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目的 研究中药材桦褐孔菌的生药鉴别方法及特征。
方法 从东北原产地采集样品，采用来源、分子生物学、性状、显微等鉴定法和HPLC法对桦褐孔菌药材和其非纯粹菌体、伪品进行研究。
结果 桦褐孔菌外形为瘤状团块，微观构造为菌丝紧密交联状，药用部位为菌核，而非当前中药材标准所述的“子实体”。桦褐孔菌药材中偶见极少量的菌管组织与菌肉。管孔类圆形，直径130~190 μm，破裂；管壁构造特别，由纵向排列的直径为2~5~8 μm的小包室构成。非纯粹菌体系被菌丝渗透已腐朽的宿主木质部，所含栓菌酸和麦角甾醇含量显著低于纯粹菌核（P＜0.05）。桦褐孔菌与伪品树瘤的显微结构和HPLC指纹图谱区别明显。
结论 所用方法能对桦褐孔菌药材进行真伪鉴别以及药材品质辨识。
桦褐孔菌，又名白桦茸、桦树茸、斜生纤孔菌，分类上属于锈革孔菌科褐孔菌属斜生褐孔菌Phaeoporus obliquus（Pers. ∶ Fr.）J. Schroet.，但桦褐孔菌Inonotus obliquus的学名使用更为广泛，已被国内外学者接受[1-3]。桦褐孔菌是一种珍贵药用真菌，产于俄罗斯西伯利亚、芬兰、波兰、朝鲜、我国东北等地区，寄生在桦属树木上。早先在16~17世纪，在西伯利亚和其他东欧国家民间用桦褐孔菌泡水当茶饮，治疗和预防心血管疾病、胃肠癌和糖尿病[4-5]。20世纪60年代，开始引起医学界高度重视，从20世纪90年代起，在我国逐渐被人们所关注。目前，国内外已开展大量的有关桦褐孔菌的化学成分和生物活性以及疗效的报道[6-8]，其所含多糖、三萜等具有抗肿瘤、降血糖、降脂等作用，临床多用于慢性病的治疗，但关于药材的鉴定方法研究不多。桦褐孔菌作为一种药材，前苏联政府将之收载于《苏联药典（第11版）》。在我国，仅被《山东省中药材标准（2012年版）》和《湖北省中药材质量标准（2018年版）》收载[9- 10]。研究发现，两个地方标准所记载的药用部位为“子实体”，与实际情况不符。本研究团队从临床以及玉林、 邵阳、亳州药材市场所见桦褐孔菌皆为菌核。文献报道中也存在“子实体”与“菌核”说法不一的情况 [4, 11-12]。考虑到桦褐孔菌生长在寒冷高海拔地区，尚未实现大规模人工种植[13]，药材全部来源于野生，故研究人员对桦褐孔菌的原产地进行考察，厘清桦褐孔菌的药用部位，研究其鉴定方法。
1 材料
1.1 主要仪器
PH100-DB310U-PL生物显微镜（江西凤凰光学集团有限公司）；ES 225SM-DR电子天平（瑞士普利赛斯公司）；T100 PCR扩增仪（美国伯乐公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 1600凝聚成像系统（上海天能生命科学有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司）；5425 R离心机（德国eppendorf公司）；Alliance e2695型高效液相色谱仪、2998型二极管阵列检测器（美国Waters公司）；KQ- 500VDE双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW177高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T超纯水器（成都超纯科技有限公司）。
1.2 主要药品与试剂
样品均为野外采集，样品1（产地：吉林省安图县）、样品2（产地：吉林省安图县）、样品3（产地：黑龙江省牡丹江市穆棱共和乡）、样品4（产地：吉林省桦甸市）经湖北省中医院朱田密副主任药师鉴定、湖北中医药大学陈科力教授复核为桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát.的菌核；样品5与样品6（产地：吉林省安图县）鉴定为伪品树瘤；2×Taq酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；引物由生工生物工程股份有限公司合成；栓菌酸（自制，纯度93.9%）；桦褐孔菌醇（上海源叶生物科技有限公司，批号：B50360，纯度≥95%）；羊毛甾醇（上海源叶生物科技有限公司，批号：B27054，纯度≥95%）；麦角甾醇（中国食品药品检定研究院，批号：111845-202105，纯度96.6%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 原植物形态学鉴定
采用野外考察的方法，于秋冬季，在长白山的山林中寻找桦褐孔菌，对样品进行观察，拍照，测量和采集。结果表明，桦褐孔菌寄生在桦属植物的活立木上，菌核多年生，呈现瘤状，直径10~20 cm，外表黑灰或黑色，内部黄色，无柄，菌核的基部在树皮下面，与宿主木质部直接相连，不易分离，生境图见图1A（以样品1为例）。桦褐孔菌是大型真菌，应当有子实体和菌核两种形态。但桦褐孔菌很少形成子实体，在野外常以菌核形态显现[1, 12]。从资源角度支持其药用部位是菌核，不是子实体。
伪品树瘤的形态呈瘤状，灰褐色，外观与桦褐孔菌相似，生境图见图1B（以样品5为例）。
2.2 分子生物学鉴定
利用基于真菌核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）的系统发育分析对所采集样品进行鉴定[14-15]。DNA提取：研磨组织块，移入盛有CTAB的小管，55~65 ℃孵育，加氯仿异戊醇抽提后离心，上清液加醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，离心，弃上清，用乙醇洗沉淀2次，干燥后用TE溶解。PCR扩增引物为ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）、ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’），扩增条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火40 s ，72 ℃延伸40 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化、克隆，由生工生物工程股份有限公司进行测序。获得序列校正后，在GenBank核酸序列数据库中通过BLASTn进行同源序列比较搜索。根据搜索结果，下载与之相关序列，以ClustalX 1.83软件进行序列比对，采用Mega 7.0软件进行系统学分析，构建系统发育树（图2）。
结果显示，样品1~3皆与Inonotus obliquus（GenBank号：GU903006）序列同源性为100%，系统发育分析表明样品与Inonotus obliquus FS656163以100%支持率聚在一起，鉴定为桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát.。样品4未能提取出DNA，考虑因其放置时间较久所致，而形态学鉴定支持其为桦褐孔菌。
2.3 性状鉴别
将所采集的新鲜桦褐孔菌菌核自然晾干，成为药材。药材的性状特征为瘤状、块状的菌核，大小不等，直径可达20 cm，质重。外表面灰黑色，粗糙，具裂纹及深沟，黑色外层致密，厚度并不均匀，渐向黄褐色内部过渡，致密，质硬、脆；菌核内部实心，广阔，黄褐色至黄棕色，有的靠近外层处仍然致密，硬、脆；内部常不如灰黑色外层致密，相对泡松。药材图与局部放大图见图3和图4。
桦褐孔菌菌核旁被菌丝侵染的宿主木质部是非纯粹的菌体，颜色和质地近似桦褐孔菌，却有木质纹理，黄棕色木质纹理间夹杂着黄白色条纹（图5）。由于该部分与纯粹菌核的界限常不够分明，药材中容易包含此部分。
伪品树瘤的性状为灰黑色瘤状物，质地不均一，较酥松。与桦褐孔菌的质地和内部有区别（图6）。
2.4 显微鉴别
采用徒手切片法，有目的性的切取桦褐孔菌的组织部位，桦褐孔菌菌核用水装片，非纯粹菌体、树瘤用水合氯醛透化后装片，置于显微镜下观察。
桦褐孔菌菌核的黑色外层由棕色菌丝密结交联而成，菌丝直径1~3~5 μm，有分枝，壁不厚（图7A）。黄褐色内部菌丝色浅，交错，直径0.7~1.5~2 μm（图7B）。褐色菌管偶见，量少，夹杂在菌核上，不连续分布，或位于树皮之下紧邻寄主木质部；菌管层厚（管长）0.5~1 cm，菌管撕裂，有填充物，单层或分层；层间不规则，朝向不一致，还间隔有褐色较致密菌核组织；管孔类圆形、直径130~190 μm，破裂；管壁由纵向排列的小包室构成，小包室横切面直径2~5~8 μm（图7C）。菌肉层偶见，量少，紧邻寄主，在菌核与寄主的剥离面，或在树皮之下与菌管层之间；菌肉层薄，不规则，厚度约1 mm，深棕色，绒状，由棕色菌丝构成，直径0.7~2.5~4 μm，有分枝，壁薄（图7D）。菌管与菌肉层属于子实体的组成部分。在样品1上观察到菌管，在样品4上观察到菌管和菌肉，说明桦褐孔菌菌核上可存在少量的子实体构造，这是本文的发现，并且桦褐孔菌管壁由微小包室构成的特征较特别，与灵芝属不同，灵芝属的菌管管壁的构造是交联密结的菌丝构成[16-17]。
非纯粹菌体的显微结构是菌丝体包绕木质部细胞（图7E2），经水合氯醛透化除去菌丝之后，显出木纤维和木射线细胞构造（图7E3），即寄主的木材特征[18]。伪品树瘤的显微结构为植物细胞组织，无菌丝（图7F）。由此可见，显微鉴别可以区分桦褐孔菌菌核、非纯粹菌体与伪品树瘤。
2.5 桦褐孔菌菌核与非纯粹菌体含量比较
2.5.1 色谱条件
采用Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0~12 min，90%→95% A；12~15 min，95% A；15~16 min，95%→100% A；16~39 min，100% A；39~40 min，100%→90% A）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；栓菌酸、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇检测波长为203 nm，麦角甾醇检查波长为282 nm；进样量为20 µL[19]。
2.5.2 溶液的制备
2.5.2.1 供试品溶液
取桦褐孔菌药材粉末（过四号筛）2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，浸泡2 h，超声处理（功率：400 W，频率：45 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液[19]。
2.5.2.2 对照品溶液
取栓菌酸、桦褐孔菌醇、麦角甾醇、羊毛甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇配成浓度分别为74.74、156.10、23.18、64.79 μg/mL的混合对照品溶液[19]。
2.5.3 样品含量测定
取样品1~样品3的菌核及菌核旁的非纯粹菌体（样品4未带非纯粹菌体，故不进行含量比较），分别按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，然后按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以外标法计算栓菌酸、桦褐孔菌醇、麦角甾醇、羊毛甾醇的含量（每个样品平行测定2次）。结果见表1，桦褐孔菌菌核和非纯粹菌体中均含有这4种成分。采用SPSS 27.0软件进行统计分析，试验数据符合正态分布，采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果表明，桦褐孔菌菌核中的栓菌酸、麦角甾醇的含量高于非纯粹菌体，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.6 HPLC指纹图谱鉴别桦褐孔菌和伪品树瘤
2.6.1 色谱条件
除了检测波长为203 nm以外，其余同“2.5.1”项[20]。
2.6.2 溶液的制备
2.6.2.1 供试品溶液
取桦褐孔菌药材粉末2 g（过四号筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液[20]。
2.6.2.2 对照品溶液
同“2.5.2.2”项下方法[20]。
2.6.3 HPLC指纹图谱相似度分析
取桦褐孔菌药材（样品1~样品4）、伪品树瘤（样品5~样品6），分别按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，再按“2.6.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图（图8）。经与对照品比较，树瘤中含有麦角甾醇（色谱峰3），但不含栓菌酸（色谱峰1）、桦褐孔菌醇（色谱峰2）、羊毛甾醇（色谱峰4）；而桦褐孔菌含有这4种成分。将上述样品1～样品4的桦褐孔菌色谱图采用AIA格式导入中药色谱图指纹图谱相似度评价系统（2012）版，生成桦褐孔菌对照图谱，再将样品5、样品6即伪品树瘤的图谱与之进行匹配，计算相似度，结果2份伪品树瘤与桦褐孔菌对照图谱之间的相似度仅为0.060、0.096，表明伪品树瘤与桦褐孔菌的图谱特征区别明显。
3 讨论
经查阅文献[1, 12]，实地调查与采样，以及对药材结构的研究，证明桦褐孔菌药材的药用部位以菌核为主，而非子实体。虽然菌核上有时带有残存的不完整的子实体构造，如菌管、菌肉，但其在药材上所占的比例极小。故建议现行中药材标准将桦褐孔菌的药用部位更正为“菌核”。
在桦褐孔菌采摘过程中，容易携带被菌体侵蚀的宿主木质部，该部分也含有有效成分，但含量比菌核低，品质较差。桦褐孔菌在真菌分类中，是锈革孔菌科褐孔菌属中的唯一物种[1]，伪品少见。树瘤是与之在外观上较为相似的伪品。本研究表明，性状、显微以及HPLC指纹图谱鉴别法可将两者进行区分。
野生桦褐孔菌的菌管很少被观察到，《中国真菌志》等专著报道过桦褐孔菌菌管的宏观形态，但未报道其微观结构。就目前的文献来看，本研究首次探讨了野生桦褐孔菌菌管的微观结构。现行药品标准对桦褐孔菌的显微鉴别仅采用粉末显微鉴别法 [9-10]。实践表明，桦褐孔菌粉碎后，成为菌丝段，反而特征不强。陈科力老师对动物药的鉴别，会针对不同部位，采取有目的切片方式。笔者认为，大型真菌药材也是如此，其体积大，无法整体切片，采取有针对性的切片法便于突出其特征。
致谢：中国科学院微生物研究所董彩虹教授在桦褐孔菌的鉴定方面给予帮助。
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