目的  建立加味增液汤HPLC指纹图谱并对3种主要成分进行含量测定。

方法  色谱柱为岛津WondaSil C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液，梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为265、203、310、290 nm；柱温为25 °C；进样量为20 μL。建立10批加味增液汤HPLC指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）进行相似度分析，对共有峰进行鉴定和药材归属，并测定3种主要成分的含量。

结果  10批加味增液汤的指纹图谱有17个共有峰，其相似度介于0.872~0.989之间。指认出9、14、17号峰分别为阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷。阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷的含量分别为0.067 3~0.174 8、0.498 8~1.522 7、0.270 9~0.802 4 mg/g，转移率分别为30.74%~55.63%、11.77%~35.94%、23.15%~68.56%。

结论  该研究所建立的HPLC指纹图谱结合主要成分定量分析方法可用于加味增液汤汤剂的质量分析与控制，分析方法简单，结果可靠。

增液汤出自《温病条辨》，原书曰：“阳明之病，无上焦证，数日不大便，当下之。若其人阴素虚，不可行乘气者，增液汤主之”^[1]，是治疗津亏肠燥所致大便秘结的方药，具有解热结、滋阴润燥之效^[2]。而方中根据中医医家“君臣佐使”规则来进行配伍，主要由君药玄参、臣药地黄和麦冬构成，三药有降火润肠、滋阴润肺、养阴清热的功效^[3-6]。加味增液汤则是由这3味药加上白芍、当归、白术、陈皮、杏仁共8味药材来搭配使用，具有促进肠胃蠕动排便、缓解干燥综合征、抗炎等作用，共奏益气养阴通便之功^[7-8] ；同时根据多部医学著作当中“君臣佐使”的用药方法以及与配伍剂量关系来确定此方药中这8味药材的使用剂量^[9-10]。

目前，关于加味增液汤的研究倾向于临床疗效和药理作用等方面，鲜见有关该复方的质量标准相关研究，而中药复方药效组分多，且质量易受药材产地、加工炮制方式等影响，因此有必要开发可反映加味增液汤化学成分整体性、复杂性及组方煎液体质量的分析方法。近年来，HPLC法逐渐应用于中成药复方制剂质量控制研究中 ^{[11- 13]}。故本研究以古籍记载的煎煮方法为依据，采用HPLC法建立加味增液汤标准煎液指纹图谱，并建立外标法测定阿魏酸、橙皮苷及哈巴俄苷的含量，以达到更好地控制加味增液汤标准煎液质量的目的。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，配备G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和G1315D检测器（美国安捷伦科技公司）；EX224ZH型万分之一电子分析天平（美国奥豪斯公司）；JS-40型超声波清洗仪（常州鸿泽实验科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：阿魏酸（批号：1135-24-6，纯度98%）、橙皮苷（批号：520-26-3，纯度98%）和哈巴俄苷（批号：19210-12-9，纯度98%）均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为怡宝纯净水。

加味增液汤中各饮片均由上海同济堂药业有限公司提供，具体信息见表1，经上海市宝山区中西医结合医院苟小军主任药师鉴定，均符合《中国药典（2020年版）》一部相关项下的性状规定，鉴定结果依次为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（BS）；蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.、东北杏Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne或杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子（KXR）；菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎（BZ）；玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根（XS）；玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根（DH）；芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮（CP）；百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥块根（MD）；伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根（DG）。根据中药经典名方复方制剂开发的要求，组方饮片需源于3个不同产地的药材，且每个产地5批，共15个不同批次的药材所制得的饮片进行随机组合成10批次药方。

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  表格1 样品信息

  Table 1.Information of the samples

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2 方法与结果

2.1 色谱条件  

采用HPLC法，色谱柱为岛津WondaSil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，0.0%~1.0% A；15~20 min，1.0%~3.0% A；20~26 min，3.0% A；26~55 min，3.0%~10% A；55~70 min，10.0%~14.0% A；70~85 min，14.0%~17.0% A；85~108 min，17.0% A；108~110 min，17.0%~19.0% A；110~120 min，19.0% A；120~150 min，19.0%~26.0% A；150~155 min，26% A；155~160 min，26.0%~1.0% A）；检测波长为0~19 min，265 nm；19~38 min，203 nm；38~81 min，310 nm；81~160 min，290 nm；柱温为25 °C；进样量为20 µL；流速为1.0 mL/min。

2.2 加味增液汤的制备

精密称取玄参30 g、麦冬30 g、生地黄30 g、杏仁15 g、当归15 g、白术15 g、白芍15 g、陈皮10 g，加水1 000 mL，浸泡约10 min，包煎，先武火，沸腾后转文火煎煮至药液体积80%，挤轧，60 °C条件下恒温减压干燥，研细，即得加味增液汤干粉。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液

精密称取0.5 g样品干粉，置于具塞锥形瓶中，加入20 mL 80%甲醇，称定质量，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）处理30 min，放至室温，补足减失的质量，13 680×g离心10 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得供试品溶液。

2.3.2 对照品溶液

称取阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷各适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为0.024、0.025、0.024 mg/mL的对照品溶液。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验  

按“2.3.1”项下制备供试品溶液1份，并按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，以哈巴俄苷色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别≤1.65%和 ≤1.88%（n=6），表明仪器的精密度良好，符合检测要求。

2.4.2 稳定性试验

按“2.3.1”项下制备供试品溶液1份，并按“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、18、24 h进样测定，记录色谱图。以哈巴俄苷色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别≤1.54%和 ≤1.76%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验  

按“2.3.1”项下制备供试品溶液6份，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以哈巴俄苷色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别≤1.79%和≤2.85%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱研究

2.5.1 指纹图谱的建立

采用共10个不同批次的药材进行随机组合成10剂药方，按“2.2”项下方法分别制备10批加味增液汤干粉样品S1~S10，再按“2.1”项下色谱条件分别测定，记录色谱图（图1），利用中药指纹图谱相似度系统评价软件（2012A）对加味增液汤样品S1~S10的HPLC色谱图进行分析。以S1样品图谱为参照图谱，时间窗为0.1 min，采用平均数法、经多点校正进行峰匹配，生成对照指纹图谱（R），并进行相似度计算，结果见表2。

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  图1 10批加味增液汤样品HPLC指纹图谱及对照指纹图谱

  Figure 1.HPLC fingerprints of 10 batches of Modified Zengye Decoction and the reference fingerprint

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  表格2 10批加味增液汤样品相似度比较

  Table 2.Comparison of the similarities of 10 batches of Modified Zengye Decoction

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2.5.2 主要色谱峰的鉴定  

分别取“2.3.2”项下各对照品储备液适量，在相同的色谱条件下进样，将生成的色谱峰与加味增液汤S10样品指纹图谱相应峰进行对比（图2），结果发现9、14、17号色谱峰分别与各对照品相对应，其紫外吸收光谱也分别相吻合，因此复方样品指纹图谱中9、14、17号峰分别鉴定为阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷。

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  图2 加味增液汤主要色谱峰鉴定结果

  Figure 2.Identification of the main characteristic peaks in the HPLC fingerprints of Modified Zengye Decoction

  注：D1. 加味增液汤；D2. 阿魏酸；D3. 橙皮苷；D4. 哈巴俄苷。

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2.5.3 主要色谱峰的归属  

分别制备白芍、白术、玄参、当归、苦杏仁、地黄、陈皮、麦冬各单味药样品，以及缺白芍、缺白术、缺玄参、缺当归、缺苦杏仁、缺地黄、缺陈皮、缺麦冬的阴性样品，按“2.3.1”项下方法制备各单味药样品溶液和各阴性样品溶液，在相同的色谱条件下进样测定，并与加味增液汤S10样品的指纹图谱进行对比分析（图3和图4），并以各色谱图峰的保留时间以及紫外光谱图为鉴定标准，进行色谱峰的指认，其中第1、3、4、9、10、11、12、15、16、17号峰归属于玄参，第2、15号峰归属于白芍，第5、6、7、8、14号峰归属于陈皮，第5、13号峰归属于地黄。

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  图3 加味增液汤样品与阴性样品对照结果

  Figure 3. Comparison of Modified Zengye Decoction sample and negative samples

  注：J1. 加味增液汤样品；J2. 缺白芍阴性样品；J3. 缺白术阴性样品；J4. 缺陈皮阴性样品；J5. 缺当归阴性样品；J6. 缺地黄阴性样品；J7. 缺麦冬阴性样品；J8. 缺苦杏仁阴性样品；J9. 缺玄参阴性样品。

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  图4 加味增液汤样品与单味药样品对照结果

  Figure 4.Comparison of Modified Zengye Decoction sample and single-flavor medicine samples

  注：W1. 加味增液汤样品；W2. 白芍单味样品；W3. 白术单味样品；W4. 陈皮单味样品；W5. 当归单味样品；W6. 地黄单味样品；W7. 麦冬单味样品；W8. 杏仁单味样品；W9. 玄参单味样品。

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2.6 复方中标准煎液中指标成分阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷的转移率及含量测定

2.6.1 色谱条件  

同“2.1”项。

2.6.2 混合对照品溶液的制备  

精密称取阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷适量置于10 mL量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为0.08、0.26、0.16 mg/mL的混合对照品溶液。

2.6.3 供试品溶液的制备  

同“2.3.1”项

2.6.4 线性关系考察  

将“2.6.2”项下混合对照品溶液分别稀释至其1.000、0.875、0.750、0.625、0.500、0.375倍，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X，μg/mL），对照品峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，建立回归方程，分别为：阿魏酸Y=66 813X+28.864，r=0.999 9，线性范围30.0~80.0 μg/mL；橙皮苷Y=21 765X-729.09，r=0.999 7，线性范围97.5~260.0 μg/ mL；哈巴俄苷Y=41 396X-14.23，r=0.999 9，线性范围60.0~160.0 μg/mL。

2.6.5 精密度试验  

按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液1份，并按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。结果得到阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.25%、0.24%、0.96%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6.6 稳定性试验  

按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液1份，并按“2.1”项下色谱条件分别于 0、4、8、12、18、24 h进样测定。结果得到阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.58%、0.39%、0.55%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.7 重复性试验  

精密称取同一批加味增液汤S1浸膏6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样，测定阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷的峰面积，并以分离度较好的哈巴俄苷为S峰分别计算阿魏酸、橙皮苷和的相对保留时间以及相对峰面积。其中阿魏酸、橙皮苷相对保留时间的RSD分别为0.68%和0.74%（n=6），相对峰面积的RSD分别为1.53%和0.83%（n=6），阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷的平均含量分别为0.122 6、1.002 1、0.357 7 mg/g，表明方法的重复性良好。

2.6.8 加样回收率试验

取同一批复方S1浸膏6份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入对照品阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷相当于样品中各成分含量的100%，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果得到阿魏酸、橙皮苷和哈巴俄苷的平均回收率分别为97.87%、96.93%、98.42%，RSD分别为1.13%、1.25%、1.46%（n=6），表明此方法的准确度良好。

2.6.9 出膏率测定

测定10批加味增液汤的出膏率（加味增液汤浸膏质量/药材总质量），结果见表3。

2.6.10 指标成分的质量分数及其转移率测定  

对10批加味增液汤浸膏按所建立的质量评价方法进行指标成分的含量测定，并计算其转移率（汤剂中含量/药材中含量），结果见表3。

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  表格3 10批加味增液汤出膏率及含量测定结果（n=3）

  Table 3.Dry extract rate and content determination results of 10 batches of Modified Zengye Decoction（n=3）

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3 讨论

3.1 加味增液汤标准煎液的制备工艺探讨

参考《中药精准煮散饮片》^[12]考察了浸泡时间（20、50 min）、加水量（80、100、120 mL）及加热回流时间（60、90、120 min）^[13]。初步确定了药材浸泡回流提取时间对有效成分的溶出有一定的影响。综合考虑到药材本身及其更贴合此方的临床煎药习惯，最终选定加热回流提取120 min、加水量80 mL为此研究的供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件的选择

分别对甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水体系进行了梯度洗脱试验。结果表明，乙腈-0.3%磷酸水梯度洗脱系统有助于各色谱峰的分离，出峰数最多，分离度最好，且160 min内出峰完全；同时，采用二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）在200~400 nm范围内进行全波长扫描，比对各色谱峰的最大紫外吸收波长，最终为使得出峰数最多，分离度最好，特征峰最明显，基线最稳定，故采用了变波长的检测方法。此外也考察了在20、25、30 ℃柱温下对色谱峰峰形、保留时间以及分离度的影响，结果发现在25 ℃条件下各峰的分离效果最好，且温度的变化对本色谱峰的分离效果影响较大。

3.3 指标成分确定

本方共由8味中药组成，根据中药复方的配伍原则，优先选择方中君药（玄参）^[1]的主要成分作为质量控制的指标。玄参属于清热凉血药，具有凉血滋阴，泻火解毒的功效。现代研究表明环烯醚萜苷、黄酮类、多糖、苯丙素和有机酸等是玄参的活性成分。其中的环烯醚萜类是玄参的主要化学成分^[14-15]，其含量是玄参质量控制的一个关键因素，具有抗氧化、抗炎、抗脑缺血、保肝降血糖等药理作用^[16]，其中又以哈巴俄苷为代表^[17]可用于治疗炎症性肠病。炎症性肠病是一种结肠粘膜的慢性疾病，包括克罗恩斯病和溃疡性结肠炎，其病因与氧化应激增加密切相关。Locatelli等^[18]研究发现肿瘤坏死因子-α和前列腺素E2是两种长期参与结肠上皮炎症和损伤的细胞因子，而哈巴俄苷对这两种因子表达有抑制作用，5-羟色胺稳态水平降低，减轻了由氧化应激引起的炎症性肠病症状。Jiang等^[19]通过实验发现肉桂酸能够有效改善洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘小鼠肠道黏膜的组织病理性能和分泌功能，同时，肉桂酸改善了肠道菌群的组成和丰度。而阿魏酸作为肉桂酸的衍生物之一，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化、抗凋亡、低毒性和调节肠道微生物群的生物活性，对慢传输型便秘也起着促进作用。陈皮属于理气药，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，其发挥抗氧化、抗炎、抗肿瘤、维持渗透压、增强毛细血管韧性、减少出血时间、降低胆固醇水平等作用的主要活性成分是橙皮苷，属于二氢黄酮类化合物，《中国药典（2020年版）》将陈皮中橙皮苷的含量规定为鉴定中药陈皮质量的指标性成分。Wu等^[20]发现橙皮苷可以显著改善洛哌丁胺诱导的5-羟色胺受体4荧光强度、细胞内钙离子、环磷酸腺苷依赖蛋白激酶通路和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白通路相关蛋白的增加和细胞增殖，改善洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘大鼠模型的胃肠道传递功能。地黄具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤等药理作用，以梓醇为代表的环烯醚萜类成分是地黄的标志性成分，其不易作为指标成分是由于在加工炮制中梓醇含量变化较大。芍药苷是白芍的主要化学成分之一，具有抗炎、保肝、镇痛、养血等药理作用，其经炮制处理后含量明显减少，不易作为指标成分^[21]。结合色谱峰鉴定，麦冬、当归、白术、杏仁对共有峰的贡献不明显，因此选择哈巴俄苷、阿魏酸、橙皮苷为含量测定的指标成分。

3.4 指纹图谱相似度

中药指纹图谱研究作为一种多指标的质量评价系统可较全面地反映复方中所含化学成分的种类和数量，为中药质量评价提供了新思路和新方法，已日益成为国内外中药质量评价的标准方法。本试验对加味增液汤进行指纹图谱研究，共标定17个共有指纹峰，并归属到各药材，同时鉴定了其中3个色谱峰的化学成分：阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷。试验的10批样品有17个共有峰，相似度介于0.872~0.989之间，说明10批加味增液汤之间存在较多的共有成分，但共有成分峰面积和指标成分含量差异较大，10批样品中阿魏酸、橙皮苷、哈巴俄苷的含量分别为0.067 3~0.174 8、0.498 8~1.522 7、0.270 9~0.802 4 mg/g，可能原因与药材批次的质量有关，最终导致了含量的差异。本研究采用的HPLC-DAD方法简便、易行，且稳定可靠、重现性良好，为加味增液汤质量研究奠定了一定的理论基础。

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