目的  探究生肌玉红膏抑制自噬对血栓闭塞性脉管炎大鼠凝血系统、内皮祖细胞（EPCs）分化及Rho激酶活性的影响。

方法  采用左下肢动脉注射月桂酸钠溶液建立血栓闭塞性脉管炎大鼠模型。将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组，每组10只。采用HE染色检测血管组织病理形态，免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达，凝血检测仪检测凝血系统指标，流式细胞仪检测EPCs分化，免疫组化法检测Rho激酶活性。

结果  生肌玉红膏组可使血管组织中自噬标志蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、苄氯素1（Beclin1）、Rho激酶蛋白表达、血浆纤维蛋白原、EPCs中CD34阳性表达率降低，血清中凝血酶原时间、国际标准比率、EPCs中血管性血友病因子阳性表达率、血管组织中P62表达升高（P＜0.05）；体外实验表明，生肌玉红膏组可降低损伤的内皮细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达，升高P62表达（P＜0.05）。

结论  生肌玉红膏可有效改善血栓闭塞性脉管炎大鼠凝血功能，促进EPCs分化，降低Rho激酶活性，其机制可能与抑制机体自噬有关。

血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是临床常见的一种缺血性、闭塞性及进行性血管疾病，多发于四肢，其中下肢最为多见[1]。间歇性跛行、患肢苍白等是TAO患者的主要表现，更有甚者会发生组织溃疡或坏死，同时还具有难治愈、易复发、易致残等特点，因此探寻一种有效的治疗手段尤为必要[2]。TAO患者常出现凝血系统及内皮功能异常等现象，所以明确其凝血系统及内皮功能情况有利于临床诊断及治疗[3]。细胞自噬是维持细胞稳定及自我调节的一个重要途径。有研究表明，血管壁细胞自噬对血管内皮功能及相关疾病调节具有重要作用[4]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是内皮细胞的前体细胞，可定向分化为内皮细胞，研究表明，内皮细胞对促进内皮损伤后的修复和血管再生有着重要意义[5]。Rho激酶是最早发现的Rho效应物，其在包括TAO在内的多种心血管疾病的发生、发展中扮演着重要角色，可通过介导细胞增殖、凋亡、迁移等参与疾病进程[6]。目前临床上治疗TAO主要以口服药物为主，但效果一般，且容易对患者肠胃造成刺激，而中药外敷则避免了这种情况，其可直接作用于患处，并快速发挥效用，故中药外敷可作为治疗TAO的有效手段[7]。生肌玉红膏在消肿排脓、生肌敛疮、清热解毒及止血生肌等方面发挥着重要作用，且有研究表明其可有效改善创面内环境，提高局部免疫力，对创面愈合有奇效[8]。但其在TAO中的作用机制尚未明确，因此，本文就生肌玉红膏通过自噬对血栓闭塞性脉管炎大鼠凝血系统、EPCs分化及Rho激酶活性的影响进行研究探讨，为临床治疗TAO提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

高速冷冻离心机（型号：5024R，德国Eppendorf公司）；凝血检测仪（型号：STA-R Evolution，北京思塔高有限责任公司）；光学显微镜（型号：BX53，日本OLYMPUS公司）；流式细胞仪（型号：Life Attune，江苏博美达生命科学有限公司）。

1.2 实验动物与试剂

40只SD雄性大鼠（SPF级，体重200~250 g）购自温州医科大学动物实验室[许可证号：SCXK（浙）2020-0001]。本研究经温州医科大学实验动物伦理委员会审批（批件号：xmsq2023-1132）。

复方七叶皂苷钠凝胶（批号：220921，规格：10 g，山东绿叶制药有限公司）；生肌玉红膏（主要成分：白芷、虫白蜡、当归、甘草、轻粉、血竭、紫草，批号：Z11021000，北京同仁堂股份有限公司）；月桂酸钠（批号：S103038，规格：10 g，上海信裕生物科技有限公司）；苏木精染液（批号：H9627，美国Sigma公司）；RIPA裂解液（批号：SY4680，北京伊塔生物科技有限公司）；磷酸酶抑制剂（批号：SY4646，北京伊塔生物科技有限公司）；伊红染液（批号：AG1 100-100  ml，上海吉至生化科技有限公司）；ECPs培养液（批号：CC-3202，北京泽平科技有限责任公司）；ECL检测试剂盒（批号：KGP1123，江苏凯基生物科技发展有限公司）；微管相关蛋白轻链Ⅱ（LC3-Ⅱ）抗体（批号：CBA-5115-E，艾美捷科技有限公司）；苄氯素1（Beclin1）抗体（批号：PL0402489，深圳豪地华拓生物科技有限公司）；CD34抗体（批号：YS-8996R，上海雅吉生物科技有限公司）；血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗体（批号：FNab09466，武汉菲恩生物科技有限公司）；Rho激酶抗体（批号：3792-100，上海宾智生物科技有限公司）；GAPDH抗体（批号：60004-1-Ig，美国Proteintech公司）；血管内皮细胞（批号：YS2185C，上海雅吉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组及模型制备

大鼠随机分为模型组、七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组和假手术组，每组10只。对模型组、七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组进行血栓闭塞性脉管炎建模[9-10]，假手术组仅分离股动脉，不进行造模，同时注射等量生理盐水。若肢体表现出缺血性改变、坏死时表明建模成功[10]。七叶皂苷钠凝胶组大鼠患处直接涂抹七叶皂苷钠凝胶，生肌玉红膏组大鼠患处直接涂抹生肌玉红膏0.4  mg/cm²，两组均每天1次，持续2周，假手术组、模型组同期给予凡士林涂抹[11]。

1.3.2 检测指标及方法

大鼠血管组织病理检测：取部分血管组织，石蜡切片，苏木精和伊红染色，经脱水和封固后，用光学显微镜观察病理变化。大鼠自噬情况检测：免疫印迹法用来测定血管组织自噬标志蛋白LC3- Ⅱ、Beclin1表达，计算相对GAPDH表达量。

凝血系统监测：用凝血检测仪检测并记录大鼠血清血浆纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和国际标准比率（international normalized ratio，INR）的含量。

ECPs的提取：取各组骨髓将其制骨化髓单细胞悬液，在试管中加入等体积淋巴细胞分离液，然后加入细胞悬液，694×g离心20 min，取中间白雾层，PBS洗涤后，111×g离心5 min，取白雾层，再次离心后，弃上层溶液，加入ECPs培养液（EGM-2MV），调整细胞密度为106个/ mL，将其接种于培养瓶中，常规培养至细胞贴壁备用。

EPCs分化检测：采用流式细胞仪检测。取各组ECPs，吸去培养液，PBS洗涤3次，0.25%的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，111×g常温离心5 min，弃上清液，冰上封闭20 min，再次离心，弃上清液后PBS洗涤、重悬后，加入75%乙醇冰上固定20 min，将细胞密度调整为106 /mL，按照抗体说明书加入CD34及vWF抗体，混匀后30 r/min摇床避光温育30 min，PBS洗涤3次，再用500倍PBS重悬细胞，然后用流式细胞仪检测CD34及vWF的表达比率。CD34是未分化的EPCs表面标志物，vWF是分化成内皮细胞的EPCs表面标志物[12]，因此本文选择检测CD34及vWF来分析生肌玉红膏对EPCs分化的诱导情况。

Rho激酶活性检测：采用免疫组织化学法检测，取各组血管组织，常规石蜡包埋、切片后，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原修复，室温封闭10 min，添加Rho激酶一抗（稀释比例1 ∶ 500），37  ℃温育2 h；添加生物素偶联的二抗（稀释比例1 ∶ 1 000），37 ℃温育0.5 h，接着添加亲和素偶联的三抗（稀释比例1 ∶ 1 000），37 ℃温育0.5 h，DAB显色，脱水、透明、封固后，在显微镜下观察。

体外实验[13]：首先将生肌玉红膏用70%乙醇回流提取2次，然后添加血竭超临界CO₂萃取物，摇匀后定容到1 000 mL，制备成0.2 mg/mL的生肌玉红膏提取液，然后取血管内皮细胞加入75  μmoL/ L过氧化氢培养4 h以建立细胞损伤模型，最后取损伤后的内皮细胞将其分成两组，一组加入100 μL 0.2 mg/mL的生肌玉红膏提取液，记为观察组；另一组加入同体积的PBS，记为对照组，培养48 h后，采用免疫印迹法测定LC3- Ⅱ、Beclin1表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0进行数据统计分析。数据以表示，多组间比较行单因素方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血管组织病理学变化

假手术组大鼠血管结构清晰完整，且无血栓及炎性细胞浸润现象，而模型组血管壁明显变薄，内皮细胞明显变形、坏死、脱落，且出现缔结组织增生；与模型组相比，七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组两组血管形态有所改善，血栓明显减少，只见轻度周围结缔组织增生及内皮细胞和弹力纤维脱落，且生肌玉红膏组比七叶皂苷钠凝胶组改善明显。具体见图1。

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  图1 各组大鼠血管组织结构HE染色结果（100x）

  Figure 1.HE staining results of vascular tissue structure of rats in each group (100x)

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2.2 自噬标志蛋白LC3比较

相较于假手术组，模型组血管组织LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达升高，P62蛋白表达降低（P ＜0.05）；相较于模型组，七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组血管组织中自噬标志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表达均降低（P＜0.05），P62蛋白表达升高（P＜0.05）；但与七叶皂苷钠凝胶组相比，生肌玉红膏组变化显著（P＜0.05）。具体见图2。

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  图2 各组大鼠血管组织中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、P62表达（n=10）

  Figure 2.Expression of autophagy marker proteins LC3-Ⅱ, Beclin1 and P62 in vascular tissues of rats in each group (n=10)

  注：A为假手术组；B为模型组；C为七叶皂苷钠凝胶组；D为生肌玉红膏组；与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与七叶皂苷钠凝胶组相比，cP＜0.05。

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2.3 凝血系统指标比较

与假手术组比较，模型组血清PT、INR降低，FIB升高（P＜0.05）；七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组与模型组比较，PT、INR升高，FIB降低（P ＜0.05），生肌玉红膏组的上述指标水平与七叶皂苷钠凝胶组的差异显著（P＜0.05）。具体见表1。

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  表格1 各组大鼠凝血系统指标（x ± s，n=10）

  Table 1.Coagulation system indexes of rats in each group (x ± s, n=10)

  注：与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与七叶皂苷钠凝胶组相比，cP＜0.05。

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2.4 各组大鼠EPCs分化比较

表2和图3显示，与假手术组比较，模型组EPCs中CD34阳性表达率升高（P＜0.05），vWF阳性表达率降低（P＜0.05）；与模型组比较，七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组两组EPCs中CD34阳性表达率降低，vWF阳性表达率升高（P ＜0.05）；生肌玉红膏组CD34和vWF阳性表达率与七叶皂苷钠凝胶组的变化明显（P ＜0.05）。

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  表格2 各组大鼠EPCs中CD34及vWF的表达（x ± s，%，n=10）

  Table 2.Expressions of CD34 and vWF in EPCs of rats in each group (x ± s, %, n=10)

  注：与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与七叶皂苷钠凝胶组相比，cP＜0.05。

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  图3 各组大鼠EPCs中CD34及vWF的表达

  Figure 3.Expression of CD34 and vWF in EPCs of rats in each group

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2.5 各组大鼠血管组织中Rho激酶活性比较

与假手术组比较，模型组大鼠血管组织中Rho激酶蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，七叶皂苷钠凝胶组、生肌玉红膏组血管组织中Rho激酶蛋白表达均降低（P＜0.05），且生肌玉红膏组比七叶皂苷钠凝胶组降低显著（P ＜0.05）。具体见图4和图5。

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  图4 各组大鼠Rho激酶蛋白表达图（免疫组织化学染色，100×）

  Figure 4.Rho kinase protein expression of rats in each group (immunohistochemical staining, 100×)

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  图5 各组大鼠Rho激酶蛋白表达图（n=10）

  Figure 5.Expression of Rho kinase protein in rats in each group (n=10)

  注：与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与七叶皂苷钠凝胶组相比，cP＜0.05。

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2.6 体外实验结果

与对照组，观察组细胞中自噬标志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低（P＜0.05），P62表达升高（P＜0.05）。具体见图6。

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  图6 对照组及观察组细胞中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达（n=10）

  Figure 6.Expression of autophagy marker proteins LC3-Ⅱ and Beclin1 in control group and observation group (n=10)

  注：与对照组相比，aP＜0.05。

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3 讨论

TAO多发于青壮年男性，其病程长、痛苦大，发病率及致残率也同样较高，所以有“第二癌症”之称，极大危害患者身体健康[14]。因此，寻找有效的靶向药物对TAO的临床治疗至关重要。据报道，中药对TAO临床治疗的效果良好，能够显著缩短治疗进程，加速伤口愈合，减少致残率[15-16]。因此，本文就生肌玉红膏通过自噬对血栓闭塞性脉管炎大鼠凝血系统、EPCs分化及Rho激酶活性的作用进行探讨，为TAO治疗提供新的见解和思路，也为生肌玉红膏作为一种有前景的治疗TAO的药物的进一步开发利用提供必要信息。

七叶皂苷钠在抗组织水肿、促进血液循环、减少血管通透性、消炎、镇痛等方面具有重要作用，可用于湿疹、伤口溃烂、烧伤等方面的治疗，故本研究以七叶皂苷钠凝胶作为阳性对照组 [17]。生肌玉红膏专治痛疽、溃烂、棒毒等疮，且经世代临床专家证明均有奇效[18]。适当激活自噬能够清除机体内的有害物质，反之对细胞有害，Beclin1、LC3-Ⅱ是自噬标记蛋白，被用于评估自噬的高低[19-21]。PT、INR、FIB是凝血系统中重要的指标，可有效反映凝血功能障碍[22]。TAO的作用机制尚不明确，但有研究表明其可能与血管细胞过度自噬有关，而TAO多数患者都会导致患处出现坏死或溃疡的情况，这使得机体的凝血系统也出现异常，从而影响机体纤溶功能及凝血功能[23]。本实验结果显示，生肌玉红膏可有效改善TAO大鼠病理形态，并可抑制血管细胞自噬，同时改善凝血系统功能，其效果优于七叶皂苷钠，说明生肌玉红膏可被开发为治疗TAO的临床药物。对于TAO大鼠，生肌玉红膏可能是通过促进自噬相关蛋白降解和自噬溶酶体形成来抑制自噬，从而促进表皮干细胞的增殖和分化，提高血管通透性及细胞外基质的合成等，达到改善创面微循环、提高机体免疫力的目的，最终有效改善凝血系统，使症状得到缓解。秦亚鹏等[24]研究发现，生肌玉红膏对血栓闭塞性脉管炎患者伤口愈合有显著疗效，且无不良反应，可以临床推广应用，这与本文结果类似。

EPCs是一种可分化为成熟内皮细胞的潜能干细胞，可受到生理或病理的刺激，迁移、归巢到缺血或血管损伤部位，从而参与新生血管生成及血管内膜损伤修复，但其在机体内的分化程度并不高，需要给予外来刺激诱导其分化，而CD34是未分化的EPCs表面标志物，vWF是分化成内皮细胞的EPCs表面标志物，因此本文选择检测CD34及vWF来分析生肌玉红膏对EPCs分化的诱导情况[25]。本文研究表明，与模型组比较，生肌玉红膏组、七叶皂苷钠凝胶组两组EPCs中CD34阳性表达率显著降低，vWF阳性表达率显著升高，说明生肌玉红膏显著促进EPCs分化。TAO通常由于血管闭塞，导致血液流动不畅，使得局部组织缺血，肢体末端坏死，最终导致脱疽的产生，而皮肤作为抵御外来因素的第一道屏障，其完整性是必不可少的存在，因此促进内皮细胞及新生血管的增生就显得尤为重要。而生肌玉红膏可能是通过刺激患处的免疫应答，加速血液循环，增加药物渗透力，从而发挥局部或全身作用，进而维持特定细胞系状态，促进VEGF等血管发生中枢调节因子的表达以及分化相关信号通路的激活等，最终达到促进EPCs分化并有效恢复创面的目的。研究发现，3-甲基腺嘌呤可通过适当调控细胞自噬来提高血栓局部EPCs的增殖分化，并有效促进毛细血管生成及血栓机化和再通，这与本文结果类似[22]。

Rho激酶是位于小鸟苷三磷酸结合蛋白RhoA下游的靶点，其主要作用为调节细胞骨架蛋白的合成、降解、收缩及移动等，同时也参与细胞的基本生命过程[18]。有研究表明Rho激酶活性增加可导致血管痉挛，而TAO的主要病因之一即血管神经调节障碍导致的长期血管痉挛，因此Rho激酶活性的增加可能导致TAO的病发[26]。本文研究发现，与模型组比较，生肌玉红膏组、七叶皂苷钠凝胶组血管组织中Rho激酶的蛋白表达均明显降低，这说明生肌玉红膏可有效降低Rho激酶活性，且体外实验表明生肌玉红膏可显著抑制细胞自噬，这说明生肌玉红膏可能通过自噬发挥作用。生肌玉红膏治疗TAO的机制可能为，生肌玉红膏通过扩张修复血管，增加血管壁弹性、降低血小板凝聚速率等抑制络氨酸激酶G蛋白偶联受体表达，从而抑制Rho激酶活性、抑制肌球蛋白轻链激酶磷酸化，最终达到抑制血管平滑肌收缩、减少血管痉挛的目的。张丽美等[27]研究发现，RhoA/ROCK信号通路与高血压、冠心病等心血管疾病的发生和发展密切相关，因此ROCK抑制剂也为心血管疾病的治疗提供了新思路，这与本文结果类似。

综上所述，生肌玉红膏可有效改善血栓闭塞性脉管炎大鼠的凝血功能，促进EPCs分化，降低Rho激酶活性，其机制可能与抑制机体自噬有关，为开发治疗血栓闭塞性脉管炎的新药物提供一定的理论依据。

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