目的  鉴定瓜蒌薤白半夏汤（GXBD）改善心肌缺氧/复氧（H/R）损伤的物质基础，分析其通过促进线粒体自噬发挥心肌保护的分子机制。

方法  采用传统煎煮法制备GXBD标准汤剂，通过醇沉工艺得到化学部位，利用D101大孔吸附树脂进一步分离纯化。建立H9c2心肌细胞H/R损伤模型，应用CCK-8法分别检测复方水洗部位、40%乙醇洗部位和90%乙醇洗部位的抗心肌细胞损伤活力。运用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术分析并鉴定复方40%乙醇洗部位的化学成分；通过Western Blot检测各组细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3）、帕金蛋白（Parkin）和FUN14域蛋白1（FUNDC1）的蛋白表达，验证复方中活性单体成分金圣草黄素抗H/R心肌细胞损伤的作用机制。

结果  复方水洗部位、40%乙醇洗部位与90%乙醇洗部位均呈剂量依赖性地提高H/R心肌细胞的存活率，40%乙醇洗部位效果更好。复方40%乙醇洗部位中可鉴定出金圣草黄素等88种化合物成分，且金圣草黄素可显著上调H/R心肌细胞Parkin和FUNDC1表达，下调Caspase-3表达，减轻H/R心肌细胞损伤。

结论  GXBD复方活性成分金圣草黄素可激活线粒体自噬，抑制细胞凋亡，从而改善心肌H/R损伤。

瓜蒌薤白半夏汤（Gualou Xiebai Banxia decoction，GXBD）是张仲景《金匮要略》中治疗“胸痹”的经典名方，由瓜蒌、薤白、半夏及白酒配伍而成[1]。该复方含有萜类、黄酮、生物碱、有机酸、甾体及甾体皂苷、核苷等多种化学成分组成，其中木犀草素、腺苷、香草酸和苦瓜素B可能是治疗冠心病的潜在有效成分[2]。现代药理学研究表明，GXBD具有保护血管内皮细胞、改善血液流变学、抗心肌纤维化等作用，临床常用于治疗痰浊闭阻型冠心病等缺血性心脏病[3-6]。

近年研究发现，心肌在缺血缺氧环境下，会激活线粒体自噬，减少线粒体损伤和凋亡，发挥重要的心肌细胞保护作用[7-9]。线粒体外膜受体在维持线粒体稳态和线粒体介导的细胞凋亡中发挥重要作用，与各种心血管疾病密切相关[10-11]。其中，帕金蛋白（Parkin）和FUN14域蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，FUNDC1）是启动线粒体自噬的经典膜受体[12]。Chen等[13]研究发现，天麻素通过PTEN诱导的激酶1（PTEN induced kinase 1 gene，PINK1）/Parkin途径改善线粒体吸收，缓解心肌缺血再灌注损伤。Wang等[14]研究显示，AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/FUNDC1信号通路可改善线粒体功能障碍，缓解心肌损伤。化瘀祛痰方可通过降低FUNDC1表达，调控线粒体自噬改善动脉粥样硬化家兔肝脏脂质沉淀[15]。而GXBD中是否存在活性成分通过激活线粒体自噬、减少细胞凋亡、缓解缺血性心肌损伤的机制尚不清楚。本研究旨在分析GXBD抗缺血性心肌损伤的有效部位和活性成分，阐释其促进线粒体自噬，减少心肌细胞凋亡，发挥心肌保护的分子机制，为GXBD改善心肌缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

C170i型细胞培养箱（德国Eppendorf公司）；CA92014型缺氧小室（美国Billups-Rothenber公司）；IX80+DP80型倒置显微镜（日本Olympus公司）；6546型超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用系统（美国Agilent公司）；Alpha2-4LSC-Plus真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；U-2910型紫外分光光度计（日本Hitachi公司）；Entris II型万分之一分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 主要药品与试剂

瓜蒌子（批号：221202，产地：安徽）和薤白（批 号：221101，产地：广西）购自广州致信中药饮片有限公司，瓜蒌皮（批号：230302301，产地：浙江）购自广东康美药业股份有限公司，清半夏（批 号：YP23B01，产地：甘肃）购自梅州广药采芝林药业有限公司，以上药材饮片经广州中医药大学第二临床学院何凡教授鉴定符合《中国药典（2025年版）》饮片质量要求；黄酒（嵊州市仙岩酿造厂生产，酒精度数：14% vol，符合GB/T 13662要求）；芦丁对照品（上海颖心实验室设备有限公司，批号：20220327001，纯度＞98%）；金圣草黄素（chrysoeriol，CSR）对照品（成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，批号：RFS-J12702302015，纯度＞98%）；卡托普利（德国默克生命科学有限公司，批号：SLCM1503，纯度＞98%）；DMEM高糖培养基（批号：6124561）、青霉素-链霉素双抗生素（批号：15140-122）、胎牛血清（批号：N2780776P）、PBS缓冲液（批号：6124372）均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶（批号：20220324）和CCK-8试剂盒（批号：20241011）购自苏州新赛美生物科技有限公司；RIPA裂解液（批号：YA362490）、BCA试剂盒（货号：A55864）、Rabbit anti-FUNDC1（批号：38664A05）均购自美国Thermo Fisher公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3）抗体（批号：BA076520997）和兔抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号：4967S）购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗Parkin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：PK10076）；小鼠抗热休克蛋白-60（heat shock protein 60，HSP60）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司，批号：I0923）；抗兔二抗（批号：D30425-15）、抗小鼠二抗（批号：D30418-25）均购自美国LI-COR公司；高纯氮（广州丹欧童贸易有限公司，批号：20250116）；D101大孔树脂（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C14727891）；甲醇和乙醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 细胞

H9c2心肌细胞株（苏州海星生物科技有限公司，批号：TCR-C607-UD）。

1.4 GXBD化学部位制备

1.4.1 正交试验优化提取工艺

根据《古代经典名方关键信息表（25首方剂）》[16]中GXBD项下的现代对应方法，采用传统煎煮工艺制备标准汤剂：取30.00 g瓜蒌、20.70  g薤白和17.25 g清半夏，加黄酒1 000 mL煎煮2次，每次30 min；合并滤液，减压浓缩，加乙醇至规定浓度，将药液密闭，4 ℃环境下静置，分离上清和沉淀，上清液减压浓缩，冷冻干燥，即得样品。

以浸膏密度（A）、乙醇浓度（B）、醇沉时间（C）为考察因素，设计L9(3)4正交试验，以总黄酮含量为评价指标，优化醇沉工艺（表1）。

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  表格1 GXBD有效成分提取工艺正交实验因素水平表

  Table 1.Factor level table for the orthogonal experimental design of the extraction process of active ingredients from GXBD

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1.4.2 总黄酮的测定方法

精密称定芦丁对照品5 mg，加50%甲醇制成0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。分别精密量取该溶液0、1、2、3、4、5 mL，各置于10 mL量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL、10%硝酸铝溶液0.3 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，加水定容至刻度。在500 nm波长处测定各对照品溶液的吸光度，以对照品浓度为横坐标（X，mg/ mL）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线。精密称定样品100 mg ，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，超声至完全溶解，静置至恢复室温，得样品溶液。采用与对照品相同的方法处理样品溶液，测定其吸光度值并代入标准曲线方程，计算总黄酮含量。

1.5 GXBD化学部位纯化工艺优化

将最优醇提工艺上清液冷冻干燥后即得粗提取物。称取粗提取物的干燥粉5 g，加纯水100 mL溶解，制成50 mg/mL的水溶液。将该水溶液通过装有相当于醇提物5倍量D101大孔吸附树脂的玻璃柱，依次用纯水500 mL、40%乙醇500 mL和90%乙醇500 mL洗脱，分别收集3种洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，制成粉末样品，分别命名为水洗部位、40%乙醇洗部位和90%乙醇洗部位。

1.6 GXBD有效部位筛选

1.6.1 细胞培养

H9c2细胞使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。当细胞生长密度达到约80%时进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.6.2 不同洗脱部位对H9c2细胞活力影响

分别称取3个不同洗脱部位的冻干粉末各28 mg，加入7 mL PBS溶液溶解，配制成4 mg/mL的药物母液，再用DMEM培养基将母液稀释至各实验所需浓度。调整H9c2细胞密度为8×10⁴个/mL，按每孔100 μL接种于96孔板中。除对照组（Ctrl组）外，根据给药浓度设置9个剂量组，终浓度分别为3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μg/mL，每组设置3个平行复孔。细胞培养48 h后，更换为新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK-8试剂，避光孵育1.5 h，随后在450 nm波长处测定吸光度，并计算各组H9c2细胞的存活率。

1.6.3 不同洗脱部位对H/R H9c2细胞的药效作用

将H9c2细胞分为Ctrl组、模型组（H/R组）、不同洗脱部位药物组（分为水洗部位组、40%乙醇洗部位组和90%乙醇洗部位组）及阳性药物组（CA组），每组均设置3个平行复孔。药物溶液的配制方法同“1.6.2”项下。CA组中，称取13  mg CA，溶于2 mL PBS溶液中，配制成6.95 mg/mL的母液，再用DMEM培养基稀释至320 μmol/L的浓度进行给药。不同洗脱部位药物组均设为100、200、400  μg/mL 3个浓度。

根据课题组报道的H/R建模方法进行实验 [17]。将调整好密度的H9c2细胞接种于96孔板，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48 h，待细胞生长融合至约80%时，进行H/R模型构建。除Ctrl组和H/R组外，其余各组在H/R模型构建前1 h进行预给药。随后H/R组和各药物组加入缺氧液，将细胞转移至缺氧小室中缺氧处理2.5 h。缺氧结束后，更换为DMEM培养基进行复氧，同时所有组每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于37℃、5% CO₂培养箱中避光孵育1.5 h。最后，在450 nm波长处测定吸光度，并计算各组H9c2细胞的存活率。

1.7 40%乙醇洗部位化学成分分析

采用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS）技术分析富集得到的40%乙醇洗部位。色谱柱为ACQUITYPremierHSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0~2 min，5%→25% B；2~4 min，25%→50% B；4~11 min，50%→90% B；11~13 min，90%→99%B），流速为0.30 mL/min，进样量为2 µL。采用电喷雾（ESI）电离技术，正、负离子检测模式；喷雾电压：正离子模式为4 500 V，负离子模式为-4 500 V；MS1、MS2采集范围为70~1 700 m/z。采用Progenesis QI软件，根据样品碎片离子信息进行质谱数据处理分析，鉴定40%乙醇洗部位中的主要化学成分。

1.8 分子对接筛选活性成分

为进一步筛选40%乙醇洗部位的活性成分，对40%乙醇洗部位中鉴定出的黄酮类、生物碱类以及萜类与Parkin、FUNDC1和Caspase-3 3个靶点进行分子对接验证，其中结合能低于-7 kcal/mol，说明化合物与靶点结合活性强烈。

1.9 CSR抗H/R心肌细胞损伤机制

1.9.1 CSR对H/R心肌损伤的保护作用

将H9c2细胞分为Ctrl组、H/R组、CSR不同浓度组、CA组，每组设3个平行复孔。称取CSR 1.2 mg，加入二甲基亚砜溶液50 μL溶解，得24 mg/mL CSR母液，再用DMEM培养基稀释至所需浓度。除Ctrl组正常培养外，其余组别均进行H/ R造模，方法同“1.6.3”项。CSR组设1.25、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L不同浓度组别，采用CA组以320 μmol/L浓度进行给药，采用CCK-8法检测细胞活力变化。

1.9.2 CSR对心肌细胞凋亡蛋白和线粒体自噬蛋白表达的影响

将H9c2细胞分为6组，Ctrl组、H/R组、CSR组、线粒体自噬激动剂雷帕霉素组（Rap组）、线粒体自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组（3-MA组）、CSR+3-甲基腺嘌呤组（C+3组），每组设3个平行复孔。除Ctrl组正常培养外，其余组别均进行H/R造模，方法同“1.6.3”项。CSR组、Rap组和3-MA组分别以40、5 μmol/L和5 mmol/L浓度进行给药，C+3组给予40 μmol/L的CSR和5 mmol/L的3-MA。

H/R处理结束后，收集各组细胞，使用RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法进行定量。取等量蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳分离，并转印至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭后，分别与Caspase-3、Parkin和FUNDC1一抗4 °C孵育过夜，TBST洗膜后与HRP标记二抗室温孵育2 h。最后采用ECL化学发光显影，通过化学发光成像系统采集并分析条带。

1.10 统计学分析

本研究计量数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），事后两两比较使用Tukey's多重检验。利用Progenesis QI软件对质谱检测的化学成分进行鉴定，所有统计分析均使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0软件完成，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正交试验结果

经比较各因素极差（R值）可知，各考察因素对提取的GXBD有效成分含量影响大小依次为浸膏密度（A）＞乙醇浓度（B）＞醇沉时间（C），最优提取工艺组合为A₃B₁C₃，即浸膏密度为1.20 g/cm³、乙醇浓度为60%、醇沉时间为24 h（表2和表3）。根据所建立的标准曲线Y=0.008 8 X+0.114 2（r=0.999 9），采用正交试验优化的提取工艺平行开展3次验证试验，通过测定总黄酮得率评估工艺稳定性，得到总黄酮含量为0.146%±0.002%、0.139%±0.006%和0.141%±0.007%，平均值为0.142%±0.007%，与正交试验筛选的最优工艺下的得率吻合。

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  表格2 提取工艺因素水平正交表及正交试验结果

  Table 2.Orthogonal array of factor levels for the extraction process and experimental results

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  表格3 排队评分法方差分析表

  Table 3.Analysis of variance table for the ranking score method

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2.2 GXBD化学部位纯化工艺优化

水、40%乙醇、90%乙醇洗部位总黄酮的含量分别为0.98%、1.54%、0.66%（n=3），结果表明，40%乙醇洗部位效果最好，故选取40%乙醇洗部位进行后续物质成分保护作用的研究。

2.3 不同洗脱部位对H9c2细胞H/R损伤的药效作用

2.3.1 不同洗脱部位对H9c2细胞活力影响

实验结果显示，与Ctrl组相比，各浓度40%乙醇洗部位处理组的细胞存活率差异均无统计学意义（P＞0.05），表明该浓度范围内40%乙醇洗部位对H9c2细胞无明显毒性作用（图1）。当水洗部位和90%乙醇洗部位浓度升高至800 μg/mL时，H9c2存活率极显著降低（P ＜0.01）。

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  图1 不同洗脱部位对正常H9c2心肌细胞活力的影响（n=3）

  Figure 1.Effect of different elution fractions on the viability of normal H9c2 cardiomyocytes (n=3)

  注：A. 水洗部位组；B. 40%乙醇洗部位组；C. 90%乙醇洗部位组；与Ctrl组比较，aP＜0.01。

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2.3.2 不同洗脱部位对H/R造模的H9c2细胞存活率的影响

与Ctrl组相比，H/R组细胞的存活率显著降低（P＜0.01），标志造模成功。与H/R组相比，40%乙醇洗部位的100、200、400 μg/mL剂量组细胞存活率显著增加（P＜0.01），且浓度为400  μg/mL时细胞存活率最高；水洗部位和90%乙醇洗部位的200、400 μg/mL剂量组细胞存活率增加（P＜0.01），且浓度为400 μg/mL时细胞存活率最高，且随给药浓度升高，细胞存活率越高，呈剂量依赖性（图2）。后续实验采用40%乙醇洗部位进行。

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  图2 不同洗脱部位对H/R损伤细胞活力的影响（n=3）

  Figure 2.Effect different elution fractions on the viability of H/R-injured cells (n=3)

  注：A. 水洗部位组；B. 40%乙醇洗部位组；B. 90%乙醇洗部位组；与Ctrl比较，aP＜0.01；与H/R比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

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2.4 40%乙醇洗部位化学成分分析

通过查阅Pubchem、ChemicalBook、ChemSpider、Pubmed、CNKI等数据库，对GXBD中化学成分的相关数据进行整理归纳，构建本地化学成分数据库。采用Progenesis QI软件进行数据峰提取及峰匹配。通过对40%乙醇洗部位的质谱数据进行分析，从40%乙醇洗部位中共鉴定出88个化学成分（图3），包括生物碱类9个、黄酮类4个、核苷类8个、芳香酸类13个、萜类及其苷类9个（附表1）。

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  图3 GXBD40%乙醇洗部位总离子流Figure. 3. Total ion chromatogram of the 40% ethanol-eluted purified fraction from GXBD

  Figure 3.注：A. 正离子模式；B. 负离子模式；80-CSR对应的色谱峰为GXBD中CSR特征峰。

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2.5 分子对接

22个化合物与Parkin、FUNDC1和Caspase-3的结合能见表4，以结合能均＜-7 kcal/mol进行综合排名，其中与3个靶点结合能均＜-7 kcal/mol的化合物有3个，分别为法巴森（fabacein）、奥佩库林A（opercurin A）和CSR，其中，CSR对3个靶点均表现出均衡且高效的结合能力，具备多靶点调节的潜力，其黄酮母核均能与Caspase-3和FUNDC1活性位点的关键残基形成稳定氢键（图4A和图4B），同时，其芳香环还能精准插入Parkin的Leu204疏水裂隙中（图4C）。因此，后续选择CSR作为代表性活性成分进行机制研究。

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  表格4 靶点与成分的结合能

  Table 4.Binding energy of targets and components

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  图4 CSR与Caspase-3、FUNDC1和Parkin分子对接模式图

  Figure 4.Molecular docking pattern diagram of CSR with Caspase-3, FUNDC1, and Parkin.

  注：A. Caspase-3；B. FUNDC1；C. Parkin。

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2.6 CSR对H/R的H9c2心肌细胞的干预作用

2.6.1 CSR对H/R和H9c2细胞存活率影响

与Ctrl组相比，CSR在20.0、40.0、80.0 μmol/L的浓度下表现出显著的抗H/R心肌细胞损伤作用（P＜0.01），且呈剂量依赖性（图5）。

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  图5 CSR对H/R细胞活力的影响（n=3）

  Figure 5.Effect of CSR on H/R-induced cell viability (n=3)

  注：与Ctrl组比较，aP<0.01；与H/R组比较，bP<0.05。

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2.6.2 H9c2细胞内凋亡蛋白以及线粒体自噬蛋白检测

同Ctrl组相比，H/R组的细胞凋亡蛋白Caspase-3表达量显著增加（P＜0.01），给予CSR干预后Caspase-3表达量显著降低（P ＜0.01），见图6A和图6B。同Ctrl组相比，H/R组的Parkin和FUNDC1表达量极显著降低（P ＜0.01），给予CSR后可显著上调线粒体自噬相关蛋白Parkin（P＜0.01）和FUNDC1的表达（P ＜0.05），见图6C~6E。结果提示，CSR可能通过激活Parkin和FUNDC1依赖的线粒体自噬途径，抑制细胞凋亡，减轻H9c2心肌细胞的H/R损伤。

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  图6 CSR对H/R细胞凋亡蛋白以及线粒体自噬蛋白相关指标的影响

  Figure 6.Effect of CSR on apoptotic and mitophagy-related proteins in H/R-induced cells

  注：A和B. Caspase-3蛋白表达变化；A和C. Parkin蛋白表达变化；D和E. FUNDC1蛋白表达变化；与Ctrl组比较，aP<0.01；与H/R组比较，bP<0.05，cP<0.01。

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3 讨论

本研究围绕GXBD改善H/R心肌损伤的物质基础与作用机制展开，包括复方有效部位分离纯化、活性化学成分鉴定到细胞分子机制验证。在工艺与成分分析层面，采用水提醇沉法联合大孔吸附树脂得到GXBD中黄酮为代表的40%乙醇洗脱部位，其黄酮含量为1.54%，与文献[18]报道基本一致。采用UHPLC-Q-TOF-MS技术进一步从40%乙醇洗部位鉴定出88种化合物，涵盖黄酮类、生物碱类、氨基酸类等多种结构类型，与现有研究报道结果基本一致[19]。其中，CSR是一种天然黄酮化合物，存在于瓜蒌、金银花等多种中草药中，且可通过抑制凋亡通路减轻心肌缺血再灌注损伤[20-22]。本研究在40%乙醇洗脱部位中也鉴定出CSR成分，且该成分表现出良好的抗心肌损伤作用。在细胞保护作用与机制层面，研究发现GXBD的40%乙醇洗脱部位与水洗部位均能剂量依赖性地提升H9c2心肌细胞在H/ R损伤模型中的存活率，并改善细胞形态学异常，提示GXBD确有保护心肌潜力。研究表明，CSR不仅显著抑制凋亡关键蛋白Caspase-3的表达，还可上调线粒体自噬相关蛋白Parkin与FUNDC1的表达。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行蛋白，其高表达直接反映细胞凋亡水平[23]。本次Parkin的实验结果与李想等[24]的研究结果一致。本研究还通过线粒体膜蛋白抑制剂和激动剂实验进一步验证H/R模型细胞中FUNDC1的表达趋势，结果也符合预期。本次实验结果显示，CSR通过激活Parkin和FUNDC1介导的线粒体自噬通路，减少细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用。

GXBD临床用于治疗痰浊闭阻型胸痹，中医学所述之“痰浊”源于脾失健运，津液化失其正，又因胸阳不振，气机不畅，痰浊上犯，导致痰浊闭阻型胸痹，与现代医学之冠心病的基本病理机制具有病证对应的关系[25]。冠状动脉狭窄导致心肌细胞处于缺血缺氧的状态，心肌细胞可通过调控线粒体自噬相关的信号通路蛋白或激酶，激活线粒体自噬过程，减轻心肌细胞损伤[26]。GXBD中活性成分CSR通过激活线粒体自噬保护心肌细胞，在分子水平上为治疗痰浊闭阻型胸痹提供了思路。然而，GXBD作为中医经典名方，其药效机制是多成分、多靶点协同作用的结果。除CSR外，本研究中表现出的黄酮类成分和其他化学成分也有可能通过不同途径参与心肌保护。例如，牛耘等[27]发现GXBD通过调控转化生长因子-β1/Smads通路，能抑制心肌细胞外基质重构，可显著改善心肌缺血大鼠的心功能和心肌病理形态变化，降低大鼠心肌损伤程度。陈文豪等[28]报道GXBD可通过调节缺氧诱导因子-1α/血管内皮生长因子通路，发挥缓解心肌损伤作用。GXBD还可以促进成纤维细胞生长因子21/成纤维细胞生长因子受体1/β-klotho蛋白-成纤维细胞生长因子受体底物2信号通路蛋白的表达，抑制了成纤维细胞受体底物2α的磷酸化，减轻心肌细胞的凋亡[29]。Tsikas等  [30]报道的氨基酸类成分可能通过改善能量代谢或抗氧化应激发挥辅助作用。因此，未来的研究仍需关注GXBD整体成分群的协同效应。本次研究虽基于体外模型验证了复方化学组分和代表性化学成分的抗心肌细胞损伤作用，但其体内药效及药代动力学特性尚未验证。此外，PINK1-Parkin与FUNDC1是线粒体自噬的两条经典途径。传统观点认为二者相对独立，但近年研究表明，这两条通路之间存在复杂的交互作用。磷酸甘油酸变位酶家族成员5（PGAM family member 5，PGAM5）是连接两条通路的上游关键节点蛋白之一。在缺氧应激下，PGAM5可促进FUNDC1去磷酸化，激活FUNDC1介导的线粒体自噬[31]。同时，PGAM5也是PINK1/Parkin通路上游调控蛋白，全长形式的PGAM5促进PINK1的稳定积聚，激活Parkin通路[32]。另外，膜相关RING-CH型蛋白5（membrane-associated RING-CH-type finger 5，MARCH5）是另一关键的交互调控节点。研究表明，MARCH5通过对FUNDC1进行泛素化修饰，调节FUNDC1通路[33]。同时，MARCH5通过介导线粒体融合蛋白2的泛素化降解，调控Parkin通路[34]。通路之间的交互作用及其上游调控机制仍需进一步研究，未来可通过动物实验、基因敲除或过表达模型，并结合代谢组学、转录组学、蛋白质组学等多组学技术，深入揭示GXBD多成分协同作用网络及其在心肌保护中的系统生物学机制。

综上所述，本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS技术鉴定并验证了GXBD中以CSR为代表的黄酮类活性成分的抗H/R心肌损伤的保护作用。采用分子生物学技术，通过体外实验进一步明确了GXBD中的活性成分CSR通过激活Parkin和FUNDC1介导的线粒体自噬通路减轻心肌H/R损伤的药效机制。

附件见《药学前沿》官网附录（https://yxqy.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/ 202602014.pdf）

1. 张仲景, 著. 金匮要略[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 31.

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