目的  建立一种超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）分析方法对压片糖果中的非法添加药物美托拉宗进行快速筛查与定量检测。

方法 使用乙腈提取待测组分，Captiva EMR-Lipid净化柱进行净化，经Agilent RRHD Eclipse Plus C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）色谱柱进行分离，运用UPLC-Q-TOF/MS的Targeted MS/MS模式进行检测分析。

结果  美托拉宗在浓度范围50~1 000 ng·mL^-1内线性良好（r=0.999 0）；检测限为1.0 μg·g^-1；定量限为2.5 μg·g^-1，平均回收率为98.15%，RSD为2.2%（n=18）。

结论  该方法具有操作简易快速、定性定量准确等特点，能应用于日常样品的检验检测。

食品与保健食品可通过压片工艺制为片剂产品，在生产许可中称之为压片糖果。近年来一些制假分子为谋求更高的经营利润，私自在食品、保健食品和中成药中违规加入化学药物，以达到快速的治疗效果。常见非法添加化学药物的种类包括：在中成药中加入补肾壮阳药物、降糖药物、降压药物、抗哮喘药物；在凉茶中添加非甾体抗炎药物、糖皮质激素、抗菌药等[1-2]。添加了这些化学药物的食品、保健食品与中成药在服用后会导致各种不良反应的发生，严重者可能给人体带来巨大损伤。美托拉宗是一种非噻嗪类利尿降压药，具有利尿、降压等药理作用[3-4]。该药已收载于欧洲药典和美国药典，但中国药典尚未收录。2020年4月6日，欧洲药品管理局药物警戒风险评估委员会曾发布信息，警示服用噻嗪类及类似噻嗪类利尿剂可能会出现脉络膜积液和眼内压升高的不良反应，如果不及时治疗，可能会导致永久性视力丧失[5]。因此上述降压药使用有严格的适应证，需要在医生及执业药师指导下使用，以保证用药安全[6]。

目前发现有生产厂家在压片糖果中非法添加美托拉宗，但由于检验标准的不完善，部分化学药物并未列入非法添加的检测标准中，使一些不法分子有机可乘。为了打击非法添加行为、保障消费者健康，需要建立一种快速准确的检测方法对压片糖果中非法添加的美托拉宗进行检测。本研究使用乙腈作为提取溶液，通过Captiva EMR-Lipid净化柱进行净化，使用Agilent RRHD Eclipse Plus C₁₈（100 mm×2.1 mm, 1.8 µm）色谱柱进行分离，结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry, UPLC-Q-TOF/MS）中的目标物二级离子模式（target secondary ion mode, Targeted MS/MS）对美托拉宗进行检测，为检测压片糖果中的美托拉宗提供高效便捷方法。

1 仪器与试药

LC-1290超高效液相色谱仪和Agilent-Q-TOF-6550四极杆飞行时间质谱仪（安捷伦科技有限公司）；MILLIPORE明澈-D24UV型纯水机（美国密理博公司）；S90H型超声波清洗仪（德国艾尔玛公司）；3K15型高速冷冻离心机（德国西格玛公司）；XA205DU型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

美托拉宗对照品溶液（天津阿尔塔科技有限公司，批号：S011195，浓度100 µg·mL^-1，不确定度±5%）。压片糖果样品共5 批次，其中3 批次来自市场购买，2 批次为日常检测中收集。色谱级乙腈、甲醇购自于索尔科技公司。检验用水为经MILLIPORE明澈-D24UV型纯水机制备的去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent RRHD Eclipse Plus C₁₈（100 mm ×2.1 mm，1.8 µm）；柱温：45℃；进样体积 ：2 µL；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~4 min，10%~50%A；4~8 min，50%~90%A；8~10 min，90%A；以10%A后运行1 min）；流速：0.3 mL·min^-1。

2.2 质谱条件

AJS ESI离子源正模式采集，干燥氮气温度：200℃；干燥氮气流速：14 L·min^-1；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11 L·min^-1；喷嘴电压：1 000 V；毛细管电压：3 500 V；雾化器压力：35 Psi；裂解电压：380 V；碰撞能量：0，30 eV；一级扫描范围： m/z 100~1 000；二级扫描范围：m/z 50~380 ；母离子：m/z 366.067 4 ；子离子：m/z 258.996 2。美托拉宗提取离子色谱图见图1，美托拉宗二级质谱图见图2。

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  图1 美托拉宗提取离子色谱图

  Figure 1.Extracted ion chromatogram of metolazon

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  图2 美托拉宗二级质谱图

  Figure 2.MS2 spectrum of metolazone

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2.3 对照品溶液的制备

精密吸取美托拉宗对照品溶液1.00 mL，然后置于10.00 mL量瓶中，用乙腈溶剂稀释至刻度，得到浓度为10 µg·mL^-1的美托拉宗标准储备液。使用乙腈将标准储备液进行进一步稀释，得到浓度分别为S1：50 ng·mL^-1、S2：100 ng·mL^-1、S3：200 ng·mL^-1、S4：500 ng·mL^-1、S5：1 000 ng·mL^-1的标准溶液。

2.4 供试样品的制备

取10片压片糖果，粉碎，精密称取样品1.00 g到50 mL离心管，量取5 mL去离子水加入到离心管中，对样品进行涡旋分散，再在离心管中加入40 mL乙腈对样品进行超声（功率：550 W，频率：37 kHz）提取15 min，冷却至室温后，用乙腈定容至刻度，摇匀。取样品溶液离心（2 600 ×g）5 min，并用快速滤纸过滤上清液，吸取过滤后的样品溶液1.50 mL到EMR净化柱，以重力自然流速使溶液通过净化柱，收集流出液，用有机滤膜过滤后上机测定。

2.5 线性关系考察

取“2.3”项下标准溶液S1~S5，按“2.1”和“2.2”项下条件进行测定，通过仪器采集得到物质的峰面积。以标准曲线的浓度（X，ng·mL^-1）为横坐标，仪器采集得到的峰面积（Y）为纵坐标，使用仪器定量软件进行线性回归，得出美托拉宗线性回归方程为Y=5 602.43X-132 702.44（r=0.999 0），结果显示，美托拉宗在50~1 000 ng·mL^-1 浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取未检出美托拉宗的压片糖果，通过调节美托拉宗标准储备液的加入量，使待测组分添加量达到10.0 µg·g^-1，按“2.4”项下方法制备，按“2.1”和“2.2”项下条件连续进样测试6 次，记录化合物的峰面积，计算得美托拉宗峰面积的RSD为0.4%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取未检出美托拉宗的压片糖果，通过调节美托拉宗标准储备液的加入量，使待测组分添加量达到2.5 µg·g^-1，按“2.4”项下方法制备，按“2.1”和“2.2”项下条件，分别于0，2，4，6，8，10，12 h测定美托拉宗的峰面积以考察样品稳定性，结果12 h内美托拉宗峰面积的RSD为3.6%（n=7），表明样品溶液在12 h内稳定。

2.8 重复性试验

取未检出美托拉宗的压片糖果6份，通过调节美托拉宗标准储备液的加入量，使待测组分添加量达到50.0 µg·g^-1，按“2.4”项下方法制备，按“2.1”和“2.2”项下条件进行测定，计算得美托拉宗检出量的平均值为49.25 µg·g^-1，RSD为1.5%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取未检出美托拉宗的压片糖果，通过调节美托拉宗标准储备液的加入量，使待测组分添加量达到2.5，10.0，25.0 µg·g^-1，每个加标级别进行6份平行加标试验，按“2.4”项下方法制备，按“2.1”和“2.2”项下条件进行测定，记录美托拉宗的峰面积，计算回收率及RSD值。结果美托拉宗的平均回收率为98.15%，RSD为2.2%（n=18），表明方法回收率良好。

2.10 定量限与检测限试验

取未检出美托拉宗的压片糖果，通过调节美托拉宗标准储备液的加入量，进行检测限与定量限的确定。对加标的样品进行测试，计算美托拉宗色谱峰的信噪比，当美托拉宗色谱峰信噪比≥10 ∶ 1时，即为本检测方法的定量限；当美托拉宗色谱峰信噪比≥3 ∶ 1时，即为本检测方法的检出限。结果计算得美托拉宗的定量限为2.5 µg·g^-1（信噪比为18 ∶ 1），美托拉宗的检出限为1.0 µg·g^-1（信噪比为8 ∶ 1）。

2.11 样品含量测定

5 批压片糖果样品中，有2 批检出美托拉宗，结果见表1。

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  表格1 样品含量测定结果（μg·g-1，n=2）

  Table 1.The determination results of sample (μg·g-1, n=2)

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3 讨论

3.1 检测方法的选择

目前对于非法添加化学药物常用的检测方式有液相色谱法、液相色谱串联质谱法[7-10]。液相色谱法的定性方法为使用对照品与待测样品中色谱峰的保留时间进行比较后定性，由于压片糖中存在的辅料多、基质复杂，在液相色谱法中需要进行杂质峰与目标峰色谱分离的预试验，使得试验耗时加长。液相色谱串联质谱法的定性方式是通过与对照品比较离子质荷比、离子丰度、化合物保留时间进行定性，在缺少对照品的情况下无法达到准确定性。四极杆飞行时间质谱为高分辨质谱，高分辨质谱可以在缺少对照品的情况下使用记载有化合物精确质荷比的商品化数据库对样品中存在的化合物进行一级质谱筛查、二级质谱匹配。前期对声称具有降压功效的压片糖果样品进行化学药物筛查，发现样品中疑似含有化学药物吲达帕胺，通过使用该化合物的二级质谱图与数据库中的吲达帕胺二级质谱图进行匹配，结果该化合物的二级质谱图与吲达帕胺二级质谱图的匹配度为0，表明该化合物并非吲达帕胺。故通过化合物的二级质谱图结合Agilent MassHunter Molecular Structure Correlator软件与ChemSpider数据库进行分析，得出该化合物是一个与吲达帕胺互为同分异构体的物质美托拉宗。四极杆飞行时间质谱中的一级质谱筛查、二级质谱数据库匹配功能为检测提供了快速、定性准确的优势。

3.2 色谱条件的选择

本文分别研究了甲醇、乙腈作为流动相时对美托拉宗色谱峰的影响。结果显示，在采用甲醇作为流动相时，化合物色谱峰的响应大于乙腈作为流动相时的响应，且可获得峰形更尖锐的色谱峰，故选择甲醇作为该实验中的有机相。由于美托拉宗在正模式下的响应远高于负模式，在水溶液中加入甲酸可以进一步促进化合物离子化，因此比较了在水溶液中加入0.1%~0.5%的甲酸对美托拉宗色谱峰峰面积的影响。结果显示，随着水相中加入甲酸的浓度增大，美托拉宗在质谱测定得到的色谱峰峰面积略有增大，但仪器基线噪声也有明显抬高。综合不同浓度的甲酸水溶液作为流动相下所测得美托拉宗的响应与色谱柱pH的耐受性考虑，选择0.1%甲酸水溶液作为水相。

3.3 质谱分析条件的选择

通过对目标化合物进行一级质谱扫描，得到目标物的母离子，再使用Targeted MS/MS模式对目标物的碰撞能量进行优化，使子离子的响应达到最大。根据欧盟非强制执行法案2002/657/EC《质谱分析方法鉴定点数》[11]中的描述，定性物质必须获得的鉴别点数为≥4。在高分辨质谱测定得到母离子的鉴别点数为2，经过母离子转换后获得的每个子离子的鉴别点数为2.5，因此本方法仅需要监测一个母离子与一个子离子。在一级质谱扫描模式下测得美托拉宗的母离子质荷比为366.067 4 [M+H]⁺，在10~40 eV碰撞能量下进行二级质谱扫描测得美托拉宗丰度最高的子离子质荷比为258.996 2 [M]⁺。结果，美托拉宗母离子与子离子质荷比的偏差均小于5/1 000 000，在30 eV碰撞能量下子离子的响应达到最大，故选择30 eV作为美托拉宗的碰撞能量。

3.4 提取方法的选择

压片糖果是以精制糖粉为主要原料，加入了奶粉、香料，并采用了淀粉糖浆、糊精、食品明胶等为主要黏合剂，进行制粒压片后成型的混合物，基质较复杂[12]。前处理中需使用净化方法对以上物质进行去除。如杂质去除不完全，物质会吸附在色谱柱上导致色谱柱柱效下降，杂质也会随着流动相带入离子源喷雾针使喷雾针中积聚碳化物，干扰测试样品的离子化，进而影响检测方法的灵敏度。研究中先使用了水溶液对样品进行分散，使糖溶解让待测组分得到释放，由于糖在有机溶剂中溶解度较小，因此使用乙腈、甲醇分别作为加标样品的提取溶剂，通过测定Captiva EMR-Lipid净化柱净化后化合物的回收率作为考察指标，来确定最佳提取溶剂。结果，使用乙腈作为提取溶剂时所得的回收率比使用甲醇作为提取溶剂的回收率高9%，故选择乙腈作为提取溶剂。

3.5 基质效应的考察

基质效应是指由样品的基质引入，造成待测组分的信号增强或减弱现象[13]。在液质分析过程中，离子源电离会由于样品基质的引入而对测定物质的离子形成产生干扰，进而干扰测试结果的准确性。为评价基质效应本研究分别配制空白基质提取液标准曲线与溶剂标准曲线，并根据基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值作出基质效应的评价，当斜率比大于0.9说明基质效应不明显，斜率比在0.8~0.9 说明存在弱基质效应，斜率比小于0.8 说明存在强基质效应[14]。结果显示，基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率比为0.967，说明基质效应不明显，可使用纯溶剂进行标准曲线配制。

3.6 小结

本研究建立了运用Captiva EMR-Lipid净化柱技术对压片糖果中的基质进行净化前处理，通过使用UPLC-Q-TOF/MS对压片糖果中的美托拉宗进行快速筛查与定量检测。方法学验证表明，所建立的含量测定方法满足定量要求，可为压片糖果中非法添加美托拉宗的检测提供可靠方法。

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