目的 初步探究在骨肉瘤MG-63细胞中长链非编码RNA00472（LINC00472）的表达及甲基化是否受地西他滨（DAC）和DNMT1的调控。

方法 去甲基化诱导剂DAC终浓度5 μmol/L作用MG-63细胞48 h，利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测DAC对MG-63细胞中LINC00472 mRNA表达水平的影响，甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）检测DAC对LINC00472启动子区域CpG岛甲基化水平的影响；利用慢病毒沉默MG-63细胞中DNMT1基因后，通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测DNMT1对MG-63细胞功能的影响，利用RT-qPCR检测DNMT1对MG-63细胞中LINC00472 mRNA表达水平的影响，MSP和BSP检测DNMT1对MG-63细胞LINC00472启动子区域CpG岛甲基化水平的影响。

结果 RT-qPCR结果表明DAC能诱导LINC00472过表达，甲基化结果表明MG-63细胞中LINC00472启动子区域CpG岛处于极低甲基化水平（1.4%），且DAC能使LINC00472启动子CpG岛从极低甲基化（1.4%）降至完全非甲基化（0%）。沉默DNMT1后，MG-63细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭能力被抑制；LINC00472mRNA表达水平轻微升高；LINC00472启动子区域CpG岛甲基化水平下降（1.4%→0.7%）。

结论 在MG-63细胞中LINC00472启动子区域呈极低甲基化；DAC可诱导其表达上调并完全去甲基化，说明甲基化可能参与调控，但并非主要途径；沉默DNMT1可抑制细胞生长，但对LINC00472无明显影响，可能与其固有低甲基化有关。

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤^［1-2］。尽管治疗手段不断进步，其预后仍不理想，亟须探索新的分子靶点和表观遗传调控机制。长链非编码RNA00472（long non-coding RNA 00472，LINCOO72）为lncRNAs的成员之一，定位于人类染色体6q13，这些RNA未被翻译成蛋白质，但参与蛋白质翻译过程中的调控^［3］。近年来的研究发现，LINC00472在多种肿瘤中发挥抑癌作用，且其表达可受DNA甲基化调控^［4-5］。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs，如DNMT1、DNMT3A/B）催化的重要表观遗传修饰，DNMT1负责维持位于CG二核苷酸丰富区域的甲基化模式。DNMT1的异常表达抑制了肿瘤抑制因子，减少了正常的阻滞信号，导致肿瘤细胞的生长失控^［6］。此前也有研究证明，DNMT1活性在肝细胞癌细胞的恶性进展中起积极作用^［7］。在骨肉瘤中，DNMT1的高表达与化疗耐药性相关，沉默DNMT1可增强细胞对药物的敏感性^［8］。地西他滨（decitabine，DAC）是一种胞嘧啶类似物，可通过诱导去甲基化恢复抑癌基因表达^［9］。

本课题组前期发现，DAC处理可抑制MG-63细胞的生长并改变其表型，同时伴LINC00472表达上调，提示DAC的抗肿瘤作用可能部分通过上调该基因实现，即该基因表达可能受DNA甲基化调控^［10］。然而，DAC及DNMT1对骨肉瘤中LINC00472的调控作用尚不明确。为此，本研究拟探讨MG-63细胞中LINC00472表达与甲基化的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

5415R型高速冷冻离心机（德国Eppenderf公司）；THZ-032型恒温摇床（上海博迅仪器有限公司）；QuantStudio 6 Flex型实时荧光定量仪（美国Applied Biosystems公司）；Synergy2型全波长紫外-可见光酶标仪（美国BioTek公司）；CKX-A32PH型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；DMi8型倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）；DYCZ-TRANS2型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；KZ-III-F型高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物公司）；NanoDrop2000型超微量分光光度计（美国Thermo公司）。

1.2 主要药品与试剂

DAC（批号：BM001565，纯度 ≥ 99.17%）和CCK-8试剂盒（批号：20010784）购自Proteintech公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号：GP2410003）、DMEM高糖培养基（批号：GA2410015）、青霉素混合液（批号：GA2409003）、特级胎牛血清（批号：SO20220216）、RIPA裂解液（批号：CR2404066）、结晶紫染色液（批号：CR2410094）、通用型DNA纯化回收试剂盒（批号：MPC2505023）、SerRed核酸染料（10 000×，水溶，批号：MPC2403070）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；嘌呤霉素（上海吉玛生物公司，批号：20241119）；RNA提取试剂盒（批号：T1250218）和逆转录试剂盒批号（批号：T1250314-V3）购自全式金生物公司；实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒（启衡星生物公司，批号：32586497）；慢病毒DNMT1-Homo-1135（批号：20241113）和空白对照载体病毒（批号：20241111）均由上海吉玛生物公司设计，包括慢病毒克隆的制备、病毒包装与质量检测等。

1.3 细胞

人成骨肉瘤MG-63细胞（广州赛库生物技术有限公司，批号：2024080103）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

将MG-63细胞培养于DMEM高糖培养基中（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素），待细胞密度达80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行后续传代、冻存等实验。

1.4.2 慢病毒介导的MG-63细胞DNMT1基因沉默

取对数生长期、状态良好、细胞融合率约85%的MG-63细胞，以5×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，每孔加液500 μL，在37 ℃、5% CO₂培养箱中贴壁24 h。设置空白对照组（标记为Control组）和沉默组（标记为sh-DNMT1组），分别加入上海吉玛基因公司定制的空白对照慢病毒及靶向沉默DNMT1基因的慢病毒，以感染复数为40进行感染，同时加入终浓度为5 μg/mL的Polybrene以提高感染效率。感染24 h后弃去含病毒培养基，用PBS轻轻洗涤细胞，更换为完全培养基继续培养。感染72 h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，评估感染效率。当荧光率大于80%时，向培养液中加入终浓度为1 μg/mL的嘌呤霉素，筛选感染成功的细胞，筛选周期约14 d，期间正常换液培养。待细胞荧光率达95%以上时，收集细胞并裂解提取RNA，用于后续检测。

1.4.3 RNA提取及RT-qPCR检测

收集sh-DNMT1组、Control组及未经处理的正常MG-63细胞样本。其中，sh-DNMT1组与Control组细胞接种于6孔板中培养48 h后收样；正常MG-63细胞接种于6孔板中，待细胞融合率达80%时，加入终浓度为5 μmol/L的DAC处理48 h后收集样本，其中，经DAC处理的细胞标记为DAC组，未经DAC处理的正常MG-63细胞标记为NC组。采用Trizol法提取各组细胞总RNA，具体操作按PCR检测试剂盒说明书进行。以GAPDH为内参，每个反应设3个复孔，采用2^-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。所用引物序列见表1。

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  表格1 RT-qPCR引物序列

  Table 1.Primer sequences for RT-qPCR

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1.4.4 CCK8实验检测细胞增殖活性

取慢病毒介导的sh-DNMT1组及Control组MG-63细胞，常规消化后制备单细胞悬液，计数后以8×10³个/孔的密度、100 μL/孔的体积接种于96孔板中，每组设3个复孔，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。分别培养24、48、72 h后取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔光密度（OD）值。

1.4.5 平板克隆形成实验

取慢病毒介导的sh-DNMT1组及Control组MG-63细胞，常规消化后制备单细胞悬液，计数后以500 个/孔的数量、2 mL/孔的体积接种于6孔板中，每组设3个复孔，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，每3 d换1次培养液，持续培养至肉眼可见克隆形成时，吸弃旧培养基，PBS洗涤后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30~60 min；PBS洗涤后弃尽液体，每孔加入1 mL 0.1%结晶紫染液染色20 min。吸弃染液，PBS洗涤，细胞风干后拍照记录。将6孔板倒置于白色背景板上，用手机拍照，利用ImageJ进行克隆计数。

1.4.6 细胞划痕实验

取慢病毒介导的sh-DNMT1组及Control组MG-63细胞，常规消化后制备单细胞悬液，计数后以1×10⁶个/mL、2 mL/孔的体积接种于6孔板中，每组设3个复孔，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。当细胞生长至100 %融合后，用100 μL枪头垂直于板底，沿直尺在各孔底部均匀划痕，尽量保证各组划痕面积大小一致。划痕后弃去旧培养基，用PBS轻轻洗涤细胞以去除划痕脱落的细胞，每孔加入2 mL基础培养基，立即于倒置荧光显微镜下拍照记录，记为0 h划痕面积。将6孔板放回培养箱继续培养24 h后，于相同位置再次拍照记录（取样前在板底做好标记，确保前后拍照部位一致）。采用ImageJ软件测量各视野划痕面积，按以下公式计算细胞迁移愈合率，愈合率越高，表明细胞迁移能力越强。

愈合率（%）=（1-24 h划痕面积/0 h划痕面积）×100%

1.4.7 Transwell迁移实验

取对数生长期、状态良好、细胞融合率约为85%的sh-DNMT1组及Control组MG-63细胞，用无血清的DMEM高糖培养基分别调整细胞密度为1×10⁵/mL。取200 μL细胞悬液加入Transwell上室中，下室加入500 μL含20%的完全培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。培养结束后，取出上室，吸弃培养基，用PBS轻轻清洗1~2次；将上室置于含600 μL 4%多聚甲醛的孔中，室温固定30 min；取出后转移至含600 μL 0.1%结晶紫染液的孔中，室温染色20 min；随后用PBS轻轻漂洗2次，以去除未结合的染液。将小室自然晾干后，置于载玻片上，于倒置显微镜下观察，每个上室随机选取3个视野拍照记录。

1.4.8 Transwell侵袭实验

提前将枪头、离心管、Transwell小室置于冰箱预冷。将Matrigel胶从-20 ℃取出，置于-4 ℃冰箱中过夜，按照试剂盒说明书以1∶8比例用无血清培养基稀释。取60 μL稀释后的Matrigel胶均匀铺于Transwell上室底部，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养3 h，吸弃多余液体，每孔加入100 μL无血清培养基，于培养箱中水化30 min。取出小室，吸弃多余液体，检查是否有液体穿过小室至下层，确认无穿液后即可接种细胞。后续细胞悬液制备、接种、培养、固定、染色及拍照计数等操作同“1.4.7”项。

1.4.9 甲基化PCR检测MG-63细胞LINC00472启动子区域CpG岛甲基化状态

各组细胞样本收集同“1.4.3”项下，将各组细胞沉淀提取DNA。取上述基因组DNA经亚硫酸氢盐转化处理，使未甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。使用纯化柱回收修饰后的DNA。设计甲基化特异性引物（M引物）和非甲基化特异性引物（U引物），分别对目标区域进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，根据M条带和（或）U条带的有无判断LINC00472启动子区CpG岛的甲基化状态：仅出现M条带提示甲基化，仅出现U条带提示非甲基化，M和U条带均出现则提示部分甲基化。

1.4.10 亚硫酸氢盐测序PCR检测MG-63细胞LINC00472启动子区域CpG岛甲基化水平

将“1.4.9”项下经亚硫酸氢盐处理过的DNA样本进一步通过亚硫酸氢盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）实验检测LINC00472甲基化水平。PCR扩增：设计覆盖目标区域的BSP引物（引物序列中需避开CpG位点），以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板进行PCR扩增。克隆测序：将PCR产物克隆至载体，挑取多个单克隆测序（反映单个DNA分子的甲基化状态）。对PCR产物直接进行测序，比对测序结果与参考序列，统计每个CpG位点的C（甲基化）或T（未甲基化）信号，计算甲基化比例。

1.5 统计学分析

采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以表示。两组间比较时，若数据符合正态分布且方差齐，采用两独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用非参数秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒介导的DNMT1基因沉默MG-63细胞株的构建及验证

采用嘌呤霉素（1 μg/mL）筛选14 d，期间及时去除死亡细胞。筛选结束后，荧光显微镜下可见95%以上细胞呈现绿色荧光（图1-A）。同时收集细胞，通过RT-qPCR检测DNMT1 mRNA表达水平，结果（图1-B）显示，sh-DNMT1组DNMT1 mRNA表达水平较Control组显著降低约50%（P < 0.01），表明DNMT1基因被成功沉默，可用于后续实验。

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  图1 荧光图片和RT-qPCR结果（n = 3）

  Figure 1.Fluorescence images and RT-qPCR results （n=3）

  注：A. 嘌呤霉素筛选14 d后Control组和sh-DNMT1组细胞的荧光表达（10×）；B. Control组和sh-DNMT1组细胞中DNMT1 mRNA表达水平；C. NC组和DAC组细胞中LINC00472 mRNA表达水平；D. Control组和sh-DNMT1组细胞中LINC00472mRNA表达水平；aP < 0.01。

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此外，RT-qPCR结果显示，DAC组LINC00472表达水平较NC组显著上调（图1-C）（P < 0.01），而sh-DNMT1组LINC00472表达水平与Control组相比差异无统计学意义（图1-D）（P > 0.05），提示沉默DNMT1对LINC00472的表达无明显影响。

2.2 CCK-8法检测沉默DNMT1对MG-63细胞增殖活性的影响

采用CCK-8法检测细胞增殖活性，OD值反映活细胞数量。与Control组相比，sh-DNMT1组在48 h和72 h细胞OD值显著降低（P < 0.05）。具体见图2。

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  图2 沉默DNMT1后MG-63细胞OD值（n = 5）

  Figure 2.The OD value of MG-63 cells after DNMT1 silencing（n=5）

  注：与sh-DNMT1组比较，aP < 0.05，bP < 0.01。

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2.3 沉默DNMT1后对骨肉瘤MG-63细胞克隆能力的影响

平板克隆形成实验结果显示，与Control组相比，sh-DNMT1组的克隆形成数量显著减少（P < 0.01）。具体见图3。

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  图3 沉默DNMT1后MG-63细胞的克隆能力（4×，n = 3）

  Figure 3.Clonogenic ability of MG-63 cells after DNMT1 silencing （4×, n=3）

  注：aP < 0.01。

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2.4 沉默DNMT1后对骨肉瘤MG-63细胞平面迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与Control组相比，sh-DNMT1组的迁移率有所下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）。具体见图4。

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  图4 沉默DNMT1后MG-63细胞的平面迁移能力（4×，n = 3）

  Figure 4.Migration ability of MG-63 cells after DNMT1 silencing（4×, n=3）

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2.5 沉默DNMT1后对骨肉瘤MG-63细胞的迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，与Control组相比，sh-DNMT1组迁移到下室的细胞数量显著减少（P < 0.05）。具体见图5。

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  图5 沉默DNMT1后MG-63细胞的迁移能力（10×，n = 3）

  Figure 5.Migration ability of MG-63 cells after DNMT1 silencing （10×, n=3）

  注：aP<0.05。

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2.6 沉默DNMT1后对骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，与Control组相比，sh-DNMT1组侵袭到下室的细胞数量显著减少（P < 0.05）。具体见图6。

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  图6 沉默DNMT1后MG-63细胞的侵袭能力（10×，n=3）

  Figure 6.Invasion ability of MG-63 cells after DNMT1 silencing （10×, n=3）

  注：aP<0.05。

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2.7 MSP检测沉默DNMT1后MG-63细胞中LINC00472甲基化状态

MSP引物如表2，NC组、DAC组、Control组、sh-DNMT1组均显示发生完全非甲基化。具体见图7。

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  表格2 MSP引物序列

  Table 2.Primer sequences for MSP

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  图7 各组LINC00472甲基化状态

  Figure 7.Methylation status of LINC00472 in each group

  注：图中仅出现U条带提示完全非甲基化。

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2.8 BSP检测沉默DNMT1后MG-63细胞中LINC00472甲基化水平

BSP引物序列见表3，LINC00472基因启动子区的CpG岛分布如图8所示。BSP检测结果显示，NC组、DAC组、Control组和sh-DNMT1组的甲基化水平分别为1.4%、0、1.4%和0.7%（图9-A～D）。

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  表格3 BSP引物设计

  Table 3.Design of BSP Primers

  注：GC含量为鸟嘌呤和胞嘧啶2种碱基所占的百分比。

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  图8 LINC00472基因启动子区的CpG岛分布

  Figure 8.Distribution of CpG islands in the promoter region of the LINC00472 gene

  注：深色标注区域为LINC00472基因启动子区域CpG岛。

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  图9 各组LINC00472 CpG位点甲基化状态

  Figure 9.Methylation status of LINC00472 CpG sites across different groups

  注：A. NC组；B. DAC组；C. Control组；D. sh-DNMT1组；单个位点甲基化率和总甲基化率；黑色条带为甲基化克隆比例；横轴标记了该基因29个CpG位点，纵轴为每个CpG位点的10个克隆。

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3 讨论

研究发现，在儿童骨肉瘤中，DNA甲基化与肿瘤疾病的治疗结果有关，在肿瘤复发的儿童骨肉瘤组织中，发现启动子和非启动子位点都可能发生甲基化^［11］。在乳腺癌中，CpG岛甲基化与LINC00472表达呈负相关，即高甲基化、低表达^［5］。同时在胃癌的研究中发现，LINC00472可通过DNA甲基化进行表观遗传调控，且LINC00472上游的CpG区易发生肿瘤特异性的高甲基化^［4］。本研究首先采用MSP检测各组LINC00472启动子区域均发生完全非甲基化，但因MSP检测目标仅针对引物设计的1~2个特定CpG位点，需甲基化水平 ≥ 10%~20%才能检出（假阴性风险高）。BSP测序覆盖目标区域所有CpG位点，BSP可检测低至5%的甲基化水平，故考虑利用BSP进一步验证，结果证明MG-63细胞中LINC00472启动子区域甲基化水平为1.7%（低于5%），本研究首次揭示了LINC00472在骨肉瘤MG-63细胞中的独特甲基化特征，发现MG-63细胞中LINC00472启动子区呈现极低甲基化状态，这一现象提示LINC00472的甲基化调控具有显著的肿瘤异质性。DAC是临床常用的甲基化抑制剂，能诱导骨肉瘤细胞miR-23a、miR-129-5p及miR-142分子的高表达^［12-14］。因本课题前期已完成DAC对MG-63细胞功能学相关的实验，故本文章的主要目的是初步探究在MG-63细胞中LINC00472表达是否受DNA甲基化调控。利用DAC处理MG-63细胞后，发现LINC00472过表达且检测区域发生完全非甲基化，证实LINC00472可受甲基化调控，但因LINC00472启动子区域的甲基化水平极低，DAC对LINC00472的调控可能并非主要通过直接去甲基化其启动子区域，而更可能通过其他非甲基化途径间接实现。DNMT1下调可抑制食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭^［15］。Wu等^［16］研究也表明，DNMT1在喉鳞状细胞癌中也具有重要作用。特别是在骨肉瘤的研究中，DNMT1高表达，且为miR-148a的靶点，沉默DNMT1增加了骨肉瘤细胞对抗肿瘤药物蟾毒灵的敏感性^［8］；而miR-139-5p通过降低DNMT1抑制骨肉瘤的进展^［17］；同时，DNMT1的异常激活导致了miR-34a的启动子甲基化，引起miR-34a的低表达^［18］。由以上研究结果推测，DNMT1在骨肉瘤中可能扮演重要的角色，故本研究利用慢病毒沉默MG-63细胞中的DNMT1，发现MG-63细胞的增殖、迁移和侵袭能力被抑制，但仅轻微降低LINC00472启动子甲基化水平且未显著影响其表达，提示在骨肉瘤MG-63细胞中LINC00472表达受DNMT1基因的调控很弱。

综上，本研究揭示了LINC00472在MG-63细胞中的独特甲基化特征，即LINC00472在MG-63细胞中呈极低甲基化水平；发现了DAC处理MG-63细胞可诱导LINC00472表达上调并使其启动子完全去甲基化，证实了LINC00472可能受甲基化调控，但在骨肉瘤MG-63细胞中不是主要途径；沉默DNMT1抑制MG-63细胞生长和功能，但对LINC00472的表达或甲基化水平无明显影响，可能与LINC00472在MG-63细胞中本身低甲基化有关。本文不足之处在于相关结论仅基于MG-63细胞，后续研究可拓展至不同骨肉瘤细胞系和动物实验进一步验证和探究，以期更全面阐明骨肉瘤中LINC00472表达和甲基化的关系。

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