ 1 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 45 s、95 ℃ 1 min。以β-actin作为内参基因，采用2^-△△CT法计算肝组织中α-SMA、COL1A1和IV型胶原α₂（recombinant collagentype IV alpha 2，COL4A2）的mRNA水平。

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  表格1 引物序列

  Table 1.Primer sequences

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⑦Western Blot法检测肝组织中α-SMA和COL1A1蛋白水平。称取30 mg冻存的肝脏组织，按1 : 9加入裂解液，混匀后在4 ℃条件下12 074.4×g离心10  min，分离得到肝组织总蛋白上清液；加入上样缓冲液，金属浴加热得到蛋白样品；蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，加入含5%脱脂奶粉的TBST（含吐温20的Tris缓冲盐水）封闭2 h，一抗（稀释比例1 : 1 000）置于4 ℃冰箱过夜孵育，洗净后用二抗（稀释比例1 : 5 000）室温孵育1 h，加入ECL化学发光试剂显影，采用ImageJ图像软件进行灰度值分析。

1.5 统计学分析

用SPSS 22.0进行统计分析，数据以表示，多组比较应采用方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 核心靶点预测结果

从数据库获得并汇总去重的苍术素、白术内酯I、Ⅱ和Ⅲ潜在靶点共91个；肝纤维化相关靶点共9 295个，两者的交集靶点74个。韦恩图见图1A，药物-成分-靶点-疾病网络图见图 1B。

经dgree值筛选出茅苍术治疗肝纤维化核心靶点70个，PPI核心靶点网络图见图1C，颜色越深、形状越大，其dgree值则越大。dgree值排名前20的关键靶点信息见表2，IL-1β、PPARG、MAPK1、PARP1等为排名靠前的靶点。

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  图1 靶点交集的选择以及网络图的构建

  Figure 1.Selection of target inter section and construction of network diagram

  注：A.交集靶点韦恩图；B.“药物-成分-靶点-疾病”网络图；C.PPI核心靶点网络图。

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  表格2 核心靶点信息

  Table 2.Information of core targets

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2.2 富集分析结果

GO功能富集分析得到342个富集条目，包括236个生物过程、47个细胞组成和59个分子功能（图2A）。其中，生物过程主要包括RNA转录的正向调节、RNA转录的正向调节、对外源性刺激的反应、蛋白质水解代谢等过程；细胞组成主要涉及细胞内溶质、细胞核、细胞质、神经元胞体、内质网膜等组分；分子功能主要涉及细胞膜内外信号传导、胆碱受体的结合、酶的结合等功能。KEGG通路分析得到茅苍术抗肝纤维化的重要相关信号通路共55条（图2B）。在KEGG通路富集结果中，排除无关的广谱通路，发现茅苍术治疗肝纤维化的主要信号通路涉及表皮生长因子受体信号通路（epidermal growth factor receptor，EGFR) 、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路（phosphatidylinositol 3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt）等。提示茅苍术可能是通过参与细胞增殖、细胞凋亡及肿瘤生长相关基因的调控，减轻炎症，增强脂质代谢等途径来发挥缓解肝纤维化作用。

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  图2 富集分析结果

  Figure 2.Enrichment analysis results

  注：A.GO功能富集分析柱状图；B.KEGG通路分析气泡图；BP.生物过程；CC.细胞组成；MF.分子功能。

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2.3 分子对接验证结果

对接结果绝对值均＞4.255 kcal/mol，与核心靶点结合活性较好，其中茅苍术这4个活性成分与IL-1β和MAPK1两个靶点均具有很好的结合能力（＜-5.0 kcal/mol），提示茅苍术发挥肝功能保护作用可能与抑制炎症因子的释放有关。分子对接结果见表3，对接结果热图和示例图见图3。

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  表格3 分子对接结果

  Table 3.Molecular docking results

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  图3 分子对接示例及分子对接结果热图

  Figure 3.Molecular docking example and molecular docking results heat map

  注：A.有效成分与核心蛋白对接结果示例图；B.有效成分与核心蛋白对接结果热图。

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2.4 动物实验结果

2.4.1 茅苍术对肝纤维化小鼠相关免疫器官的影响

造模两周后，相较于假手术组，模型组肝脏指数、脾脏指数均明显升高，胸腺指数明显降低（P＜0.05）；相较于模型组，茅苍术给药组均明显下调肝脏指数、脾脏指数，上调胸腺指数（P＜0.05）。具体见图4。

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  图4 茅苍术缓解肝纤维化小鼠脏器指数的异常变化（n=10）

  Figure 4.Atractylodes lancea alleviated the abnormal changes of organ index in mice with liver fibrosis (n=10)

  注：A. 肝脏指数；B. 胸腺指数；C. 脾脏指数；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

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2.4.2 茅苍术对纤维化小鼠肝脏病理状况的影响

如图5A和图5B所示，与假手术组比较，胆管结扎模型组小鼠血清中ALT和AST活性均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，茅苍术给药组小鼠血清中ALT和AST活性均显著降低（P＜0.01）。结果表明给与茅苍术后对胆管结扎诱导的小鼠肝损伤有保护作用。

如图5C所示，假手术组肝脏表面光滑红润有弹性；与假手术组相比，模型组肝脏体积变大，表面粗糙，弹性较差；而茅苍术给药组肝脏颜色、光泽和质地均有明显改善。

图5D中HE染色结果显示，假手术组肝细胞形态正常，肝小叶结构完整，门静脉周围无炎症细胞浸润，无纤维间隔；与假手术组相比，模型组可见肝小叶结构紊乱，肝细胞变性坏死，出现炎性细胞浸润，有明显4条纤维间隔；与模型组相比，茅苍术给药组肝小叶排列尚齐整，炎性细胞浸润明显减少，有1条纤维间隔。Masson及天狼星红染色结果显示，与假手术组相比，模型纤维组织增生明显；茅苍术给药组纤维组织增生显著减少。图5E为Ishak评分系统对肝纤维化分期统计结果，图5F和图5G分别为Masson和天狼星红染色胶原纤维面积的统计结果，该结果与染色结果一致，提示茅苍术可有效改善纤维化小鼠的肝脏病理损伤和胶原沉积。

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  图5 茅苍术减轻胆管结扎小鼠肝脏病理损伤（n=10）

  Figure 5.Atractylodes lancea reduced liver pathological damage in mice with bile duct ligation (n=10)

  注：A.血清中AST活性；B.血清中ALT活性；C.小鼠肝脏形态；D.肝组织HE、Masson、天狼星红染色图；E.Ishak评分系统对肝纤维化分期统计结果；F.肝组织Masson染色阳性面积量化统计结果；G.天狼星红染色阳性面积量化统计结果；与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

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2.4.3 茅苍术对胆管结扎小鼠肝纤维化的影响

如图6A~C所示，qRT-PCR结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠肝组织α-SMA、COL1A1和COL4A2的mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，茅苍术给药组小鼠肝组织α-SMA、COL1A1和COL4A2的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05）。

如图6D~F所示，Western Blot结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠肝组织α-SMA和COL1A1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，茅苍术给药组肝组织α-SMA和COL1A1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。

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  图6 茅苍术改善胆管结扎小鼠肝纤维化

  Figure 6.Atractylodes lancea improved liver fibrosis in mice with bile duct ligation

  注：A. COL1A1 mRNA表达；B. α-SMA mRNA表达；C. COL4A2 mRNA表达；D. COL1A和α-SMA的蛋白条带图；E. COL1A1蛋白表达；F.  α-SMA蛋白表达；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较：bP＜0.05。

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3 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病的病理基础，是肝脏细胞发生炎症进而发生的创伤修复反应，纤维组织过度沉积的过程[19-20]。胆管结扎是较经典的肝纤维化手术模型，具有时间短、操作简便、肝损伤明显等特点[21]。本研究通过胆总管结扎术成功构建小鼠肝纤维化模型。通过肝脏病理切片观察发现，术后小鼠肝细胞大量坏死，肝小叶结构紊乱，汇管区静脉和中央静脉周围均可见大量胶原纤维生成。脏器指数是反映动物机能生长状态的重要指标，对体内肝脏病理状态及肝纤化的发展状态具有重要的参考意义。在胆管结扎肝纤维化小鼠中，因胆管阻塞，流入肝脏的血流受阻，会导致肝脏体积增大，且血流受阻也会影响流向脾脏的血流进而引起脾肿大[22-23]，故本课题组将小鼠肝脏指数、胸腺指数与脾脏指数作为检测指标。结果发现与假手术组相比，模型组胸腺指数明显降低，肝脏、脾脏指数均明显升高，这说明造模后小鼠免疫功能紊乱，肝肿大且有炎症；与模型组相比，给与茅苍术后，胸腺、肝脏、脾脏指数均显著回调，表明给药后小鼠免疫功能紊乱及炎症的病理状态有所缓解。

当肝脏持续受到损伤时，肝脏内的肝星状细胞（HSC）会被激活，表达α-SMA并合成胶原，生成过多的细胞外基质，参与肝纤维化的形成。α-SMA的表达情况不仅能反映HSCs的活化程度，还能在一定程度上用于判断病情及预后[24]。为探明茅苍术醇提物对肝纤维化小鼠HSCs活化的抑制作用，本课题组通过qRT-PCR、Western Blot法检测HSCs活化的重要指标α-SMA和胶原的表达水平。结果发现给与茅苍术后，模型组升高的α-SMA和胶原表达水平受到明显抑制，提示茅苍术醇提物可通过抑制HSC活化与胶原的生成，进而减轻肝纤维化。

本课题组通过前期研究发现，茅苍术的有效成分具有改善肝损伤、降低肝脏炎症缓解肝纤维化等作用，但具体的作用机制尚不明确。本文在此基础上，首先采用网络药理学及分子对接的方法对茅苍术缓解肝纤维化的关键活性成分和核心靶点进行了预测分析，结果显示茅苍术4种关键核心成分与IL-1β、MAPK1、PPARG、PARP1等核心靶点之间的结合具有稳定的构象。研究发现，PPARG的信号转导会增加非酒精性脂肪性肝炎肝脏炎症及纤维化解离，加重纤维化的发展[25]。而MAPK1的磷酸化则会增加COL1A1的表达，使胶原沉积加剧；抑制MAPK1的磷酸化可减轻胶原沉积进而减轻肝纤维化[26]。而抑制PARP1活化则被证实可减轻小鼠脂肪肝中的脂质积累和炎症，使肝纤维化病情好转，提示茅苍术缓解肝纤维化可能与靶向IL-1β、MAPK1等相关炎症因子有关[27-28]。中药化学成分复杂、药理作用广泛，具有多靶点、多途径、多层次的特点。运用网络药理学可快速、全面地阐释中药作用机制，发现中药药效物质活性组合物，为新药的发现与研究提供新思路。

综上，本研究通过网络药理学、分子对接和动物实验等方法初步证实了茅苍术可有效改善肝纤维化小鼠的肝损伤与纤维化，其作用机制可能与抑制IL-1β、MMP-2以及MMP-9等炎性介质的高表达、调控PI3K/Akt信号通路有关。为临床应用茅苍术等燥湿健脾类中药改善肝纤维化提供了一定的理论参考和实验依据。本研究也存在一些局限性：①仅选取601 mg/kg单一剂量进行药效验证；②胆管结扎肝纤维化小鼠模型不够全面，肝纤维化造模比较的经典的方法是四氯化碳法，另外还有二甲基亚砜法、硫代乙酰胺法、高脂高糖饮食法等，不同的诱导剂和方法可以建立多种类型的纤维化模型，而本文仅探究了胆汁淤积型肝纤维化模型；③本研究暂未在体内外实验中对KEGG通路分析得到相关通路进行验证，未来将继续对其通路机制进行深入探究。

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