目的  探讨硫利达嗪对肝癌Huh-7细胞生物行为的影响和机制。

方法  肝癌Huh-7细胞分为对照组及硫利达嗪低、中、高浓度组。转染miR-3174模拟物及其阴性对照、miR-3174抑制物及其阴性对照至Huh-7细胞，并用硫利达嗪处理miR-3174 模拟物。CCK-8法和平板克隆实验检测硫利达嗪对Huh-7细胞增殖的影响；划痕愈合实验和Transwell实验检测硫利达嗪对Huh-7细胞迁移和侵袭的影响；实时荧光定量PCR检测硫利达嗪对Huh-7细胞中miR-3174表达的影响。蛋白质印迹法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达。并通过上述方法检测干扰miR-3174表达或上调miR-3174联合硫利达嗪对Huh-7细胞生物行为的影响。

结果  硫利达嗪处理和干扰miR-3174表达后Huh-7细胞中miR-3174表达降低，增殖、迁移和侵袭能力及N-cadherin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高（P＜0.05）。上调miR-3174表达可减弱硫利达嗪处理对Huh-7细胞恶性生物学行为的影响。

结论  硫利达嗪通过下调miR-3174表达可抑制肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭。

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均较高[1]。手术加辅助放化疗是早期原发性肝癌的一线治疗方法，但大多数肝癌患者确诊时已为晚期或发生转移，无根治治疗策略，总体5年生存率仅为14%~44.5%[2]。因此，探讨肝癌转移的分子机制、开发有效的治疗策略对改善肝癌患者长期预后意义重大。硫利达嗪是一种抗精神病药物，广泛用于严重精神障碍的治疗[3]。近年研究报道硫利达嗪可诱导多种癌细胞凋亡、抑制血管生成、抑制转移、逆转化疗耐药，具有抗癌活性[4-7]。然而，硫利达嗪在肝癌中的抗癌活性并未完全阐明。微小RNA（miRNA）参与调控细胞增殖、凋亡、转移等过程[8]。研究发现miR-3174在肝癌组织和细胞系中表达上调，其表达水平与肿瘤大小、Edmondson分级相关，并促进肝癌细胞增殖、抑制细胞凋亡[9]。然而，miR-3174对肝癌细胞转移的影响尚未见报道。本研究以肝癌细胞Huh-7为研究对象，探讨硫利达嗪、miR-3174对其生物行为的影响，并以miR-3174为切入点探讨硫利达嗪抑制肝癌的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞Huh-7（武汉普诺赛生命科技公司）；硫利达嗪（纯度99%，货号：Y0000541，美国Sigma公司）；miR-3174抑制物（anti-miR-3174）、模拟物（miR-3174-mimics）以及各自的阴性对照（anti-miR-NC、miR-mimics-NC）、PCR引物均由上海生工生物提供；细胞计数试剂盒（CCK-8）、TRIzol试剂（北京索莱宝生物公司）；一抗E-钙黏蛋白（E-Cadherin，货号：YT710）、N-钙黏蛋白（N-Cadherin，货号：YT745）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，货号：SY0636）、一步法miRNA反转录试剂盒、miRNA荧光定量PCR试剂盒（北京百奥莱博生物公司）。

Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；ABI Prism® 7500型实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）；Eclipse Ti-S倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；DYY-6E型电泳仪、WD-9413A型凝胶成像分析系统（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

Huh-7细胞在DMEM培养基（含1%青/链霉素、10%胎牛血清）中培养，当细胞铺满瓶底的80%时胰酶消化，按照1 ∶ 4比例传代，每周换液3次。以2×10⁵个/孔的密度将第5代对数期Huh-7细胞接种至6孔板，当细胞铺满6孔板50%时进行瞬时转染，即用Lipofectamine^TM 2000分别转染miR-mimics-NC、miR-3174-mimics、anti-miR-NC、anti-miR-3174至Huh-7细胞，转染48 h收集Huh-7细胞，采用RT-qPCR检测miR-3174表达以验证转染效果。实验分组：分别用含0，10，20，30 μmol·L^-1硫利达嗪[3]的培养液孵育Huh-7细胞，分别命名为对照组（control）、低、中、高浓度硫利达嗪组（Thioridazine-L、M、H）。转染anti-miR-3174、anti-miR-NC的Huh-7细胞分别命名为anti-miR-3174组、anti-miR-NC组；用含30 μmol·L^-1硫利达嗪的培养液孵育转染miR-3174-mimics、miR-mimics-NC的Huh-7细胞，别命名为硫利达嗪+ miR-NC组、硫利达嗪+miR-3174组。

1.2.2 CCK-8法检测Huh-7细胞增殖

以6×103个/孔的密度将未转染或转染的Huh-7细胞接种于96孔板，按照分组给予对应浓度的硫利达嗪，37℃培养箱孵育24 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，培养箱再孵育2 h。用分光光度计测定光密度（OD）值，检测波长450 nm，并计算细胞抑制率[（OD对照孔-OD实验孔）/（OD对照孔-OD空白孔）×100%]。

1.2.3 平板克隆实验检测Huh-7细胞增殖

于培养板（直径60 mm）中接种各组Huh-7细胞，每孔1 000个，孵育2周。当出现细胞集落时终止培养。将Huh-7细胞用甲醇固定、结晶紫染色，显微镜下计数克隆形成数。

1.2.4 划痕实验检测检测Huh-7细胞迁移能力

将对数生长期的Huh-7细胞接种于6孔板，当细胞90% 融合时，用无菌100 μL枪头在细胞生长单层垂直划线，PBS漂洗细胞2次。随后加入含有不同浓度硫利达嗪的无血清培养基，对照组加入相同浓度的二甲基亚砜无血清培养基，继续培养24 h后进行拍照；每组随机选取4个视野，采用Image J软件对图片进行分析处理，计算划痕愈合率[（1-划痕宽度24 h/划痕宽度0 h）×100%]。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭

在Transwell上室（含基质胶）加入200 μL各组Huh-7细胞悬液（5×10⁵个/mL），下室加入500 μL培养基（含血清）。培养24 h后，将穿膜细胞用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下计数侵袭数量。

1.2.6 蛋白质印记法检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，通过电泳分离蛋白并转膜。于5%脱脂奶粉中将膜封闭2 h后，4℃下与一抗E-cadherin、N-cadherin、GAPDH（1 ∶ 800）孵育过夜，室温下与二抗（1 ∶ 1 500）孵育2 h，显影。Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量（与GAPDH比较）。

1.2.7 RT-qPCR检测Huh-7细胞中miR-3174表达

按照TRIzol试剂使用说明提取各组Huh-7细胞的总RNA。以总RNA为模板，合成第一链cDNA，随后进行扩增反应。反应程序：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共40个循环，采用2^-ΔΔCt法计算miR-3174相对表达量。miR-3174上游引物：5’-GTCAGGGATGGCAAC TTTATCCACT-3’，下游引物：5’-GGAACCTG AAGGTCCGAGTCA-3’；U6上游引物：5’-GCTT CGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCAGAA TTTGCGTGTCAT-3’。

1.3 统计分析

SPSS 22.0统计软件用于统计分析，计量资料以x±s表示。两组间比较采用t检验，3组及3组以上的组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 硫利达嗪对Huh-7细胞增殖的影响

与对照组比较，低、中、高浓度硫利达嗪组Huh-7细胞克隆形成数显著减少，增殖抑制率显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且硫利达嗪对Huh-7细胞克隆形成和增殖的抑制作用具有浓度依赖性。结果见图1和表1。

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  图1 硫利达嗪对Huh-7细胞克隆形成的影响

  Figure 1.Effect of thiolidazine on the clonal formation of Huh-7 cells

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  表格1 硫利达嗪对Huh-7细胞增殖的影响

  Table 1.（x±s，n=9）

  Table 1. Effects of thiolidazine on the proliferation of Huh-7 cells (x±s, n=9）

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2.2 硫利达嗪对Huh-7细胞迁移和侵袭的影响

与对照组比较，低、中、高浓度硫利达嗪组划痕愈合率下降，侵袭细胞数减少，N-cadherin表达降低，E-cadherin表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；此外，硫利达嗪对Huh-7细胞迁移和侵袭的影响具有浓度依赖性。结果见图2、图3和表2。

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  图2 迁移侵袭相关蛋白表达

  Figure 2.Expression of migration-invasion related proteins

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  图3 硫利达嗪对Huh-7细胞划痕愈合和侵袭细胞数的影响

  Figure 3.Effect of thiolidazine on scratch healing and the number of invasive cells in Huh-7 cells

  注：A：划痕愈合实验（×100）；B：细胞侵袭实验（结晶紫染色，×200）

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  表格2 硫利达嗪对Huh-7细胞迁移侵袭的影响（x±s，n=9）

  Table 2.Effects of thiolidazine on migration and invasion of Huh-7 cells (x±s, n=9）

  注：与control组比较，aP<0.05；与Thioridazine-L组比较，bP<0.05；与Thioridazine-M组比较，cP<0.05

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2.3 硫利达嗪对Huh-7细胞miR-3174表达的影响

与对照组比较，低、中、高浓度硫利达嗪组Huh-7细胞miR-3174表达显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，硫利达嗪对miR-3174表达的抑制作用具有浓度依赖性。结果见表3。

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  表格3 硫利达嗪对Huh-7细胞miR-3174表达的

  Table 3.影响（x±s，n=9）

  Table 3. Effects of thiolidazine on miR-3174 expression in Huh-7 cells (x±s, n=9)

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2.4 干扰miR-3174表达对Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与anti-miR-NC组相比，anti-miR-3174组Huh-7细胞中miR-3174表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明转染anti-miR-3174后Huh-7细胞中miR-3174表达受到抑制。与anti-miR-NC组比，anti-miR-3174组Huh-7细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少，划痕愈合率和N-cadherin表达水平降低，增殖抑制率和E-cadherin表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见图4、表4和图5。

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  图4 迁移侵袭相关蛋白表达

  Figure 4.Expression of migration and invasion related proteins

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  表格4 干扰miR-3174表达对Huh-7细胞增殖、迁移侵袭的影响（x±s，n=9）

  Table 4.Effects of interference with miR-3174 expression on proliferation, migration and invasion of Huh-7 cells (x±s, n=9)

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  图5 干扰miR-3174表达对Huh-7细胞克隆形成、划痕愈合和侵袭细胞数的影响

  Figure 5.Effects of interference with miR-3174 expression on clonal formation, scratch healing and the number of invasive cells in Huh-7 cells

  注：A：细胞克隆形成；B：划痕愈合实验，×100；C：细胞侵袭实验（结晶紫染色，×200）

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2.5 上调miR-3174逆转了硫利达嗪对Huh-7细胞恶性表型的作用

与硫利达嗪+miR-NC组比，硫利达嗪+ miR-3174组克隆形成数和侵袭细胞数增加，miR-3174表达、划痕愈合率、N-cadherin表达升高，增殖抑制率和E-cadherin表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见图6、图7和表5。

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  图6 迁移侵袭相关蛋白表达

  Figure 6.Expression of migration-invasion related proteins

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  图7 上调miR-3174逆转了硫利达嗪对Huh-7细胞恶性表型的影响

  Figure 7.Upregulation of miR-3174 reversed the effect of thiolidazine on the malignant phenotype of Huh-7 cells

  注：A：细胞克隆形成；B：划痕愈合实验（×100）；C：细胞侵袭实验（结晶紫染色，×200）

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  表格5 上调miR-3174逆转了硫利达嗪对Huh-7细胞恶性表型的作用（x±s，n=9）

  Table 5.Upregulation of miR-3174 reversed the effect of thiolidazine on the malignant phenotype of Huh-7 cells (x±s, n=9)

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3 讨论

硫利达嗪已被证实通过多种途径发挥抗癌作用。研究显示硫利达嗪对乳腺癌细胞有显著的增殖抑制作用，诱导肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞、自噬及凋亡，并抑制乳腺癌细胞裸鼠异种移植瘤生长和肺转移[10-12]。胶质瘤中硫利达嗪可激活腺苷酸活化蛋白激酶、Wnt/β-连环蛋白信号通路进而增强p62介导的胶质瘤细胞自噬和凋亡[13]。硫利达嗪还通过诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶依赖性肺癌干细胞G0/G1周期阻滞和凋亡[14- 15]。在本研究中，硫利达嗪可降低Huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与Lu等[5]报道其抗肝癌作用吻合。上皮细胞-间充质转化是一个多步骤的生物学过程，在肿瘤转移初始阶段上皮细胞E-cadherin表达减少，N-cadherin表达增加，获得向周围或远处组织转移的能力[16]。本研究发现，硫利达嗪可降低N-cadherin表达，增加E-cadherin表达，提示硫利达嗪可抑制肝癌Huh-7细胞增殖能力，并通过阻断上皮细胞-间充质转化抑制肝癌细胞迁移和侵袭。

为进一步证实硫利达嗪在肝癌中的作用机制，本研究在体外检测miR-3174表达水平。结果表明，硫利达嗪显著下调miR-3174的表达，且呈浓度依赖性。miR-3174是由约22 nt组成的单链非编码RNA，研究发现miR-3174在肝癌组织和细胞中上调，其表达水平与肿瘤大小和Edmondson分级高度相关，且上调的miR-3174在体内外促进肝癌细胞增殖并抑制细胞凋亡，是肝癌的潜在治疗靶点[17]。此外，miR-3174通过靶向蝶呤-4α-甲醇胺脱水酶2促进结直肠癌细胞增殖和周期进展[18]。本研究证实转染anti-miR-3174干扰miR-3174可降低N-cadherin表达，促进E-cadherin表达，抑制Huh-7细胞的恶性生物学行为。由于干扰miR-3174表达和硫利达嗪抗肿瘤作用类似，且硫利达嗪明显抑制miR-3174表达，表明硫利达嗪的抗肿瘤作用可能与下调miR-3174表达有关。恢复实验表明，上调miR-3174表达减弱了硫利达嗪对Huh-7细胞的抗增殖、抗迁移和侵袭作用。这些结果表明硫利达嗪通过下调miR-3174表达来抑制肝癌细胞Huh-7增殖、迁移和侵袭。

总之，硫利达嗪可抑制肝癌细胞Huh-7的增殖、迁移和侵袭，其机制与下调细胞内miR-3174表达有关，这初步揭示了硫利达嗪抗肝癌的分子机制，为硫利达嗪在肝癌中的应用提供了重要理论依据。

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