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目的 建立荆竹清解颗粒特征图谱和指标成分含量测定方法，完善荆竹清解颗粒质量标准。
方法 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸水-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为280 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 µL，柱温为30 ℃，构建荆竹清解颗粒HPLC特征图谱，并对10批样品进行相似度评价、聚类分析和主成分分析。含量测定中连翘酯苷A的检测波长为327 nm，牛蒡苷的检测波长为280 nm，其余色谱条件同特征图谱，测定荆竹清解颗粒指标成分含量。
结果 建立了荆竹清解颗粒的HPLC特征图谱，确定了8个特征峰并指认出7个成分。10批荆竹清解颗粒特征图谱与对照特征图谱间相似度均大于0.85，聚类分析和主成分分析将样品分为3大类。10批颗粒中连翘酯苷A含量为1.30~1.94 mg/g，牛蒡苷含量为3.00~9.35 mg/g。
结论 建立的荆竹清解颗粒特征图谱和含量测定方法稳定可行，可为其质量控制提供数据支撑。
荆竹清解方由荆芥、防风、生石膏、连翘、蒲公英、紫花地丁、淡竹叶、芦根、桔梗、燀苦杏仁、牛蒡子、鸡内金、焦山楂和甘草共14味药组成，具有解表清热、宣肺止咳的功效，该方用于临床多年，对小儿外感发热症具有良好的治疗作用。荆竹清解颗粒是在临床经验方基础上采用现代制药技术开发的新品种，为对其工业化生产进行有效质量控制，亟待建立相关质量评价方法。中药复方制剂化学成分种类繁多、相互作用复杂，且受原料、工艺等多重因素影响，其质量控制一直是行业难点。中药特征图谱作为一种整体性强、专属性明确且结果可量化的分析方法，能够系统表征复方中化学成分群的整体特征［1-3］。聚类分析和主成分分析作为常见的化学计量学分析方法，凭借其数据降维的分析优势，常与中药特征图谱联用，广泛应用于中药质量评价及整体质量控制体系中［4-7］。连翘酯苷A作为处方臣药连翘的主要药效物质，能通过调节多条信号通路发挥抗菌、抗炎等活性［8-10］；牛蒡苷是牛蒡子的主要成分之一，研究表明其具有抗菌、抗炎、抗病毒等多种药理作用［11-13］。建立同时测定此2种成分的质控方法，科学地保障荆竹清解颗粒的临床疗效。本研究综合运用特征图谱的整体性评价以及指标成分的含量测定，构建了一个点面结合、信息互补的荆竹清解颗粒质量综合评价体系，为其质量稳定可控提供了有力数据支撑。
1 仪器与试药
1.1 主要仪器
Waters ACQUITY Arc-HPLC高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Thermo Vanquish高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；ME104E、MS1050U型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-5000DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 主要药品与试剂
对照品连翘酯苷A（批号：111810-202209，纯度96.4%）、牛蒡苷（批号：110819-202213，纯度99.0%）、秦皮乙素（批号：110741-201708，纯度99.9%）、咖啡酸（批号：110885-201703，纯度99.7%）、菊苣酸（批号：111752-201703，纯度97.6%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品5-羟甲基糠醛（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：67-47-0，纯度89.2%）；对照品连翘酯苷Ⅰ（成都德思特生物技术有限公司，批号：DSTDL011201，纯度99.05%）；乙腈、磷酸为色谱纯；甲醇为分析纯；水为超纯水。
14味药均各采购3批次原药材（药材信息见表1，各药材经湖南春光九汇现代中药有限公司执业中药师戚苗鉴定，结果均与表中所列基原一致），按照随机数法进行组合，生成3组复方组合，按照相关生产工艺共制成10批次荆竹清解颗粒，批号分别为ZS71250604、ZS71250605、ZS71250606、KL250504、KL250505、KL250506、KL250705、KL250706、KL250707、KL250708，编号S1~S10（其中S1~S3为复方组合1投料制备，S4~S6为复方组合2投料制备，S7~S10为复方组合3投料制备）。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液
特征图谱对照品溶液：取连翘酯苷A、菊苣酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含连翘酯苷A30 µg、含菊苣酸20 µg的溶液；取牛蒡苷、秦皮乙素、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含牛蒡苷180 µg、含秦皮乙素10 µg、咖啡酸10 µg的溶液，即得。
含量测定对照品溶液：取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含30 µg的溶液（临用配制）。取牛蒡苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含180 µg的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液
荆竹清解颗粒供试品溶液：取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。
各单药味供试品溶液：称取处方各14味药适量，分别置于煎药壶中，加12倍量水，武火煮沸后文火微沸煎煮2 h，120目筛网过滤；滤渣加入10倍量水煎煮1 h，120目筛网滤过，滤液合并后65 ℃减压浓缩获得单味药浓缩液，进一步冷冻干燥获得各药味冻干粉。分别称取各药味冻干粉约0.5 g，按照上述方法同法制备各单药味供试品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，8%→15% B；15~32 min，15% B；32~40 min，15%→28% B；40~47 min，28% B；47~60 min，28%→80% B）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 µL；检测波长：280 nm（特征图谱和牛蒡苷含量测定）、327 nm（连翘酯苷A含量测定）。
2.3 特征图谱方法学验证
2.3.1 精密度试验
取同一份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液重复进样6次，以峰5（连翘酯苷A）为参照（S）峰，计算其他共有峰相对保留时间的RSD为0.04%~0.14%（n=6），结果表明仪器精密度良好。
2.3.2 重复性试验
重复制备6份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液，以峰5为S峰，计算其他共有峰相对保留时间的RSD为0.03%~0.06%（n=6），结果表明方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液，于配制后的0、3、6、9、12、24 h进样测定，以峰5为S峰，计算其他各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%~0.15%（n=6），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.4 耐用性试验
取荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液，采用不同柱温（25、30、35 ℃）进行测定，以峰5为S峰，计算其他共有峰相对保留时间的RSD为0.82%~3.63%（n=3），结果表明本方法对不同柱温具有良好的耐用性；采用不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）进行测定，以峰5为S峰，计算其他共有峰相对保留时间的RSD为0.29%~3.13%（n=3），结果表明本方法对不同流速具有良好的耐用性。
2.4 特征图谱的建立
2.4.1 共有峰的标定、归属及相似度分析
对10批荆竹清解颗粒进行图谱测定，并将原始数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版进行匹配，按中位数法生成对照图谱，建立荆竹清解颗粒对照特征图谱，结果见图1。选择出峰形和分离度好、峰稳定的8个共有峰作为特征峰。将荆竹清解颗粒制剂特征图谱与处方各单味药特征图谱进行叠加比对，对各峰进行药味归属，并经对照品指认，峰1为5-羟甲基糠醛，峰2为秦皮乙素，峰3为咖啡酸，峰5为连翘酯苷A，峰6为菊苣酸，峰7为牛蒡苷，结果见图2与表2。计算S1~S10各编号批次的特征图谱与荆竹清解颗粒对照图谱的相似度，结果分别为0.917、0.907、0.931、0.892、0.890、0.893、0.923、0.930、0.944、0.944，均大于0.85，提示荆竹清解颗粒的制剂制备工艺稳定可控。
2.4.2 计量学分析
以10批次荆竹清解颗粒的各8个共有特征峰峰面积为变量，采用SIMCA 14.1软件进行聚类分析，结果如图3-A所示，当距离为10时，10批次样品可以分为3大类，其中S1~S3为一类，S4~S6为一类，S7~S10为一类；继续采用SIMCA 14.1软件进行主成分分析，结果如图3-B所示，与聚类分析结果完全一致，溯源不同制剂制备原料组合，该分类趋势与实验设计的3组复方投料组合保持一致，表明制剂制备工艺具有良好的重复性和稳定性，而不同组间的差异主要来源于原料差异。
2.5 指标成分含量测定
2.5.1 线性关系考察
取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含178.147 2 μg的溶液，另取牛蒡苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含413.622 μg的溶液，二者均作为对照品母液，各依次稀释2、4、8、16、32倍后进样测定，记录各自峰面积。以2指标成分的浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得连翘酯苷A、牛蒡苷的回归方程依次为：Y=1.741×X-8.079×（r=0.999 9），Y=5.497×X-9.346×（r=0.999 9），结果表明，连翘酯苷A和牛蒡苷分别在5.567~178.147、12.926~413.622 μg/mL范围内线性关系良好。
2.5.2 精密度试验
取同一份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液重复进样6次，记录连翘酯苷A和牛蒡苷峰面积，结果显示峰面积RSD分别为0.70%和0.08%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5.3 重复性试验
重复制备6份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液进样测定，记录连翘酯苷A和牛蒡苷峰面积并计算其含量，结果显示平均含量分别为1.376 8、8.609 6 mg/g，RSD分别为0.64%和0.50%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.5.4 稳定性试验
取同一份荆竹清解颗粒（编号：S2）供试品溶液，于配制后的0、3、6、9、12、24 h进样测定，记录连翘酯苷A和牛蒡苷峰面积，结果显示峰面积RSD分别为0.52%和0.07%（n=6），表明供试品在24 h内稳定性良好。
2.5.5 加样回收率试验
称取已知含量的荆竹清解颗粒（编号：S2）9份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入连翘酯苷A、牛蒡苷配制80%、100%和120%浓度的回收率试供试品溶液，各浓度平行制备3份，进样测定并记录连翘酯苷A、牛蒡苷峰面积，计算其加样回收率分别为98.36%和101.18%，RSD分别为0.99%和0.49%（n=9），结果表明该方法加样回收率良好。
2.5.6 样品含量测定
按照“2.1.2”项下方法制备10批荆竹清解颗粒供试品溶液，再按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录连翘酯苷A和牛蒡苷的峰面积并计算含量，结果见表3。10批荆竹清解颗粒的连翘酯苷A含量实测值为1.30~1.94 mg/g，均值为1.74 mg/g，标准差为0.27 mg/g；牛蒡苷含量实测值为3.00~9.35 mg/g，均值为5.39 mg/g，标准差为2.61 mg/g。
3 讨论
样品制备优化方面，本研究对不同提取方式（超声提取、回流提取）、不同提取溶剂（不同浓度的甲醇、乙醇溶液）、不同提取时间（20、30、40 min）、不同溶剂用量（10、25、50 mL）进行考察，以特征峰响应、峰形、峰个数、指标成分含量为评价指标，最终优选出制备方式为采用25 mL的50%甲醇超声提取样品30 min。色谱条件方面，全波长扫描发现在280 nm波长下，各色谱峰信息量大，相对响应均较高，分离情况良好，故选择280 nm为特征图谱检测波长，而连翘酯苷A和牛蒡苷分别在327 nm和280 nm下具有最大吸收；此外，对乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸3种流动相体系进行考察，结果显示乙腈-0.1%磷酸体系下各特征峰均响应良好，而其他体系下有几个特征峰未达到检测限，无法进行识别。
在10批荆竹清解颗粒样品的指标成分含量测定中发现，连翘酯苷A批次间含量差异相对较小，而牛蒡苷含量差异则较大，溯源分析表明，颗粒中2种成分的差异大小分别与原料药材（连翘、牛蒡子）对应成分的批次间波动程度相关，故而在后续生产中需要加强对药材质量的控制。此外，复方制剂的质量稳定性不仅取决于单味药材自身的质量，还受组方药味的产地差异、批次波动等单味药特性所带来的复方层面共同作用影响。本研究结果显示在相同工艺条件下，同一原料组合的重复制备样品表现出良好的相似度与聚类一致性，不同原料组合的样品在聚类和主成分分析中呈现清晰的分组分离，表明所建立的指纹图谱结合化学计量学模型具备高灵敏度的原料差异区分能力，能够有效识别因产地、批次等因素引起的化学信号漂移，可作为荆竹清解颗粒质量追溯与过程监控的有效工具。为进一步提高复方制剂批次间质量均一稳定性，建议从源头加强药材生长年限、采收期等与质量关联因素的基础研究，并对不同来源、不同批次的原料药材开展系统的多批次质量检测与化学相似度评估，据此设定合理的原料准入阈值，在此基础上，通过多批次饮片按比例混合搭配，获得均一化饮片，实现原料质量的稳定化与均一化，从而确保大生产过程中复方成品质量的持续稳定［14-15］。本研究中3组原料组合的化学差异数据，可为后续制定荆竹清解颗粒生产用饮片的混批比例与均一化投料方案提供重要参考依据。
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