目的 建立液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法筛查小活络丸中5种植物生长调节剂。

方法 样品通过SHIMSEN 植物生长调节剂专用包进行提取，并经过净化处理；采用Waters ACQUITY UPLC C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵），梯度洗脱；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；电喷雾离子源，正负离子扫描，多反应监测模式。

结果 5种植物生长调节剂线性关系良好，多效唑、甲哌鎓、胺鲜酯、矮壮素及6-苄氨基嘌呤的r分别为0.9972、0.998 2、0.998 9、0.999 4、0.998 3；检出限分别为0.011、0.012、0.012、0.012、0.013 mg/kg；平均加样回收率分别为99.39%、91.45%、87.22%、91.09%、94.19%（n = 6）。

结论 建立的植物生长调节剂多残留检测方法灵敏度高，准确性好，针对性强，可用于筛查小活络丸中植物生长调节剂。

小活络丸收载于《中国药典》2025年版一部，由胆南星、制川乌、制草乌、地龙、乳香（制）、没药（制）六味药组成，具有祛风散寒、化痰除湿、活血止痛之功效，临床常用于风寒湿痹、肢体疼痛、麻木拘挛等病症，是风湿痹痛类经典中成药^［1-2］。处方中制川乌、制草乌、胆南星均为毒性药材，其基原植物在规模化栽培过程中，为提高产量、改善性状，常使用植物生长调节剂调控生长周期与根茎发育。随着中药材种植集约化程度不断提升，植物生长调节剂不规范使用带来的残留累积、代谢干扰等问题日益突出，不仅影响药材有效成分积累、降低内在品质，还会通过制剂传递形成潜在安全风险，尤其对含毒性药材的中成药，双重安全隐患更需严格防控^［3-5］。

当前，中药质量控制已从传统指标性成分测定，向毒性成分、外源性污染物、农残与生长调节剂残留协同管控转型。小活络丸作为临床常用复方制剂，其原料药材来源复杂、基质干扰强，而现有质量标准仅有性状、鉴别、检查、含量测定项目，未对处方中的植物生长调节剂进行测定，故本次试验针对处方中胆南星、制川乌、制草乌等高风险药材开展植物生长调节剂残留筛查，对完善质量标准、保障临床用药安全具有重要现实意义^［6-8］。

目前，针对小活络丸的研究多集中于乌头类毒性成分、指纹图谱及药效学评价，针对多类植物生长调节剂的同步筛查方法尚未见系统报道。而《中国药典》2025年版四部通则2342^［9］虽已收载药材及饮片或制剂中部分植物生长调节剂残留量的测定方法，但仅对检出限作出要求，未规定限度。液相色谱-串联质谱（liquid chromatography- tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法因灵敏度高、专属性强、通量高等优势，已成为中药外源性小分子残留检测的主流技术。本研究选取5种常见的生长调节剂，使用LC-MS/MS法进行测定，建立针对小活络丸专属、灵敏度高、准确的检验方法，实现小活络丸中5种植物生长调节剂的快速筛查与定量，为小活络丸中植物生长调节剂的风险评估提供检测依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

Triple Quad 5500+液质联用仪（美国SCIEX公司）；IKA VIBRAX VXR basic涡旋震荡器（德国IKA-Werke GmbH&Co.KG公司）；HT18MM型台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；TTL-DC Ⅱ型氮吹仪（北京同泰联科技有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）。

1.2 试药与其他材料

样品：149批小活络丸（大蜜丸、小蜜丸）源于28家生产企业，来自31个省市自治区，为国家抽验样品；自制制剂所用药材（均由陕西省食品药品检验研究院李青主管药师按照《中国药典》标准进行检验，结果均符合规定）及炼蜜均为市售品，其中，乳香没药的产地均为埃塞俄比亚，地龙的产地为广东，制川乌的产地为四川，制草乌的产地为黑龙江，胆南星加工地为安徽。

对照品：多效唑（批号：040168-202202，纯度100.0%）、甲哌鎓（批号：190308-202301，纯度100.0%）、胺鲜酯（批号：010150-202304，纯度100.0%）、矮壮素（批号：010127-202204，纯度100.0%）、6-苄氨基嘌呤（批号：020245-202301，纯度100.0%）均购自上海鸿永生物科技有限公司。

试剂：甲醇（色谱纯，美国Honeywell公司）；乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁公司）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

耗材：Shim-pack GIST C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2 μm，（日本岛津公司）；Waters ACQUIITY UPLC C₁₈色谱柱，100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；SHIMSEN QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）萃取盐包（4 g硫酸镁、1 g氯化钠、0.5 g柠檬酸氢二钠、1 g柠檬酸钠，美国岛津公司），净化管（美国岛津公司，150 mg C₁₈、900 mg硫酸镁。

2 方法与结果

2.1 分析条件

Waters ACQUIITY UPLC C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1mm，1.7 µm）；以0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行洗脱；流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃^［10-15］。

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  表格1 流动相梯度洗脱表

  Table1.Mobile phase gradient elution profile

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质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾电离源（electro spray ionization，ESI），正负离子扫描模式，监测模式为多反应监测，质谱条件见表2，5种植物生长调节剂的离子流图见图1 ^［10-15］。

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  表格2 植物生长调节剂质谱条件

  Table2.Mass spectrum conditions of plant growth regulators

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  图1 5种植物生长调节剂离子流图

  Figure1.Ion flow diagrams of five plant growth regulators

  注：A. 多效唑；B. 甲哌鎓；C. 胺鲜酯；D. 矮壮素；E. 6-苄氨基嘌呤。

  

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

精密称取已剪碎的小活络丸样品5.0 g，加水5 mL，涡旋使样品溶散混匀，精密加入乙腈10 mL，涡旋（转速1 500 r/min）1 min，加入萃取盐包（4 g MgSO₄、1gNaCl、0.5 g柠檬酸氢二钠、1 g柠檬酸钠），涡旋（转速1 500 r/min）1 min，再将样品离心（10 655 × g）5 min，取上清液6 mL至净化管（150 mg C₁₈、900 mg MgSO₄）中，涡旋（转速1 500 r/min）1 min，再将样品离心（10 655 × g）5 min，取上清液2 mL置离心管中，室温下氮吹至近干，加流动相初始比例［0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈为95∶5］定容至2 mL，涡旋使混匀溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 空白基质溶液

取空白基质样品（小活络丸，批号：20220901，企业28），同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液，即氮吹至近干。

2.2.3 混合对照品储备液

分别称取不同对照品适量置量瓶中，分别加乙腈-水（95∶5）配制成对照品储备溶液①，多效唑、甲哌鎓、胺鲜酯、矮壮素、6-苄氨基嘌呤的浓度分别为1 058.0，1 492.0，1 114.0，1 290.0，1 544.0 ng/mL；再精密吸取对照品储备溶液①1 mL置10 mL量瓶中，用乙腈-水（95∶5）稀释成对照品储备溶液②，多效唑、甲哌鎓、胺鲜酯、矮壮素、6-苄氨基嘌呤的浓度分别为105.8、149.2、111.4、129.0、154.4 ng/mL。

2.2.4 基质混合对照溶液

取“2.2.2”项下空白基质8份，分别加入混合对照品储备溶液②20 μL、50 μL、100 μL、再精密吸取储备液①25 μL、50 μL、100 μL、150 μL、250 μL，加流动相初始比例［0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈为95∶5］定容至2 mL，涡旋使混匀溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 线性关系、检出限、定量限

将系列基质混合对照品溶液，在拟定的色谱条件下测定，以对照品浓度为横坐标（X，ng/mL），对照品定量离子峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并进行线性回归计算，具体结果见表2。结果表明多效唑、甲哌鎓、胺鲜酯、矮壮素、6-苄氨基嘌呤在一定浓度范围内线性关系良好。以3倍信噪比得检出限（limit of detection，LOD）以10倍信噪比得定量限（limit of quantitation，LOQ），结果见表3。

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  表格3 植物生长调节剂线性关系、检出限、定量限考察结果

  Table3.Investigation results of linear relationship, detection limit and quantitative limit of plant growth regulators

  

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液2 μL，连续重复进样6次，按“2.1”项下的色谱条件测定峰面积，结果多效唑、甲哌鎓、胺鲜酯、矮壮素、6-苄氨基嘌呤峰面积的RSD分别为0.51%、0.81%、0.63%、0.42%、0.32%（n = 6）。表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品（小活络丸，批号：120085，企业17）5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0，2，4，6，8，12 h， 按“2.1”项下的色谱条件测定峰面积，结果甲哌鎓、胺鲜酯、峰面积的RSD分别为0.98%、0.69%（n = 6）。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一供试品（小活络丸，批号：120085，企业17）5g，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得甲哌鎓、胺鲜酯的平均含量分别为0.004 3、0.003 1 mg/kg，RSD分别为0.78%、1.03%（n = 6），其余成分未检出，结果表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

分别精密称取已剪碎的阴性样品5 g（小活络丸，批号：20220901，企业28），加5 mL水，涡旋使样品溶散混匀，共6份，精密量取对照品储备液100 μL、500 μL、1 mL（平行2份）加入上述样品中，按上述供试品制备方法制备回收率供试品溶液。按拟定方法进行检测并计算回收率，结果各回收率分别为多效唑：99.39%、甲哌鎓：91.45%、胺鲜酯：87.22%、矮壮素：91.09%、6-苄氨基嘌呤：94.19%；RSD分别为8.30%、8.50%、8.35%、4.14%、10.08%（n = 6）。

2.8 样品的测定

取小活络丸的6种原料药材和炼蜜各3批，按处方工艺自制3批自制制剂，并对3批胆南星、制川乌、制草乌、自制制剂及剩余的148批小活络丸样品进行测定，能够检出植物生长调节剂的批次及测定结果见表4，其余样品、自制制剂、药材与辅料均低于检出限，未列出。

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  表格4 样品测定结果（mg/kg，n = 2）

  Table4.Determination results of samples（mg/kg，n = 2）

  注：—代表低于检出限。

  

3 讨论

3.1 质谱条件的优化

试验分别将浓度为200 ng/mL的5种植物生长调节剂的单一标准溶液通过针泵引入质谱系统，在ESI正负离子同时扫描的情况下寻找母离子，并对母离子进行子离子扫描和碰撞能优化，分别确定各化合物的碰撞电压、去簇电压参数，优化结果如表2所示。结果表明不同的化合物之间结构差异较大，电离行为也有所不同；4种植物生长调节剂也在正离子模式下灵敏度较高、稳定性较好，1种植物生长调节剂在负离子模式下有较好的灵敏度和稳定性。在两个子离子中，灵敏度高、稳定性和重复性好的为定量离子，次之的为定性离子。

3.2 色谱条件的优化

本次试验中，使用Shim-pack GIST C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2 μm）对流动相的选择分别采用甲醇-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）、乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵），两个流动相系统，结果发现乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）的色谱峰峰型较好一些，所以本次研究采用乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）为流动相进行梯度洗脱。由于甲哌鎓、矮壮素的峰形较差，故本次试验还对色谱柱进行了考察，继用Waters ACQUIITY UPLC C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）采用上述流动相进行测定，结果5个待测成分的分离度较好，响应值较大。故本次植物生长调节剂研究采用上述色谱条件。

3.3 前处理方法的选择

本试验采用改进 QuEChERS 法进行样品前处理，相较于传统固相萃取、液液萃取等方法具有明显优势。QuEChERS 法通过萃取盐析与分散固相萃取一步净化，即可有效去除中成药中大量淀粉、糖类、色素及脂类等基质干扰，尤其适用于小活络丸这类由胆南星、制川乌、制草乌等多味药材组成、基质复杂且干扰较强的复方制剂。

本次试验的盐包与净化包采用岛津的生长调节剂提取包，故在考察前处理方法时只对提取液进行了考察，分别比较了甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇溶液、1%甲酸乙腈溶液，5%甲酸甲醇溶液、5%甲酸乙腈溶液对于5种植物生长调节剂的提取效率的影响，加标的质量为100 ng。结果表明，甲醇体系对待测物的提取率较低，可能该体系甲醇与水易互溶，共提物溶出较多，因此降低了甲醇对目标物的提取率。在乙腈-水体系中，加入少量的酸对提取效率无明显提高，且结果发现乙腈提取的回收率均在80%以上，故本次试验采用乙腈作为提取溶剂。试验还考查了，样品在氮吹结束后的溶解溶剂进行考察，分别使用乙腈和流动相初始比例［0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）∶乙腈为95∶5］定容至2 mL，结果发现，乙腈定容的样品色谱峰峰型出现拖尾现象，故本次试验采用流动相初始比例进行样品溶解^［16-19］。

3.4 结果分析及方法评价

本次试验建立了LC-MS/MS筛查小活络丸中5种植物生长调节剂的方法，检测方法对标准曲线均采用基质加标的方法，排除了基质干扰，对149批次小活络丸样品，以及各3批胆南星、制川乌、制草乌、自制制剂中5种植物生长调节剂进行测定。结果13个企业14批样品中检出甲哌鎓，5个企业5批样品检出胺鲜酯、4个企业7批样品检出矮壮素，但检出值均低于方法定量限。因《中国药典》2025年版四部只提供植物生长调节剂检出限作为参考，未规定限度值，而一般报告限时大于等于定量限，因此认为低于定量限，可判断样品对残留量控制良好。故本次试验从测定结果可知，149批样品的5种植物生长调节剂均低于定量限，故认为小活络丸中植物生长调节剂控制良好。说明28个生产企业在小活络丸的原料选择上，监管有力，基本未使用有使用生长调节剂的原料药，原料使用在植物生长调节剂方面控制良好。

3.5 小结

本方法符合残留分析的要求，该方法具有前处理简单，专属性强、准确度高、耐用性强，灵敏度高的优点，可用于小活络丸中5种植物生长调剂的快速筛查和确证，为完善该制剂质量标准，加强含毒性药材中成药的外源性污染物风险控制，保障临床用药安全有效提供科学依据与技术支持^［20-21］。

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