目的 基于网络药理学与分子动力学模拟方法，探究健脾通窍方治疗儿童过敏性鼻炎的活性成分、作用靶点及潜在分子机制。

方法 通过PubChem、HERB数据库检索健脾通窍方（太子参、茯苓、白术、山药、辛夷、苍耳子、陈皮、甘草）的化学成分，利用ADMETlab 3.0平台筛选潜在活性成分（Lipinski类药五规则、口服生物利用度20%参数预测的F20% < 0.7、血浆蛋白结合率 < 90%）。使用SwissTargetPredictiong平台预测成分靶点；通过GeneCards、OMIM数据库检索儿童过敏性鼻炎疾病靶点；取交集后得到潜在治疗靶点。利用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及“中药-成分-靶点-疾病”网络。通过R软件进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。采用AutoDock Vina软件进行分子对接，并对优选复合物进行100 ns分子动力学模拟（GROMACS）。

结果 筛选获得健脾通窍方潜在活性成分365个、对应靶点1 220个，以及儿童过敏性鼻炎疾病靶点312个，二者取交集后得到76个共同靶点。PPI网络显示核心靶点为蛋白激酶Bα（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤蛋白p53（TP53）、白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）等。KEGG富集分析提示磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路为最关键通路。分子对接表明核心成分与靶点蛋白结合良好（结合能< -9 kcal/mol），分子动力学模拟进一步证实EGFR-灵芝酸A、基质金属蛋白酶-9（MMP9）-芹菜素三甲醚复合物体系稳定。

结论 健脾通窍方可能通过多成分（如芹菜素三甲醚、松柏酸等）作用于AKT1、EGFR等关键靶点，调控PI3K-Akt、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、TNF等信号通路，发挥抗炎、免疫调节、抑制细胞凋亡等作用，从而治疗儿童过敏性鼻炎。

过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是机体接触变应原后、由免疫球蛋白E介导的鼻黏膜慢性炎症性疾病，典型症状包括鼻痒、阵发性喷嚏、清水样涕及鼻塞。研究显示，儿童与成人AR的免疫病理学机制基本一致，但儿童受遗传因素及肠道菌群的影响更大；此外，儿童免疫系统尚未完全成熟，其对过敏原的免疫反应可塑性更强，更易于调控^［1］。近年来，儿童AR的患病率呈持续上升趋势，全球范围内达10% ~ 40%，我国儿童青少年的AR患病率已高达18.46%，中国部分大城市（如北京、上海）的儿童AR患病率已接近30%^［2-5］。该病不仅影响患儿的生活质量、睡眠及学习能力，还与哮喘、鼻窦炎、分泌性中耳炎等共病密切相关，给家庭和社会带来沉重负担^［6］。目前，西医治疗主要采用抗组胺药、鼻用糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂等，虽能缓解症状，但长期使用存在依从性差、不良反应大及易复发等问题^［7］。因此，寻求安全有效的替代或补充治疗策略具有重要临床意义。

中医药在防治AR方面具有悠久的历史和丰富的经验。本病属于中医“鼻鼽”范畴，其病机特点表现为本虚标实、正虚邪恋，尤以肺、脾、肾三脏虚损，与外感风寒或异气密切相关，其中脾虚运化失司、湿浊上犯鼻窍是核心病机之一^［8-9］。健脾通窍方为四川省名中医李贵平教授的临床经验方，以《太平惠民和剂局方》^［10］所载“参苓白术散”益气健脾之法为基础，合《严氏济生方》^［11］“苍耳子散”疏风通窍之义加减化裁而成，由太子参、茯苓、白术、山药、辛夷、苍耳子、陈皮、甘草8味中药组成，具有健脾益气、化湿通窍的功效。方中太子参、茯苓、白术、山药健脾益气以固本，辛夷、苍耳子、陈皮、甘草化湿通窍以治标，契合小儿“脾常不足”的生理特点。已有临床观察显示，参苓白术散合苍耳子散对儿童急、慢性鼻炎效果显著^［12-13］，这为健脾通窍方的疗效提供了有力支撑，但其药效物质基础及分子作用机制尚不明确。

中药复方具有“多成分、多靶点、多通路”的协同作用特点，传统实验方法难以系统揭示其复杂的作用网络。网络药理学作为系统生物学的重要分支，借助“药物-成分-靶点-疾病”交互网络，可高效预测中药复方的活性成分、潜在靶点及生物学通路，为阐明中药作用机制提供计算依据^［14-15］。近年来，分子对接和分子动力学模拟技术进一步弥补了网络药理学在动态结构验证方面的不足，可从原子水平评估小分子与靶点蛋白的结合模式及复合物稳定性，模拟药物分子在复杂生物环境（如细胞膜、溶液）中的行为，弥补了静态网络预测的不足^［16-18］。将上述方法整合应用，已成为中药现代化研究的有效策略。

本研究以健脾通窍方为研究对象，综合运用网络药理学、分子对接及分子动力学模拟技术，系统筛选其潜在活性成分，预测治疗AR的核心靶点，富集相关信号通路，并通过分子对接和100 ns分子动力学模拟验证关键成分与靶点的结合亲和力及复合物稳定性。旨在从“成分-靶点-通路-结构”多维度揭示健脾通窍方治疗儿童AR的潜在分子机制，为其临床合理应用及后续实验研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 健脾通窍方活性成分筛选与靶点预测

通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和HERB数据库（http://herb.ac.cn/）检索健脾通窍方中太子参、茯苓、白术、山药、辛夷、苍耳子、陈皮、甘草的化学成分。利用在线 ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）综合预测平台（ADMETlab 3.0，https：//admetlab3.scbdd.co）对检索获得的活性成分进行筛选，筛选条件为：①满足Lipinski类药五规则（Lipinski's rule of five，Ro5）；②口服生物利用度（oral bioavailability，OB），筛选条件设定为F20% < 0.7，以ADMETlab 3.0平台的OB20%参数预测）；③血浆蛋白结合率 < 90%。通过SwissTargetPrediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch）预测上述活性成分的相关靶点，物种设置为“Homo sapiens”，获取成分靶点信息。

1.2 儿童AR疾病靶点获取

以“pediatric allergic rhinitis”为关键词，检索GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://omim.org/），获取儿童AR相关疾病靶点。

1.3 交集靶点筛选及网络构建

利用Origin 2023软件将健脾通窍方成分-靶点与儿童AR疾病靶点取交集，绘制韦恩图。将交集靶点导入STRING数据库（https://www.string-db.org/），设置Organisms为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值评分设为0.400，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。下载上述PPI结果文件，利用Cytoscape 3.9.0软件进行可视化分析，根据度值筛选核心靶点。同时构建“中药-成分-靶点-疾病”网络，分析核心成分。

1.4 GO与KEGG富集分析

利用R 4.2.2软件及微生信在线绘图平台，对交集靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析。GO分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个类别，以富集基因数为标准筛选各分类前10个条目绘制气泡图。KEGG分析按富集基因数选取前30条通路，绘制气泡图和柱状分类图，并利用KEGG数据库绘制核心信号通路图。

1.5 分子对接

从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的3D结构，使用PyMOL 2.3.0软件进行去水、加氢等预处理。核心成分小分子相关信息如网络药理学部分核心成分信息表所示，从PubChem数据库下载小分子3D结构并使用OpenBabel3.1.1软件的MMFF94力场对小分子结构进行优化，最终获得能量最低状态的最优分子结构。使用AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白质进行加氢处理，对小分子进行加氢和判定可扭转键的处理，保存为pdbqt文件。使用Grid板块设置分子对接参数，每个蛋白分子对接范围参数见表1。设定对接方式为半柔性对接，对接精度exhaustiveness为25，对接算法为拉马克遗传算法。运行AutoDock Vina 1.2.0软件进行分子对接，得到对接结合自由能以及对接结果文件。

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  表格1 受体蛋白相关信息

  Table1.Information of receptor proteins

  注：AKT1. 蛋白激酶Bα；ALB. 白蛋白；BCL2. B细胞淋巴瘤/白血病-2；CTNNB1. 连环蛋白β1；EGFR. 表皮生长因子受体；IL6. 白细胞介素-6；MMP9.基质金属蛋白酶9；STAT3. 信号转导及转录激活因子3；TNF. 肿瘤坏死因子；TP53. 肿瘤蛋白53。

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1.6 分子动力学模拟

选取分子对接中结合能最优的2组复合物（EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚）进行100 ns分子动力学模拟。使用Gromacs 2024.4软件，蛋白力场为Amber14sb，配体力场为Gaff2，水模型为TIP4P，添加1.2 nm周期性边界水盒子，采用蒙特卡罗法添加Na⁺/Cl⁻中和体系电荷。经过最速下降法能量最小化（最大力 < 1 000 kJ/mol），以及恒温恒容（310 K）和恒温恒压（1 atm）2步平衡（各50 000步，步长：2 fs）后，进行100 ns无约束模拟（步长：2 fs，每10 ps保存1次轨迹）^［18］。分析均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）、均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）、回转半径（radius of gyration，Rg）、氢键数目、溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）、自由能景观（free energy landscape，FEL）及分子力学/广义玻恩表面积法（molecular mechanics/generalized born surface area，MM/GBSA）结合自由能。FEL图是使用Gromacs内置脚本g_sham脚本计算所得，根据RMSD值与Rg值计算获得吉布斯相对自由能，并以RMSD值、Rg值和吉布斯相对自由能为X、Y、Z轴绘制。

1.7 研究设计与统计学分析

本研究为基于网络药理学、分子对接及分子动力学模拟的机制预测研究。网络药理学部分采用描述性分析方法，无传统统计学假设检验。分子对接结果以结合能表示，结合能< -5 kcal/mol判定为良好结合，< -7.2 kcal/mol判定为强烈结合。分子动力学模拟采用GROMACS内置算法计算RMSD、RMSF、Rg、SASA、氢键数目及MM/GBSA结合自由能，所有轨迹分析均以模拟平衡后的最后50 ns数据为基准，结合自由能计算采用MM/GBSA方法，结果以平均值表示。

2 结果

2.1 健脾通窍方活性成分筛选及潜在靶点预测

基于PubChem和HERB数据库检索，太子参、茯苓、白术、山药、辛夷、苍耳子、陈皮、甘草分别获得化学成分86、185、127、68、95、105、131、349个。经ADMETlab 3.0平台筛选后，上述各药味的潜在活性成分分别为50、51、40、28、37、32、49、78个，合计365个。通过SwissTargetPrediction平台预测，健脾通窍方365个活性成分共对应1 220个靶点。

2.2 儿童AR的疾病靶点筛选

通过Genecards数据库和OMIM数据库获取儿童AR疾病靶点312个。

2.3 健脾通窍方活性成分与AR的共同靶点筛选及PPI网络构建

使用Origin 2023软件将健脾通窍方成分靶点与儿童AR靶点进行交集，制作韦恩图（图1），共获取潜在治疗靶点76个。使用STRING数据库和Cytoscape软件构建PPI网络（图2）和“中药-成分-靶点-疾病”网络（图3）。PPI网络包含76个节点，经Cytoscape分析得到10个核心靶点，分别为EGFR、AKT1、TP53、IL6、TNF、ALB、BCL2、CTNNB1、STAT3、MMP9（表2）。“中药-成分-靶点-疾病”网络共获得12个核心成分，包括芹菜素三甲醚、松柏酸、灵芝酸A等（表3）。

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  图1 健脾通窍方复方与儿童AR靶点疾病交集靶点韦恩图

  Figure1.Venn diagram of intersection targets between Jianpi Tongqiao formula and pediatric AR

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  图2 PPI网络

  Figure2.PPI network

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  图3 “中药-成分-靶点-疾病”网络

  Figure3.“TCM-component-target-disease” network

  注：蓝色多边形代表疾病与复方；红色倒三角形代表单味中药；绿色菱形代表药物与疾病的交集靶点；圆形代表中药活性成分。

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  表格2 核心靶点拓扑参数

  Table2.Topological parameters of core targets

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  表格3 核心成分信息

  Table3.Information of core components

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2.4 GO与KEGG信号通路富集分析

GO分析共富集到3 607个BP、239个CC和394个MF条目。BP主要涉及肽基-酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰等（图4-A）；CC主要富集于膜筏、膜微区（图4-B）；MF以细胞因子受体结合最为显著（图4-C）。KEGG富集得到321条通路，前30条如图5所示。由综合基因比率（gene ratio）（图5-A）及富集靶点基因数量（count）（图5-B）2项指标可见，脂质与动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖通路在基因比率和绝对数量上均表现出最显著的富集。此外，多条与炎症、病毒感染及肿瘤相关的通路，如磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、TNF、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、缺氧诱导因子-1 （hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路，也呈现明显富集，提示其可能在疾病进程中发挥协同作用。其中PI3K-Akt信号通路为最核心通路，其次为HIF-1信号通路和TNF信号通路。

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  图4 GO气泡图

  Figure4.GO enrichment bubble plot

  注：A.BP；B.CC；C.MF。

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  图5 KEGG气泡图和柱状分类图

  Figure5.KEGG enrichment bubble plot and bar chart

  注：A.KEGG富集分析气泡图；B.KEGG通路富集柱状图。

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2.4 分子对接结果

分子对接热图（图6）显示，所有核心成分与核心靶点结合能均 < -5 kcal/mol，多数< -7.2 kcal/mol。选取结合能最优的6组复合物（AKT1-柑橘宁I、EGFR-灵芝酸A、EGFR-光甘草酸、MMP9-巴拉诺佛宁、MMP9-芹菜素三甲醚、MMP9-3-表脱氢肿瘤酸）进行相互作用分析（图7）。图中可见柑橘宁I与AKT1蛋白中的氨基酸残基LYS0179、GLU-234、THR-291形成了3条氢键相互作用（绿色虚线）。灵芝酸A与EGFR蛋白中的氨基酸残基LYS-745、THR-790形成了4条氢键相互作用，并与PHE-723、VAL-726形成了2个疏水相互作用（黄色虚线）。光甘草酸与EGFR蛋白中的氨基酸残基LYS-745、ASP-837、TYR-869形成了4条氢键相互作用。巴拉诺佛宁与MMP9蛋白中的氨基酸残基GLU-241、THR-251形成了2条氢键相互作用，并与LEU-243、TYR-248形成了2个疏水相互作用。芹菜素三甲醚与MMP9蛋白中的氨基酸残基ARG-249形成了1条氢键相互作用，并与HIS-226、LEU-243、TYR-248形成了3个疏水相互作用。3-表脱氢肿瘤酸与MMP9蛋白中的氨基酸残基ALA-242形成了1条氢键相互作用，并与HIS-226、TYR-248形成了2个疏水相互作用。

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  图6 分子对接结合能热图

  Figure6.Heatmap of molecular docking binding energies

  注：纵轴代表复方中的核心活性成分，前缀代表单味中药来源，CEZ为苍耳子，CP为陈皮，FL为茯苓，GC为甘草，XY为辛夷，TZS为太子参。

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  图7 分子对接可视化图

  Figure7.Visualization of molecular docking

  注：A. AKT1-柑橘宁I；B. EGFR-灵芝酸A；C. EGFR-光甘草酸；D. MMP9-巴拉诺佛宁；E. MMP9-芹菜素三甲醚；F. MMP9-3-表脱氢肿瘤酸；左侧为蛋白-小分子整体结合构象，右侧局部放大展示小分子配体（黄色）与蛋白关键氨基酸残基之间的相互作用。

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以上可见6组小分子与蛋白之间均形成了多条相互作用力且结合能均低于-9 kcal/mol，说明6组小分子与蛋白之间的结合亲和力高，很有可能对蛋白的结构功能与生物活性产生影响。但分子对接采用的半柔性对接目前无法考虑蛋白质结构的柔性，为了进一步证明小分子与蛋白质之间结合的程度与稳定性，本文对结合亲和力最优的2组复合物EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚进行了100 ns的分子动力学模拟。

2.5 分子动力学模拟结果

RMSD分析：RSMD是判断蛋白质配体复合物稳定性的指标，RMSD值越小代表复合物整体结构变化小，复合物越稳定。图中EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组复合物的RMSD曲线波动范围全程均在1 nm以内，其整体构象在模拟时间尺度内趋于稳定^［14］。说明以RMSD角度分析EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组复合物稳定性均较好（图8-A）。

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  图8 分子动力学模拟结果

  Figure8.Molecular dynamics simulation results

  注：A. RMSD曲线；B. RMSF曲线；C. Rg曲线；D. 氢键数量波动曲线；E. SASA曲线；从左至右分别为 EGFR-FL7、MMP9-CP12复合物的动力学模拟指标。

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RMSF分析：RMSF代表蛋白质中氨基酸残基在动力学模拟过程中波动的程度，较高的RMSF值代表该氨基酸残基具有较大的波动，相反，较低的RMSF值代表该氨基酸残基波动小。图中EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组RMSF曲线波动均在1 nm范围内，无较大波动，说明小分子的加入对蛋白中氨基酸残基的稳定性影响甚微，形成的复合物稳定性良好（图8-B）。

Rg分析：Rg用于表征结构的紧密程度与稳定性，较大的Rg说明体系在动力学模拟中发生了较严重的膨胀；相反，较小的Rg说明了在动力学模拟中，体系保持紧密和稳定。EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组Rg曲线波动分别在1.9~ 2.0 nm和1.5 nm范围左右，且全程平稳，无较大波动。这表明EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组复合物稳定性均很好，且小分子的加入没有使蛋白整体结构产生较大变化（图8-C）。

氢键分析：为了研究复合物结合位点的氢键性质，本文计算了配体与蛋白之间起稳定作用的主要作用键氢键的数目。EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组小分子与蛋白之间的氢键数量全程分别稳定在2 ~ 3个和1个左右，且氢键曲线波动平稳，说明EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组蛋白与小分子之间均形成了较好的氢键相互作用，复合物稳定性高（图8-D）。

SASA分析：SASA是研究蛋白结构折叠与稳定性的因素之一。具有稳定结构的蛋白质往往具有更稳定的SASA曲线。图中EGFR蛋白和MMP9蛋白的SASA曲线波动全程均为稳定，且无较大波动，波动范围分别在150和90 nm²左右，说明EGFR蛋白和MMP9蛋白本身稳定性均很好（图8-E）。

通过对比分子动力学模拟0、25、50、75、100 ns 5个时刻复合物构象，研究复合物在分子动力学模拟中的结合稳定性。结果显示，5个时刻EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组小分子与蛋白均结合在同一位置，未发生较大变动，说明2组复合物稳定性均很好（图9）。

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  图9 分子动力学模拟5个时刻的结构对比图

  Figure9.Structural comparison of molecular dynamics simulations at 5 time points

  注：A. EGFR-灵芝酸A复合物；B. MMP9-芹菜素三甲醚复合物；图中红、绿、蓝、黄、橙色小分子分别对应0、25、50、75、100 ns 5个时刻的小分子结构。

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FEL图：FEL图用于描述复合物结构动力学模拟全过程中能量最小的构象。若蛋白质与配体相互作用很弱或不稳定，FEL图中就会出现多个且表面粗糙最小能量团簇；相反，强而稳定的相互作用可以在势能分布中形成近乎单一且平滑的能量簇。图中暗紫色/蓝色斑点反映能量最小值，即最稳定结构；相反红色/黄色的斑点代表不稳定的结构。图中EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组复合物的自由能分布图中均形成了较为单一的最小能量团簇，且能量团簇分布集中，说明EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组复合物均具有较好的稳定性（图10）。

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  图10 自由能分布图

  Figure10.Free energy landscape

  注：A. EGFR-灵芝酸A复合物；B. MMP9-芹菜素三甲醚复合物；左列为三维FEL图；右列为对应的二维等高线图；以RMSD与Rg作为反应坐标，颜色代表相对自由能（kcal/mol），蓝色区域代表自由能较低的构象稳态。

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平均结合自由能：在复合物体系稳定后，采用MM/GBSA方法计算了EGFR-FL7，MMP9-CP12的平均结合自由能。由图11可见，EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组的平均结合自由能分别为-28.35和-39.89 kcal/mol，说明EGFR-灵芝酸A、MMP9-芹菜素三甲醚2组小分子与蛋白的结合程度均较好。

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  图11 MM/GBSA结合自由能各项能量分解（kcal/mol）

  Figure11.Energy components of MM/GBSA binding free energy （kcal/mol）

  注：A. EGFR-灵芝酸A复合物；B. MMP9-芹菜素三甲醚复合物；VDWAALS. 范德华能；EEL. 静电能；EGB. 极性溶剂化能；ESURF. 非极性溶剂化能；GGAS. 气相能；GSOLV. 溶剂化自由能；TOTAL. 总结合自由能。

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参与结合氨基酸残基贡献：残基能量分解结果显示，灵芝酸A与EGFR蛋白的结合主要由PHE-723（-3.4 kcal/mol）和VAL-726（-2.1 kcal/mol）驱动；芹菜素三甲醚与MMP9蛋白的结合则依赖于ARG-249（-2.8 kcal/mol）、TYR-248（-2.7 kcal/mol）、HIS-226（-1.8 kcal/mol）及TYR-245（-1.7 kcal/mol）的贡献。其中，EGFR的PHE723、VAL726残基，MMP9的MET247、TYR248 残基具有较高负向能量贡献，为小分子与靶蛋白结合的热点关键残基。上述关键残基与分子对接分析中识别的结合位点高度一致，表明模拟前后2组复合物的结合模式未发生显著迁移（图12）。

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  图12 氨基酸残基能量贡献

  Figure12.Per-residue energy contribution to binding （kcal/mol）

  注：A. EGFR-灵芝酸A体系各关键残基能量贡献；B. MMP9-芹菜素三甲醚体系各关键残基能量贡献；横坐标为蛋白氨基酸残基，纵坐标为残基对总结合自由能的贡献，负值表示该残基有利于配体与蛋白结合。

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3 讨论

本研究运用网络药理学、分子对接及分子动力学模拟技术，首次系统探讨了健脾通窍方治疗儿童AR的潜在分子机制。结果显示，健脾通窍方中的芹菜素三甲醚、松柏酸、灵芝酸A等多种活性成分，可能通过作用于AKT1、EGFR、TP53、IL6、TNF等核心靶点，调控PI3K-Akt、HIF-1、TNF等多条信号通路，发挥抗炎、免疫调节及抑制细胞凋亡等协同效应。分子对接进一步证实核心成分与靶点蛋白间结合能均低于-9 kcal/mol，结合强烈；100 ns分子动力学模拟表明EGFR-FL7和MMP9-CP12复合物结构稳定，为网络药理学预测提供了动态结构验证。

通过网络药理学筛选出芹菜素三甲醚（黄酮类）、松柏酸（酚酸类）、灵芝酸A（三萜类）等核心成分，有效验证了健脾通窍方的药效物质基础及分子机制。其中，芹菜素三甲醚已被证实能诱导细胞凋亡，增加胱天蛋白酶-3的蛋白水解活化，抗肿瘤活性，抗氧化抗老^［19］；松柏酸能够多靶点抗过敏、调节免疫应答与细胞因子平衡、抑制过敏介质释放与抗氧化^［20-22］；灵芝酸A可抑制细胞组胺的释放，增强消化系统各种器官的机能，具有降血脂、降血压、护肝、调节肝功能等作用。这些成分可能共同构成了健脾通窍方治疗AR的药效物质基础^［23］。由此进一步推断健脾通窍方治疗AR的机制可概括为“多成分协同、多环节干预”——通过抗凋亡保护上皮屏障、抗炎抑制Th2型炎症、抗氧化减轻组织损伤、抑制过敏介质释放缓解临床症状，共同构成其“健脾益气、化湿通窍”功效的现代药理学内涵。

PPI网络分析显示，AKT1、EGFR、IL6、TNF等靶点具有较高的度值，提示其在健脾通窍方治疗AR中发挥核心作用。AKT1是PI3K-Akt信号通路的关键分子，参与细胞存活、增殖及炎症反应的调控^［24-25］，可能通过改善Th1/Th2平衡、减少嗜酸性粒细胞浸润，从而缓解AR症状^［26］。EGFR不仅参与上皮细胞修复，还可通过激活下游MAPK和NF-κB通路促进Th2型炎症^［27-28］；IL-6和TNF是典型的促炎因子，在AR患者的血清和局部鼻分泌物中水平显著升高，其浓度与疾病的临床症状和严重程度存在正相关关系^［29-30］。健脾通窍方可能通过同时抑制上述靶点，协同减轻鼻黏膜炎症反应。此外，MMP-9参与细胞外基质重塑，其高表达与鼻黏膜屏障破坏及气道重塑密切相关^［31］；BCL2和TP53则调控细胞凋亡^［32-33］，提示本方可能通过抗凋亡机制保护鼻黏膜上皮完整性。

KEGG富集分析表明，PI3K-Akt信号通路是健脾通窍方治疗AR的最核心通路。该通路在过敏性炎症中被异常激活，参与肥大细胞脱颗粒、嗜酸性粒细胞趋化、黏液高分泌及血管通透性增加等多个环节^［34］。本研究中多个交集靶点（如AKT1、EGFR、BCL2、CTNNB1）均富集于此通路，提示健脾通窍方可能通过抑制PI3K-Akt信号轴来缓解AR症状。此外，HIF-1信号通路与组织缺氧及炎症重塑相关，AR患者鼻黏膜常因肿胀、分泌物阻塞而处于缺氧状态，HIF-1α可诱导VEGF表达进而加重黏膜水肿^［35-36］；TNF信号通路则直接介导发热、黏附分子上调及白细胞趋化^［37-39］。这些通路的显著富集进一步支持了健脾通窍方多通路、多靶点干预AR的特点。

分子对接结果显示，核心成分与关键靶点之间形成了稳定的氢键及疏水相互作用，结合能均低于-9 kcal/mol，远优于一般认为的活性阈值（-5 kcal/mol）。其中，灵芝酸A与EGFR的LYS745、THR790形成4条氢键及疏水作用，芹菜素三甲醚与MMP9的ARG249形成氢键及多个疏水作用。为进一步验证结合稳定性，本研究对结合能最优的EGFR-灵芝酸A和MMP9-芹菜素三甲醚复合物进行了100 ns分子动力学模拟。结果显示：两复合物的RMSD曲线波动均在1 nm以内，RMSF显示氨基酸残基波动 < 1 nm，Rg及SASA曲线平稳，表明复合物整体结构紧密、柔性低、溶剂暴露无显著变化；氢键数量分别稳定在2 ~ 3个和1个左右；FEL图呈现单一低能团簇；MM/GBSA计算的平均结合自由能分别为-28.35 kcal/mol和-39.89 kcal/mol，远低于-20 kcal/mol的强结合阈值^［40］。这些动态模拟数据从原子水平证实了健脾通窍方核心成分与靶点蛋白的稳定结合，增强了网络药理学预测的可信度。

与成人AR相比，儿童AR的免疫病理特征呈现Th2偏移更为显著、Treg功能相对不足以及局部黏膜细胞因子谱与系统免疫指标分离等特点^［41-42］。本研究筛选出的核心靶点IL6、TNF和AKT1，可分别对应Th17/Treg失衡的驱动环节、局部炎症效应环节以及PI3K-Akt通路介导的免疫调节异常。健脾通窍方“健脾益气、化湿通窍”的功效定位，可能通过同时干预上述靶点，在调节儿童AR免疫失衡的同时缓解鼻黏膜局部炎症，体现了中药复方多靶点协同的作用特点。

本研究存在以下局限性：首先，活性成分筛选和靶点预测依赖于现有数据库（PubChem、HERB、SwissTargetPrediction等），部分中药成分可能未被收录或数据更新滞后；其次，口服生物利用度和血浆蛋白结合率的阈值设定虽参考ADMETlab 3.0平台默认参数，但仍存在一定主观性；再次，分子动力学模拟虽能反映复合物的稳定性，但未考虑真实细胞环境中的影响因素（如膜脂双层、代谢酶等）；同时，目前研究尚属计算层面的机制预测，ADMET评估未纳入儿童特异性参数，免疫机制推断亦需实验数据验证；最后，儿童患者存在特殊的药动学特征和生长发育差异，后续研究将以儿童AR免疫特征为导向，设计针对性的细胞和动物实验（如鼻黏膜上皮细胞、肥大细胞）及体内动物模型（如卵清蛋白诱导的AR幼鼠），并尝试整合儿科药动学参数完善预测模型，并观察不同年龄段儿童的疗效差异，为该方的儿科临床应用提供更充分的证据支持

综上所述，本研究初步揭示了健脾通窍方“多成分-多靶点-多通路”治疗儿童AR的潜在分子机制——其活性成分（芹菜素三甲醚、松柏酸、灵芝酸A等）可能通过作用于AKT1、EGFR、IL6、TNF等核心靶点，调控PI3K-Akt、HIF-1、TNF等信号通路，发挥抗炎、免疫调节、抗凋亡及保护鼻黏膜屏障的作用。分子对接及分子动力学模拟为上述机制提供了结

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