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目的 构建一种N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与环状GRD衍生肽（iRGD肽）双配体共修饰的小干扰RNA（siRNA）药物，并系统评价其理化性质及体外生物学功能。
方法 以通用可控孔玻璃/GalNAc为载体，采用固相合成技术制备GalNAc单修饰的siRNA靶向Polo样激酶1（GalNAc-siPLK1）；进一步通过点击化学反应，定点偶联iRGD肽段，获得GalNAc与iRGD肽双配体共修饰的siPLK1（GalNAc-siPLK1-iRGD）。通过核酸酶稳定性实验、细胞摄取实验、细胞毒性实验、实时荧光定量PCR及Western blotting等技术，对GalNAc-siPLK1-iRGD的稳定性、细胞内化能力、细胞杀伤能力及基因沉默效率进行综合评价。
结果 成功合成GalNAc-siPLK1-iRGD。该双配体修饰产物表现出良好的核酸酶抗性，可有效保护siPLK1免受降解。与未修饰siPLK1及单修饰GalNAc-siPLK1相比，GalNAc-siPLK1-iRGD在HepG2细胞中的摄取量显著提高，细胞毒性明显增强，并展现出更强的PLK1 mRNA及蛋白表达沉默能力。
结论 GalNAc与iRGD肽双配体共修饰策略可显著提升siPLK1的稳定性、细胞摄取效率、细胞杀伤能力以及基因沉默效应，表明该构建策略在肝细胞癌靶向治疗中具有良好应用前景。
肝细胞癌作为原发性肝癌最常见的病理类型，发病率和死亡率持续居高，临床治疗仍面临重大挑战［1］。相较于手术切除、局部介入及传统全身治疗等现有手段，基因治疗在肝细胞癌治疗中展现出独特的理论优势与转化潜力［2］。基因治疗具有高度特异性，有望显著降低对正常肝组织及全身系统的毒副作用［3］。此外，基因治疗可通过理性设计突破索拉非尼等靶向药物的耐药困境，且作用不依赖于患者免疫状态，干预路径更为直接［4-5］。基因治疗主要通过递送DNA、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）及寡核苷酸等不同形式的核酸分子来实现其治疗目的［6］。siRNA靶向Polo样激酶1（siRNA targeting Polo-like kinase 1，siPLK1）通过靶向并干扰丝氨酸/苏氨酸激酶PLK1的表达，进而抑制癌细胞增殖并诱导凋亡，因此有望实现对肝细胞癌的高效治疗［7］。
尽管siPLK1在肝细胞癌治疗中前景广阔，但其体内应用受限于核酸稳定性差与细胞摄取难两大瓶颈［8-9］。现有病毒及脂质体等纳米载体虽可部分改善递送效率，但普遍仍面临靶向性不足与生物安全性欠佳等共同挑战［10-11］。N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）作为当前核酸药物肝脏靶向递送的核心技术平台，广泛应用于临床前及临床研究，其通过特异性识别肝细胞表面高表达的去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）来实现核酸药物的高效肝脏递送［12］。然而，在肝细胞癌治疗场景中，GalNAc靶向策略面临重要挑战：肝癌细胞ASGPR表达水平较正常肝细胞显著下调，导致核酸药物在肿瘤部位的富集效率受限，进而影响疗效［13-15］。为进一步优化GalNAc的肝癌递送效能，研究者正致力于开发双重靶向策略，该策略在保留GalNAc肝脏定向能力的同时，引入肿瘤特异性识别基团，构建可实现器官级富集与细胞级内化的复合递送系统。其中，iRGD肽是一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的环状内化性靶向多肽，具有优异的肿瘤穿透能力，能特异性识别肿瘤血管内皮细胞表面高表达的整合素αvβ3，介导iRGD肽穿透肿瘤组织的细胞外基质，深入肿瘤内部，实现肿瘤穿透功能［16-17］。
为此，本研究在利用GalNAc实现肝脏初步富集的基础上，进一步引入iRGD肽作为第2个配体，共同修饰于siPLK1，构建了双重修饰的GalNAc-siPLK1-iRGD。该设计一方面通过ASGPR途径实现肝脏富集，另一方面借助iRGD肽增强肿瘤穿透与细胞摄取，从而弥补ASGPR在肝癌细胞中表达下调所导致的递送不足。通过二者的协同作用，有望提升核酸药物在肝癌病灶中的蓄积与疗效，为肝细胞癌的精准治疗提供新思路。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器
Oligo 48合成仪（美国ABI公司）；DYCP-31B水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；ProXima 280化学发光成像系统（荷兰Isogen公司）；Eclipse Ti DS-Ri2倒置荧光显微镜（日本尼康株式会社）；V30R台式高速冷冻离心机［天美（中国）科学仪器有限公司］；Nano100超微量紫外-可见光分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）；QuantStudio 1荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；SVE-2垂直电泳仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）；LTQ Orbitrap XL高分辨质谱仪（美国ThermoFisher公司）；1260 Infinity II高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；MS204TS/02电子天平（瑞士梅特勒-托利多国际有限公司）。
1.2 主要药品与试剂
核苷亚磷酰胺单体（化学纯，批号：IFDGP28A18）和Universal CPG （孔径：1 000 Å，批号：20240803）购自上海兆维科技发展有限公司；siPLK1（苏州贝信生物技术有限公司，正义链：5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3'；反义链：5'-UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU-3'，批号：YKY0401）；iRGD肽（上海强耀生物科技有限公司，序列：CRGDKGPDC，批号：P240307-XT1139863）；三氯乙酸（批号：2403124000）、5-乙硫基-1H-四氮唑（批号：2401283000）、N-甲基咪唑（批号：2311170600）、乙酸酐（批号：2410090800）、氢化黄原素（批号：2411084000）、THPTA（批号：2408170500）、CuSO₄·5H₂O（批号：2405180042）、维生素C钠（批号：2409002405）均购自苏州柯乐玛生物技术有限公司；琼脂糖（上海阿拉丁试剂有限公司，批号：G2320222）；GelstainRedTM核酸染料（美国UE公司，批号：220929L01-15）；RNA酶A溶液（美国赛默飞世尔科技有限公司，批号：W9715）；RNA酶抑制剂（批号：03112220712）、DAPI染色液（批号：072723240227）、4%的多聚甲醛溶液（批号：A609250622）、胰酶细胞消化液（批号：A608250710）、CCK-8试剂盒（批号：A664250716）均购自上海碧云天生物技术有限公司；Hepg2细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：WHAA24D048）；TRNzol Universal总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司，批号：X1220）；HiFiScript cDNA Synthesis Kit（批号：CW2569M）和UltraSYBY Mixture（批号：CW0957M）购自北京康为世纪生物科技有限公司；PLK1引物（正向引物：5'- CTGGAGGTG AAAATAGGGGATTT-3'，反相引物：5'-AGGTG GTTTGCCCACTAACA-3'）和GAPDH内参引物（正向引物：5'-GTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'；反相引物：5'-GCAACAATATCCACTTTACCAGA GT-3'）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；RIPA裂解液（批号：G2002）、BCA蛋白定量检测试剂盒（批号：G2026）、ECL发光液（批号：G2161）、β-actin兔抗体（批号：GB15003）和HRP-山羊抗兔二抗（批号：GB23303）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；PLK1兔抗体（Cell Signaling Technology，批号：4513）；氨水、三乙胺、二甲基亚砜、乙腈、吡啶、二氯甲烷、碳酸钠、异丙醇、无水乙醇、氯仿、冰乙酸、乙二胺四乙酸二钠二水合物（Na2EDTA·2H2O，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
1.3 细胞
HepG2细胞来自中国科学院细胞库。
2 方法与结果
2.1 GalNAc-siPLK1-iRGD的合成
参考相关文献［18］，采用固相合成法进行GalNAc-siPLK1-iRGD的合成。在合成仪上导入需要合成的序列，以Universal CPG/GalNAc为载体，沿3'→5'方向依次偶联核苷单体。亚磷酰胺单体以100 mmol/L或200 mmol/L的浓度溶解于无水乙腈中，并加入分子筛浸泡24 h以上，以去除体系中微量水分。每连接1个亚磷酰胺单体均包含脱保护、偶联、盖帽、氧化（或硫代）4步反应。具体合成条件如下：
（1）脱保护。使用含3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液，脱除固相载体上核苷酸5'-OH的保护基团，反应时间60 s。
（2）偶联。使用0.3 mol/L的5-乙硫基-1H-四氮唑的乙腈溶液，使亚磷酰胺单体与暴露的5'-OH反应形成磷酸三酯键，偶联时间300 s。
（3）盖帽。采用CAP A与CAP B的混合溶液（体积比1∶1）。CAP A为含20%N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，CAP B为含20%乙酸酐的乙腈溶液。用于封闭未反应的5'-OH基团，盖帽时间20 s。
（4）氧化/硫代。氧化反应使用0.05 mol/L的碘液，反应时间25 s；硫代反应使用0.2 mol/L氢化黄原素的吡啶溶液，反应时间200 s。
（5）待最后一个核苷单体连接完成后，将干燥的固体支撑物加入25%的氨水溶液中，在55 ℃下反应16 h，固相载体用乙醇/水洗涤2次，离心浓缩后用无RNA酶水溶解过滤后进行纯化。
（6）采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，纯化条件：色谱柱为Waters XBridge C18（150 mm × 4.6 mm，3.5 µm）；流动相为0.1 mol/L醋酸三乙胺（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~1 min，0% B；1~25 min，0%→30% B；25~26 min，30%→65% B；26~27 min，65% B；27~28 min，65%→0% B）；流速为0.8 mL/min；检测波长为260 nm；柱温为60 ℃；进样量为10 µL。对纯化后收集的馏分分别进行HPLC、质谱（MS）及UV检测。MS参数设置如下：加热温度为40 ℃，喷雾电压为4 kV；鞘气、辅助气及吹扫气流量分别设定为30、10、0 arb；毛细管温度为300 ℃，毛细管电压为10 V，管状透镜电压为-150 V。UV检测以260 nm为检测波长对核酸进行定量测定。根据检测结果筛选出合格的馏分，合并后进行冻干处理，最终获得经2'-氟代修饰、2'-甲氧基修饰及硫代磷酸酯修饰的GalNAc-siPLK1单链骨架。
将GalNAc-siPLK1单链溶于缓冲盐溶液，加入iRGD肽［CRGDKGPDC，20当量（eq），DMSO溶解］，涡旋混匀。加入THPTA/CuSO₄·5H₂O（5∶1，15 eq/3 eq），40 ℃振荡5 min；随后迅速加入维生素C钠（25 eq），涡旋后于40 ℃反应2 h。经粗品检测与纯化，得到目标单链。将目标单链与反义链按1∶1摩尔比混合于退火缓冲液，90 ℃变性5 min，缓慢降温至20 ℃，冻干后获得iRGD肽修饰的GalNAc-siPLK1-iRGD双链核酸。合成路线见图1。
HPLC分析结果如图2所示，终产物的洗脱峰形尖锐、对称，且无明显的杂峰或非特异性聚集峰。与未修饰的siPLK1及GalNAc-siPLK1的色谱行为相比，终产物呈现独特的保留时间偏移，进一步证明结构修饰的成功。面积归一化法色谱分析结果显示，GalNAc-siPLK1-iRGD的纯度均在95%以上，表明目标产物纯度较高，完全满足后续体外及体内实验的要求。
按照上述步骤成功合成了GalNAc-siPLK1-iRGD。为了验证 GalNAc-siPLK1-iRGD的正确合成并评估其纯度，对终产物进行了MS和HPLC分析，并以未修饰的siPLK1及GalNAc-siPLK1作为对照。MS分析结果如图3所示，GalNAc-siPLK1-iRGD的正义链实测分子量为9 210.0 Da，与未修饰的siPLK1及GalNAc-iRGD相比，终产物的分子量显著增大，且与理论分子量一致，这证实了GalNAc与iRGD肽2个配体成功共价连接至了siPLK1的正义链上，表明目标复合物GalNAc-siPLK1-iRGD的成功合成。
2.2 酶稳定性实验
参考相关文献［19］，采用琼脂糖凝胶电泳试验对GalNAc-siPLK1-iRGD在核酸酶中的酶稳定性进行研究。将GalNAc-siPLK1-iRGD溶液稀释100倍，取稀释后的溶液4 µL，加入0.1 mg/mL的RNA酶A溶液4 µL，然后在37 ℃条件下孵育2 h后，加入RNA酶抑制剂（40 U/µL）终止反应，GalNAc-siPLK1和未修饰的siPLK1同法操作作为对照，最后用灭菌水将复合物稀释至适合浓度进行琼脂糖凝胶电泳实验。另外，未经处理的GalNAc-siPLK1-iRGD、GalNAc-siPLK1和未修饰的siPLK1也直接上样进行琼脂糖凝胶电泳，通过成像仪观察其电泳条带。
酶稳定性实验结果如图4所示。在未与RNase孵育前，GalNAc-siPLK1-iRGD、GalNAc-siPLK1和未修饰的siPLK1均可观察到清晰的电泳条带。其中，siPLK1与GalNAc-siPLK1在凝胶中的条带位置不同，主要归因于GalNAc偶联后分子表观分子量、空间构象及电泳迁移特性的改变。与RNase孵育后，未修饰的siPLK1被完全降解，电泳图中未见明显条带；而经骨架修饰的GalNAc-siPLK1-iRGD和GalNAc-siPLK1仍可见清晰条带，表明二者未被核酸酶降解。该抗降解能力主要源于2个方面：一是siPLK1骨架上引入了2'-氟代修饰、2'-甲氧基修饰及硫代磷酸酯修饰；二是共价连接的多肽（iRGD肽）和糖簇（GalNAc）位于siPLK1正义链末端，其较大的分子基团在空间上可物理性遮挡siPLK1末端的磷酸二酯键，从而有效保护核酸骨架免受酶切攻击。
2.3 细胞摄取实验
在固相合成反义链时，于其5'-端引入Cy5荧光基团。标记后的反义链经脱保护、RP-HPLC纯化并经MS确认后，与正义链按1∶1摩尔比退火形成Cy5标记双链siPLK1，用于后续细胞摄取实验。通过荧光显微镜观察GalNAc-siPLK1-iRGD的入胞情况。将HepG2细胞以5×104 个/孔的密度接种于24孔板中，在培养箱中培养24 h后，每孔分别加入200 nmol/L的GalNAc-siPLK1-iRGD、GalNAc-siPLK1及siPLK1。培养4 h后，弃掉培养基，用500 µL PBS洗涤3次，之后每孔加入500 µL 4%的多聚甲醛溶液固定细胞15 min，固定结束后再向每孔加入500 µL DAPI溶液（1 µg/mL）染细胞核2~5 min，染色结束后同样用PBS洗涤3次。最后将24孔板置于荧光显微镜下观察。
细胞摄取实验结果如图5所示。Cy5荧光成像显示，未经修饰的siPLK1组细胞内红色荧光信号较弱，表明其被细胞摄取较少。相比之下，GalNAc-siPLK1组细胞中可观察到显著的红色荧光聚集，证明GalNAc修饰能有效促进细胞对siRNA的内化。而双配体修饰组（GalNAc-siPLK1-iRGD）的荧光信号强度进一步显著增强，且在细胞质中分布更为广泛，说明iRGD肽的引入进一步提升了siRNA的细胞摄取效率。以上结果证实，GalNAc与iRGD肽的双重修饰策略可协同增强siPLK1的细胞内化能力，且GalNAc-siPLK1-iRGD具有最优的入胞效果。
2.4 细胞毒性实验
通过细胞毒性实验检测GalNAc-siPLK1-iRGD对肿瘤细胞的杀伤作用。将肝癌HepG2细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，分别加入400 nmol/L的siPLK1、GalNAc-siPLK1和GalNAc-siPLK1-iRGD，在无血清无双抗的培养基中孵育4 h；然后用等体积的含血清培养基代替无血清培养基，并继续孵育48 h；向每孔加入10 µL CCK-8溶液，于培养箱中孵育2 h后，使用多功能酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度（A）值。以空白孔调零，计算各孔扣除本底后的A值，并将实验组结果与未经药物处理的对照组细胞进行比较。按下式计算细胞存活率：
其中，A样品为加药处理后的A值；A对照为对照孔（加细胞，不加药物）的A值；A空白为空白孔（不加细胞和药物）的A值。
每组设置6个复孔，实验独立重复3次。数据以
表示，使用GraphPad Prism 6.01软件进行统计学分析，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析（ANOVA），P < 0.05为差异有统计学意义。
细胞毒性实验结果如图6所示。与PBS对照组相比，单独使用siPLK1的细胞存活率为70%；经GalNAc修饰后，GalNAc-siPLK1组的存活率进一步下降至45%；而当采用GalNAc与iRGD肽进行双配体共修饰后，GalNAc-siPLK1-iRGD组的细胞存活率显著降低至21%。结果证实，GalNAc与iRGD肽双配体共修饰策略能显著增强siPLK1对肿瘤细胞的杀伤作用。
2.5 实时荧光定量PCR实验
通过实时荧光定量PCR（qPCR）实验检测GalNAc-siPLK1-iRGD的沉默肿瘤基因的效果。将肝癌HepG2细胞以3×105个/孔接种至6 孔板中，分别加入400 nmol/L的siPLK1、GalNAc-siPLK1和GalNAc-siPLK1-iRGD，在无血清无双抗的培养基中孵育4 h，然后用等体积的含血清培养基代替无血清培养基，并继续孵育48 h；随后，收集转染过后的HepG2细胞，并使用总RNA提取试剂提取RNA，之后进行总RNA的逆转录，最后进行qPCR实验，以β-actin为内参，测定PLK1 mRNA表达水平的变化。每组设置6个复孔，实验独立重复3次。
qPCR实验结果如图7所示，siPLK1组、GalNAc-siPLK1组及GalNAc-siPLK1-iRGD组中PLK1 mRNA的相对表达水平分别为0.54、0.35、0.15。与未修饰的siPLK1相比，GalNAc修饰使PLK1 mRNA表达降低至35%，而GalNAc与iRGD肽双修饰进一步将表达量抑制至15%，较siPLK1组下降约72%。该结果证实，GalNAc-siPLK1-iRGD通过协同增强细胞靶向与内吞效率，实现了对PLK1 mRNA的高效沉默，显著优于单一修饰或未修饰组。
2.6 Western blotting实验
通过Western blotting实验检测GalNAc-siPLK1-iRGD沉默PLK1蛋白的效果。将肝癌HepG2细胞以3×105个细胞/孔接种至6 孔板中，在培养箱中培养过夜后，每孔分别加入400 nmol/L的siPLK1、GalNAc-siPLK1和GalNAc-siPLK1-iRGD，在无血清无双抗的培养基中孵育4 h，然后用等体积的含血清培养基代替无血清培养基，并继续孵育48 h；随后收集细胞，用预冷PBS洗涤2次，通过RIPA裂解液提取总蛋白；蛋白样品经BCA法定量、变性后，进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，依次进行封闭、一抗孵育（稀释比例1∶5 000）、二抗（荧光标记）孵育（稀释比例1∶5 000）及荧光成像检测。以β-actin为内参，通过灰度分析评估GalNAc-siPLK1-iRGD的基因沉默效率。
结果如图8所示，与空白细胞相比，GalNAc-siPLK1能显著降低HepG2细胞中PLK1蛋白的表达水平（P < 0.01），表明GalNAc-siPLK1能进入细胞发挥蛋白沉默作用；进一步引入iRGD肽后，GalNAc-siPLK1-iRGD表现出更强的蛋白沉默效果，其PLK1蛋白表达水平较GalNAc-siPLK1组进一步下降（灰度值比值由0.43降低到0.36，P < 0.01），提示iRGD肽修饰可协同增强GalNAc介导的靶向递送与细胞摄取。上述结果表明，GalNAc与iRGD肽的双重修饰策略可协同增强siPLK1的蛋白沉默效能。
3 讨论
尽管ASGPR在正常肝细胞高表达，但在肝癌发生发展过程中，特别是在去分化的肝癌细胞中，ASGPR表达水平显著下降，这正是传统GalNAc-siRNA系统治疗肝癌的瓶颈所在。为此，本研究设计了GalNAc与肿瘤穿透肽iRGD肽共修饰的新型siRNA递送系统，一方面保留GalNAc的肝脏定向能力；另一方面通过引入iRGD使siRNA穿透肿瘤组织的能力增强，从而同时实现器官靶向与增强肿瘤穿透。本研究结果表明，所构建的双配体修饰siRNA系统可有效抵抗核酸酶降解，为siRNA在体内复杂环境中的稳定存在奠定了基础。体外细胞实验进一步证实，相比于单独使用GalNAc修饰的siRNA，采用iRGD肽介导的双配体修饰策略能显著提高细胞的内吞效率，充分体现了2种内吞途径之间的协同效应。此外，该双修饰策略通过增强siRNA的细胞摄取效率，不仅有效提升了其对肿瘤细胞的杀伤能力，也在基因和蛋白水平上实现了更显著的沉默效果。
另外，本研究目前仍存在一定局限性。首先，所有功能实验均基于体外HepG2细胞模型，缺乏体内生理微环境对递送系统行为的影响数据，GalNAc与iRGD肽双重修饰策略的协同作用尚未在活体水平得到验证。其次，在安全性评价方面，本研究存在明显缺口：一是未检测该双修饰系统对正常肝细胞及其他重要器官来源细胞的体外毒性，无法排除其潜在的脱靶损伤；二是未评估其免疫原性，而iRGD肽作为肿瘤穿透肽可能非预期激活免疫反应，引发细胞因子释放等不良事件；三是硫代磷酸酯修饰虽能增强siRNA稳定性，但其在体内的累积毒性和长期安全性亦需关注。因此，后续研究亟需在动物模型中系统开展药动学、组织分布、抗肿瘤药效及全面安全性评价（包括一般毒性、靶器官毒性、免疫原性及脱靶效应），以更完整地评估该双修饰递送系统的临床应用前景。
综上所述，本研究为突破传统GalNAc系统的应用局限提供了新策略，该双配体协同递送系统展现出作为新型肝癌靶向治疗平台的潜力。
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