目的  基于网络药理学和指纹图谱，筛选温经止痛合剂质量指标成分，建立薄层鉴别和含量测定方法，为评价温经止痛合剂的质量提供依据。

方法  构建“温经止痛合剂饮片-主要活性成分-靶点” 图，筛选用于质量控制的主要饮片和成分；采用TLC法对其进行定性分析；用HPLC 法建立温经止痛合剂的指纹图谱，标定共有峰并进行相似度评价，并对确认的成分进行含量测定。

结果  通过温经止痛合剂“饮片-主要活性成分-靶点” 图，筛选出甘草、蒲黄、吴茱萸、乌药、延胡索、赤芍为主要活性成分饮片。赤芍、吴茱萸、延胡索的TCL鉴别结果分离度好、专属性强；指纹图谱指认了5个共有峰，并以去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵建立了温经止痛合剂含量测定的质量标准。

结论  基于网络药理学和指纹图谱，建立了TLC定性分析和HPLC含量测定方法，该法准确可靠，重复性好，可用于温经止痛合剂的质量控制。

温经止痛合剂来源于武汉市中医医院妇科黄艳辉主任的临床经验方，该制剂处方由当归、桂枝、乌药、莪术、赤芍、延胡索、甘草、三棱、吴茱萸等12味饮片组成[1]，系由当归四逆加吴茱萸生姜汤化裁而来。方中当归补血养血通脉，桂枝温经散寒、温通血脉，两者温通经脉，为君药。蒲黄可活血散瘀止痛，三棱、莪术破血祛瘀，三药合用消积止痛，相须配伍，为臣药。延胡索、炮姜、乌药、吴茱萸温经散寒、行气止痛，赤芍行瘀止痛、清热凉血以制上述诸药温燥之性，合为佐药。炙甘草调和中土，补中健脾，益气养血，防桂枝、吴萸等药燥烈太过而伤及阴血，并调和药性解毒，为佐使药。通草通经活血为使药。诸药合用，共凑养血温经散寒止痛之功，温、补、通、清并用，温中有补，补中兼行，扶正驱邪，使阳气旺，寒邪散，营血充，血脉通，正合阳虚血弱，寒凝血瘀之病机。该方具有温经散寒、养血和营、化瘀止痛的功效，用于血虚寒凝型的子宫内膜异位症、痛经的治疗，在缓解痛经及盆腔疼痛、调整月经周期、改善患者血瘀的临床体征等方面疗效显著[2]。前期研究表明，温经止痛方可通过多种途径发挥对子宫内膜异位症的治疗作用[2-4]。目前该方制备的温经止痛合剂，尚无用于质量控制的质量标准。

中药通常含有多种成分，多成分对多靶点的作用网络复杂，近些年，网络药理学和中药指纹图谱技术被用来研究中药的主要质量标志物和药理作用[5-8]，为解决中药复杂成分配伍带来的难题提供了思路。本研究通过网络药理学，筛选温经止痛合剂中的主要活性成分，结合指纹图谱分析，初步确定温经止痛合剂中适于制剂质量控制的饮片和成分；采用TLC法对赤芍、延胡索、吴茱萸进行定性鉴别，HPLC测定温经止痛合剂中去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的含量，为温经止痛合剂的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity Arc 2998高效液相色谱仪，包括Empower色谱工作站（美国沃特世公司）；TLC Scanner 4薄层扫描仪（瑞士卡玛公司）；AL104万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；AUW-120D十万分之一电子天平（日本岛津公司）。

1.2 试药

对照品：芍药苷（批号：110773-201915，纯度98.5%）、延胡索乙素（批号：110726-201919，纯度96.3%）、吴茱萸碱（批号：110802-201710，纯度95.9%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度97.8%）、甘草苷（批号111610-201607，纯度98.3%）、香蒲新苷（批号：111573-201806，纯度99.0%）、异鼠李素-O-新橙皮苷（批号：111571-201806，纯度99.0%）、去甲异波尔定（批号：111825-201803，纯度98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，氨水、甲酸、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、甲醇等为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为纯化水。

温经止痛合剂由武汉市中医医院药学基地提供，批号：20201203、20201211、20201218，规格：200 mL/瓶，具体中药材来源信息见表1。

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  表格1 温经止痛合剂中药材来源及批号

  Table 1.Sources and lot numbers of medicines in Wenjing Zhitong mixture

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2 方法与结果

2.1 温经止痛合剂的网络药理学分析

2.1.1 温经止痛合剂化合物和靶点的统计

根据中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com）[9]，对温经止痛合剂含有的饮片主要化学成分进行搜索，筛选条件为口服生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18，得到温经止痛合剂中可能的活性化合物。将筛选到的活性化合物对应的靶蛋白，在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行基因名检索[9]，限定物种为人，得到相对应的靶点信息。温经止痛合剂拟主要用于子宫内膜异位症的相关临床治疗，以“子宫内膜异位症（EMs）”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/ ）查找相关基因，并取与“温经止痛合剂”的交集基因。

“温经止痛合剂”中饮片共收集到主要活性成分215个，相关靶点共计154个，活性成分-靶点对共计1 459对，药物与疾病的交集基因共计153个。

2.1.2 温经止痛合剂主要活性化合物和靶点的筛选

将“2.1.1”中温经止痛合剂的饮片、成分、靶点统计的结果导入Cytoscape 3.7.2软件，构建温经止痛合剂的饮片、潜在活性成分和靶蛋白的互作网络，根据度（degree）值、介数（betweenness centrality）和紧密中心度（closeness centrality）筛选主要潜在活性成分和靶点，将饮片-主要成分-靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“温经止痛合剂饮片-主要活性成分-靶点”图，见图1，62个主要潜在成分见表2，主要作用靶点见表3。

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  图1 温经止痛合剂饮片-主要活性成分-靶点图

  Figure 1.The network diagram of "Wenjing Zhitong mixture decoction-major active ingredients-target"

  注：橘色菱形代表中药饮片；绿色长方形代表主要活性成分；蓝色椭圆形代表主要潜在作用靶点

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  表格2 温经止痛合剂中主要活性化合物

  Table 2.Most potential bioactive components in Wenjing Zhitong mixture

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  表格3 温经止痛合剂主要潜在作用靶点

  Table 3.Most potential targets mediated by Wenjing Zhitong mixture

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表2为温经止痛合剂的主要活性成分及来源饮片，其中潜在活性成分可能有50个源于甘草、7个源于延胡索、5个源于蒲黄、4个源于吴茱萸、4个源于乌药、3个源于赤芍、3个源于三棱、2个源于炮姜、2个源于当归、1个源于桂枝，其他饮片的主要活性成分数量为0。表3为温经止痛合剂中主要活性成分作用的核心靶点。中药通常作用于机体的多个靶点而发挥对疾病的治疗作用，饮片中化合物与靶点的degree值越大，代表在治疗中发挥的作用越重要。根据主要成分degree值计算不同饮片的总degree值，如图2所示，总degree值排名前6位的饮片是甘草、蒲黄、吴茱萸、乌药、延胡索、赤芍，因此，在进行质量标准研究时，应优先考虑对甘草、蒲黄、吴茱萸、乌药、延胡索、赤芍进行研究，制定合理的质量标准，用于温经止痛合剂的质量控制。

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  图2 温经止痛处方中不同饮片对应的化合物与靶点的累计degree值分布

  Figure 2.Distribution of cumulative degree from compounds and targets corresponding to various traditional Chinese medicine in Wenjing Zhitong mixture

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2.2 温经止痛合剂的指纹图谱分析

2.2.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱：Waters X Bridge C₁₈柱（100 mm×3.0 mm，2.5 μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），按表4程序进行梯度洗脱；检测波长：254 nm；流速：0.4 mL·min^-1；进样量：2 μL。

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  表格4 指纹图谱分析的梯度洗脱程序

  Table 4.Programs for gradient elution of fingerprint analysis

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2.2.2 溶液的制备

分别随机抽取各批次温经止痛合剂各6瓶，精密量取10 mL，加水定容至100 mL，过0.45 μm微孔滤膜，分别作为供试品溶液S1~S6（批号：20201218）、S7~S12 （批号：20201211）、S13~S18（批号：20201203）。按照温经止痛合剂处方，随机选取表1中不同厂家、批次的饮片，按照温经止痛合剂的制备工艺制备样品，分别精密量取10 mL于100 mL量瓶中并用水定容至刻度，过滤膜，作为供试品溶液S19~S54。

取对照品芍药苷4.77 mg、香蒲新苷1.24 mg、甘草苷0.66 mg、异鼠李素-3-O-新橙皮苷2.11 mg、甘草酸铵1.33 mg，加80%甲醇溶解并定容至100 mL，过滤得对照品溶液。以80%甲醇溶液作为空白溶液。

2.2.3 指纹图谱的建立

将“2.2.2”项下制备的54份供试品溶液按照“2.2.1”项下色谱条件进样分析，将供试品溶液的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），以S1为参照，经多点校正和自动匹配后，生成指纹图谱和对照指纹图谱R，并计算供试品间相似度。共计标定了21个共有峰，并通过与对照品比对，指认峰11为芍药苷，峰12为香蒲新苷，峰13为甘草苷，峰15为异鼠李素-3-O-新橙皮苷，峰20为甘草酸铵。见图3和图4。

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  图3 温经止痛合剂指纹图谱

  Figure 3.Fingerprints of Wenjing Zhitong mixture

  注：S1~S54为温经止痛合剂供试品；R为生成的对照指纹图谱

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  图4 HPLC特征峰色谱图

  Figure 4.HPLC characteristic peak chromatogram

  注：A.空白溶液；B.对照品；C.供试品（批号：20201218）；11.芍药苷；12.香蒲新苷；13.甘草苷；15.异鼠李素-3-O-新橙皮苷；20.甘草酸铵

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2.2.4 相似度分析

以生成的对照指纹图谱为标准，计算54个样品的相似度，结果见表5，54个样品相似度在0.820~0.951范围内，表明在同一生产工艺的条件下，不同厂家、批次的饮片生产的温经止痛合剂的指纹图谱相对稳定。对各样品中共有峰的相对峰面积进行分析，计算各共有峰RSD值，见图5。结果表明，共有峰中相对峰面积大于5.0%的峰依次分别为峰16（15.93%）、峰20（10.37%）、峰12（9.53%）、峰15（7.90%）、峰5（7.89%）、峰6（6.45%）、峰1（6.29%）和峰11（5.67%），但由于饮片来自不同厂家、批次，造成温经止痛合剂样品中这几种成分含量的RSD值较大，不利于温经止痛合剂制剂质量的相对稳定性评价。综合考虑色谱峰指认、峰面积和不同处理之间峰面积RSD值等因素，优先选择对峰11和峰20进行含量测定。

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  表格5 温经止痛样品指纹图谱相似度

  Table 5.Similarity of fingerprints of Wenjing Zhitong mixture

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  图5 指纹图谱共有峰相对峰面积

  Figure 5.Relative peak areas of common peaks based on fingerprints

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2.3 TCL鉴别

2.3.1 赤芍

取温经止痛合剂50 mL，用正丁醇萃取2次，每次50 mL，合并正丁醇液[4]，水洗2次[10]，每次50 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。按温经止痛合剂制备工艺制备缺赤芍的阴性样品，取缺赤芍的阴性样品50 mL，同法制备阴性对照溶液。参照薄层色谱法（中国药典2020版四部通则0502）试验[11]，吸取上述溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40 ∶ 5 ∶ 10 ∶ 0.2）的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点清晰，在日光下检视。供试品色谱中，与对照品相应位置上显相同颜色的蓝紫色斑点，阴性对照无干扰，结果见图6。

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  图6 赤芍薄层鉴别色谱图

  Figure 6.TLC analysis of Paeoniae Radix Rubra

  注：1~3.供试品（批号：20201203、20201211、20201218）；4.芍药苷对照品；5.缺赤芍阴性样品

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2.3.2 吴茱萸和延胡索

取温经止痛合剂100 mL，用甲酸调pH至酸性，乙酸乙酯萃取2次，每次100 mL，水层用氨水调pH至碱性，乙酸乙酯萃取2次，每次100 mL，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解[12]，作为供试品溶液。取吴茱萸碱和延胡索乙素对照品，加乙醇溶解，制备成每1 mL含吴茱萸碱1.5 mg、延胡索乙素0.5 mg的对照品溶液。按照温经止痛合剂制备工艺制备缺延胡索和吴茱萸的阴性样品，取缺延胡索和吴茱萸的温经止痛合剂样品100 mL，同法分别制备缺延胡索和吴茱萸的阴性对照溶液。参照薄层色谱法（中国药典2020版4部通则0502）试验[11]，吸取上述溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯-三乙胺（7 ∶ 5 ∶ 0.1）的溶液为展开剂[13]，展开，取出，晾干，碘缸中放置后取出，挥干板上吸附的碘后，置365 nm下检视。供试品色谱中，与对照品延胡索乙素相应位置上，显相同颜色的绿色荧光斑点，阴性对照无干扰；与对照品吴茱萸碱相应位置上，显相同颜色的淡蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图7。

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  图7 吴茱萸和延胡索薄层鉴别色谱图

  Figure 7.TLC analysis of Euodiae Fructus and Corydalis Rhizoma

  注：1~3.供试品（批号：20201203、20201211、20201218）；4.吴茱萸碱和延胡索乙素对照品；5.缺吴茱萸阴性样品；6.缺延胡索阴性样品

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2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱：Waters X Bridge C₁₈柱（100 mm×3.0 mm，2.5 μm）；柱温：35℃；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），按表6程序进行梯度洗脱；检测波长：230 nm（去甲异波尔定和芍药苷）、254 nm（甘草酸铵）；流速：0.4 mL·min^-1；进样量：2 μL。

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  表格6 含量测定的梯度洗脱程序

  Table 6.Programs for gradient elution of content determination

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2.4.2 混合对照品溶液的制备

精密称定去甲异波尔定对照品9.02 mg、芍药苷对照品9.11 mg，分别用甲醇溶解并定容至5 mL；取甘草酸铵7.54 mg，用80%甲醇溶解并定容至5 mL，作为对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，用80%甲醇稀释至5 mL量瓶中，去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的浓度分别为90.20，911.09，150.81 μg·mL^-1，作为混合对照品储备液，并依次吸取1 mL，用80%甲醇定容至5 mL，制备成混合对照品溶液，去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的浓度分别为18.04，182.22，30.16 μg·mL^-1。

2.4.3 供试品溶液的制备

精密量取温经止痛合剂样品10 mL于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。

2.4.4 阴性样品溶液的制备

按温经止痛合剂生产工艺，分别制备缺乌药、赤芍、甘草的阴性样品，按照“2.4.3”项下方法分别制备缺乌药、赤芍、甘草的阴性样品溶液。以80%甲醇为空白溶液。

2.4.5 专属性试验

取空白溶液、混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析。结果如图8和图9所示，在230 nm和254 nm处，空白溶液不干扰去甲异波尔定、芍药苷和甘草酸铵的含量测定。

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  图8 含量测定HPLC色谱图（230 nm）

  Figure 8.HPLC chromatogram of content determination（230 nm）

  注：A.空白溶液；B.混合对照品；C.供试品（批号：20201218）；D.缺赤芍阴性样品；E.缺乌药阴性样品；1. 去甲异波尔定；2.芍药苷；3.甘草酸铵

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  图9 含量测定HPLC色谱图（254 nm）

  Figure 9.HPLC chromatogram of content determination（254 nm）

  注：A.空白溶液；B.混合对照品；C.供试品（批号：20201218）；D.缺甘草阴性样品；1. 去甲异波尔定；2.芍药苷；3.甘草酸铵

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2.4.6 线性、定量限和检测限考察

分别精密吸取“2.4.2”项下混合对照品储备液，稀释成系列标准溶液。按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的峰面积。以对照品浓度（X，μg·mL^-1）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得到3种成分的标准曲线方程。将混合对照品依次稀释不同浓度进样分析，以对照品检测到的信噪比为10计算定量限；以信噪比为3计算检测限。结果见表7。

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  表格7 去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的线性、检测限和定量限结果

  Table 7.Results of linearity, detection limit, and quantification limit of laurolitsine, paeoniflorin and ammonium glycyrrhizate

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2.4.7 精密度考察

取“2.4.2”方法下混合对照品溶液，按“2.4.1”项下方法连续进样6次，记录峰面积，结果去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为2.35%，1.92%，1.08%（n=6），结果表明该方法该仪器精密度良好。

2.4.8 重复性考察

取同一样品，按“2.4.3”项下方法平行配制6份供试品溶液，并按“2.4.1”项下方法进样分析，记录峰面积，计算得样品中去甲异波尔定的平均含量为195.28 μg·mL^-1，RSD为 2.46%（n=6）；芍药苷的平均含量为2 059.63 μg·mL^-1，RSD为0.64%（n=6）；甘草酸铵的的平均含量为391.14 μg·mL^-1，RSD为3.73%（n=6）。结果表明该方法重复性良好。

2.4.9 稳定性考察

取“2.4.3”项下供试品溶液，按照“2.4.1”项下方法，分别在0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h进样分析，记录峰面积，结果去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的RSD分别为0.25%，0.24%，0.21%（n=7）。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.10 加样回收率考察

取“2.4.3”项下供试品溶液，分别加入“2.4.2”项下混合对照品溶液0.6，0.8，1.0 mL，定容至刻度，每份平行操作3次，按照“2.4.1”项下方法进样分析，记录峰面积，计算得去甲异波尔定的平均回收率为101.87%，RSD为1.78%（n=9）；芍药苷的平均回收率为101.11%，RSD为1.20%（n=9）；甘草酸铵的平均回收率为101.09%，RSD为1.58%（n=9）。结果表明该样品回收率良好。

2.4.11 样品含量测定

分别取3批温经止痛合剂，每个批号各3份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4.1”项下方法进样分析，记录峰面积，计算样品中去甲异波尔定、芍药苷、甘草酸铵的平均含量，结果如表8所示。

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  表格8 样品的含量测定结果（μg·mL-1，n=3）

  Table 8.Results of the content determination of the sample (μg·mL-1, n=3)

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3 讨论

中药制剂中君药常被用来控制中药质量，桂枝为温经止痛合剂的君药，但本制剂应用传统工艺制备，煎煮提取过程易致热不稳定、成分易挥发，因此，桂枝中的桂皮醛在成品中含量极低，且批间差异不易控制，不宜选作制剂质量控制指标。本研究采用网络药理学，筛选本制剂中主要质量控制饮片，即甘草、蒲黄、吴茱萸、乌药、延胡索、赤芍，该质量控制饮片中的槲皮素、山奈酚、黄芩素、柚皮素等主要潜在活性成分，可通过作用于ESR1、PTGS2、eNOS3等10个主要靶点，回调异常上调的磷脂酰肌醇3-激酶-苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）等信号通路，发挥对子宫内膜异位症的治疗作用。有研究表明，雌激素可通过作用于ESR1等，激活PI3K-Akt-eNOS信号通路[14]；另有研究表明，干扰血管内皮生长因子（VEGF）或抑制PTGS2等，可延缓子宫内膜异位症的发展进程[15]；PI3K-Akt信号通路可通过介导蛋白磷酸化，升高VEGF的表达 [2]，激活基质金属蛋白酶 2（MMP-2）等，促进子宫内膜间质细胞迁移、侵袭等导致异位症的发生和发展 [16]，目前，这一子宫内膜异位症的病因病机被广泛接受。本课题组前期对PI3K-Akt的研究结果也表明，本方可负调控该信号通路中的VEGF、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、MMP-2等。另外，本研究中治疗靶点蛋白网络也表明，本合剂的作用靶点间存在复杂的相互作用，使得温经止痛合剂治疗子宫内膜异位症和痛经的作用机制复杂多样，机制研究中，信号通路间的协同作用也不应忽视。

在赤芍的TLC鉴别中，正丁醇萃取样品经水洗，可有效减少背景干扰，对吴茱萸和延胡索TLC鉴别中， 365 nm荧光下直接检视，能检出吴茱萸碱淡蓝色荧光斑点，但不能检视出明显的延胡索乙素荧光斑点，碘熏后再在365 nm荧光下检视，可同时检出明显的吴茱萸碱和延胡索乙素斑点。综合考察不同波长下检测到的色谱峰数量，以及主要成分的最大吸收波长，本研究选择在254 nm波长下进行指纹图谱分析，同时在254 nm和230 nm波长下进行甘草酸铵、芍药苷和去甲异波尔定的含量测定。

本文采用网络药理学和指纹图谱方法，用于该方质控饮片和成分的筛选，并进一步建立了本制剂TLC鉴别和含量测定方法，补充了按照传统工艺制备的中药制剂，在质量标准研究中唯君药论的不足，为合理选择中药制剂质量控制指标、制定适宜的中药制剂质量标准提供参考。

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