目的  建立同时测定蒙药清肝玛努-4醇提物中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷、甘草酸铵等成分的HPLC含量测定方法及指纹图谱研究。

方法   采用Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm（芍药苷、牡荆素、甘草苷）、237 nm（马钱苷酸）、250 nm（甘草酸铵）、270 nm（龙胆苦苷），柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

结果  蒙药清肝玛努-4醇提物中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵的质量浓度分别在0.020 3~0.121 0、0.053 3~0.317 7、0.021 3~0.127 0、0.011 5~0.069 0、0.014 1~0.083 8和0.035 1~0.209 1 mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系（r≥0.999 8），平均回收率分别为94.75%、99.49%、92.32%、95.82%、101.29%和98.04%，RSD分别为1.11%、0.76%、0.99%、2.75%、1.09%和2.43%（n=6）。建立了蒙药清肝玛努-4醇提物的HPLC指纹图谱，以S1号样品色谱图为参照图谱，通过多点校正和全谱峰匹配，生成对照指纹图谱，共确定10个共有峰，经与对照品比对指认了其中8个成分。

结论  所建立的测定方法及指纹图谱准确、可靠、重复性好、专属性强，为蒙药清肝玛努-4的质量控制及后续开发提供了依据。

清肝玛努-4汤为蒙医师娜仁朝克图老师的临床常用验方，具有较好的肝保护作用，由甘草、龙胆、山奈及白芍（1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）4味蒙药组成。蒙医学认为，甘草具有止咳润肺、滋补、解毒等功效，可用于治疗肺痨，肺热咳嗽，各种中毒以及胃肠“宝如”病[1]；龙胆具有清热燥湿、泻肝胆火、保肝、调节胃肠功能等作用[2]；山奈具有祛“巴达干赫依”、助胃火、稀血等功效[3]；白芍具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳等作用[4]。

甘草的主要成分是以甘草苷为代表的黄酮及以甘草酸为代表的皂苷类成分[5-6]。龙胆含有环烯醚萜类、三萜类、黄酮类等化学成分[2, 7-8]，其中环烯醚萜类是其主要活性成分，例如龙胆苦苷、獐芽菜苦苷和马钱苷酸等。山奈含有挥发油、黄酮类、香豆素类成分[9]，挥发油中主要成分为反式对甲氧基桂皮酸乙酯和龙脑等。黄酮类成分中主要含有山奈酚与山奈素[10]。白芍的主要成分是以芍药苷和芍药内酯苷为代表的单萜及苷类成分[11]。

根据研究报告显示：甘草苷、甘草酸铵、龙胆苦苷和芍药苷对免疫性肝损伤、药物性肝损伤和酒精性肝损伤等疾病具有一定的保肝作用[2, 12- 18]。因此，本文针对以上各单药中保肝指标性成分，采用HPLC法同时测定蒙药清肝玛努-4醇提物中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷、甘草酸铵的含量并建立其指纹图谱，为蒙药清肝玛努-4的后续开发和质量标准研究提供基础。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（包括1260 Infinity Ⅱ VWD型检测器）和AL204型电子分析天平（美国Mettler-Toledo公司）；KQ-250型超声波清洗机（巩义予华仪器有限责任公司）；Genie G10型超纯水制备仪（内蒙古京鼎元业科技有限公司）；HH-S11.4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：马钱苷酸（批号：111865-201403，纯度94.7%）、龙胆苦苷（批号：110770-202219，纯度98.1%）、芍药苷（批号：110736-202246，纯度96.7%）、牡荆素（批号：111687-202105，纯度99.1%）、甘草苷（批号：111610-202209，纯度95.2%）、甘草酸铵（批号：110731-202122，纯度94.4%）均购自中国食品药品检定研究院；蒙药清肝玛努-4醇提物（实验室自制，批号：20230603，甘草、龙胆、山奈、白芍比例为1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）；甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为实验室自制蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 HPLC法同时测定蒙药清肝玛努-4醇提物中6种成分的含量

2.1.1 蒙药清肝玛努-4醇提物的制备

称取蒙药清肝玛努-4生粉（过60目筛）200 g，加入5倍量的80%乙醇溶液，回流提取3 h，过滤，滤液在85 ℃恒温水浴锅上蒸干 [19]，得蒙药清肝玛努-4醇提物（34.6 g，得率为17.3%）。

2.1.2 色谱条件

采用Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（250  mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1），流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；波长：230、237、250、270 nm；进样体积：10 μL[20-22]。

• 
  表格1 梯度洗脱程序

  Table 1.Gradient elution procedures

  

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取蒙药清肝玛努-4醇提取物0.045 2 g，置于10 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声（功率：600 W，频率：40 kHz）处理30 min，放凉，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 对照品溶液的制备

精密称取对照品马钱苷酸（12.10 mg）、龙胆苦苷（10.59 mg）、牡荆素（13.80 mg）分别置于10 mL 量瓶中，芍药苷（15.87 mg）、甘草苷（20.97  mg）、甘草酸铵（26.14 mg）分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为1.20、1.06、1.38、0.63、0.84、1.05 mg/mL的对照品储备液；精密吸取6种成分的对照品储备液适量，置于10 mL量瓶中，配制成每1 mL含马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵分别为0.121 0、0.317 7、0.127  0、0.069 0、0.083 8、0.209 1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.5 系统适用性试验

取空白溶液（甲醇）、供试品溶液、混合对照品溶液各10 μL，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。由图可知，在混合对照品溶液和供试品溶液色谱图上有相同保留时间的色谱峰，各成分分离度均大于1.5，空白溶液对测定无干扰，表明该方法专属性良好。

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  图1 蒙药清肝玛努-4醇提物的HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms of Mongolian medicine Qinggan Manu-4 alcohol extract

  注：A. 空白溶液；B. 混合对照品溶液；C. 供试品溶液；1. 马钱苷酸（237 nm）；2. 龙胆苦苷（270 nm）；3. 芍药苷（230 nm）；4. 牡荆素（230 nm）；5. 甘草苷（230 nm）；6. 甘草酸铵（250 nm）。

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2.1.6 线性关系考察

取混合对照品溶液适量，用甲醇依次稀释1.25、1.5、2、2.5、3、6倍后精密吸取10 μL，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以对照品浓度（X，mg/mL）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，各成分线性回归方程及线性范围见表2。

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  表格2 蒙药清肝玛努-4醇提物中6种成分的线性关系

  Table 2.Linear relationship of six components in Mongolian medicine Qinggan Manu-4 alcohol extract

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2.1.7 精密度试验

取混合对照品溶液适量，按“2.1.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.47%、0.26%、0.44%、0.28%、0.29%和0.91%（n=6），均＜2.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验

将供试品溶液分别于0、2、4、8、10、12  h时按“2.1.2”项下色谱条件进样测定。结果得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.79%、1.23%、1.25%、2.18%、1.70%和1.79%（n=6），均＜2.2%，表明供试品溶液制备后12 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验

取同一批蒙药清肝玛努-4供试品约0.045  0  g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录各峰面积，计算蒙药清肝玛努-4醇提物中6个成分含量及其RSD。结果马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵含量的平均值分别为8.424 5、59.697 5、23.269 3、4.213 3、6.651 6和26.088 5 mg/g，RSD分别为1.80%、1.68%、2.33%、2.37%、1.65%和0.72%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验

取清肝玛努-4供试品约0.022 0 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别加入“2.1.4”项下配制的混合对照品溶液2 ml，按“2.1.2”项下色谱条件下进样测定，记录各峰面积。结果计算得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、牡荆素、甘草苷和甘草酸铵的加样回收率分别为94.75%、99.49%、92.32%、95.82%、101.29%和98.04%，RSD分别为1.11%、0.76%、0.99%、2.75%、1.09%和2.43%（n=6），表明该方法准确性良好。

2.1.11 样品含量测定

取3批蒙药清肝玛努-4样品（醇提物），按“2.1.3”项下方法平行制备3批供试品溶液，并按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入标准曲线计算样品含量，结果见表3。

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  表格3 蒙药清肝玛努-4醇提物中6种成分的含量测定结果（mg/g，n=3）

  Table 3.Content determination results of six components in Mongolian medicine Qinggan Manu-4 alcohol extract (mg/g, n=3)

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2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 蒙药清肝玛努-4醇提物的制备

同“2.1.1”项制备10批醇提物。

2.2.2 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（250  mm×4.6  mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表4），流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；波长：237  nm；进样体积：10 μL[23]。

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  表格4 梯度洗脱程序

  Table 4.Gradient elution procedures

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2.2.3 供试品溶液的制备

按“2.1.3”项下方法制备10批供试品溶液。

2.2.4 混合对照品溶液的制备

精密量取马钱苷酸（1.21 mg/mL）、獐芽菜苦苷（0.78 mg/mL）、龙胆苦苷（1.05 mg/mL）、芍药苷（1.38 mg/mL）、牡荆素（0.63 mg/mL）、甘草苷（0.83 mg/mL）、山奈酚（0.95 mg/mL）、甘草酸铵（1.04 mg/mL）对照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

取10批蒙药清肝玛努-4醇提物供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，得到10批样品的色谱图，将数据依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行分析，以S1号样品色谱图为参照图谱，通过多点校正和全谱峰匹配，生成对照指纹图谱，共指认10个共有峰，具体见图2。

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  图2 10批蒙药清肝玛努-4样品的HPLC指纹图谱

  Figure 2.HPLC fingerprint spectrum of 10 batches of Qinggan Manu-4

  

2.2.6 色谱峰的指认及相对峰面积的计算

精密量取“2.1.3”项下的供试品溶液和“2.2.4”项下的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定。将供试品色谱图与对照指纹图谱（图3）对比确定：1号峰为马钱苷酸、2号峰为獐芽菜苦苷、3号峰为龙胆苦苷、5号峰为芍药苷、6号峰为牡荆素、7号峰为甘草苷、9号峰为山奈酚、10号峰为甘草酸铵。其中3号龙胆苦苷的色谱峰分离度及峰形较好，因此选作参照（S）峰，得到各共有峰相对峰面积RSD为0.94%～6.90%。表明各批次间样品化学成分差异不明显，质量稳定可控，结果见表5。

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  图3 蒙药清肝玛努-4的对照HPLC色谱图

  Figure 3.Reference HPLC chromatograms of Mongolian medicine Qinggan Manu-4 alcohol extract

  注：A. 混合对照品溶液；B. 供试品溶液；1. 马钱苷酸；2. 獐芽菜苦苷；3. 龙胆苦苷；5. 芍药苷；6. 牡荆素；7. 甘草苷；9. 山奈酚；10. 甘草酸铵。

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  表格5 10批清肝玛努-4共有峰的相对峰面积

  Table 5.The relative peak area of the shared peaks of 10 batches of Qinggan Manu-4

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3 讨论

3.1 流动相的选择

由于蒙药清肝玛努-4的化学成分复杂，待测成分色谱峰存在拖尾现象，根据参考文献[20-22]，试验对比了0.1%磷酸水溶液-甲醇、0.1%磷酸水溶液-乙腈几种不同流动相，结果以0.1%磷酸水溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱时分离效果较好，出峰稳定且峰形尖锐，故选择0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱。

3.2 波长的选择

通过参考文献[23-25]，采用DAD检测器分别对6种成分进行光谱扫描（190~400 nm）。选择各成分的最大吸收波长，分别是230 nm（芍药苷、牡荆素、甘草苷）、237 nm（马钱苷酸）、250  nm（甘草酸铵）、270 nm（龙胆苦苷）。指纹图谱的检测波长建立在237 nm处的色谱峰分离度较好，响应值均最佳。

3.3 含量测定与指纹图谱结果分析

本研究通过测定蒙药清肝玛努-4醇提物中6种成分，发现其平均含量分别为8.230 6、58.109 7、22.507 5、4.082 6、6.452 5、25.356 3 mg/g，且稳定性、精密度、回收率[26]均符合相关规定。同时建立了蒙药清肝玛努-4醇提物HPLC指纹图谱，共确定10个共有峰，指认了其中8个成分。且各批次样品所含化学成分种类基本一致，有较好的均一性及重复性。

综上所述，本研究采用HPLC法，以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，建立了能同时测定清肝玛努-4醇提物中6种成分的方法及指纹图谱，经方法学验证，该方法简便、结果准确、重复性好，可为蒙药清肝玛努-4质量控制提供方法学参考。

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