目的  提升小金胶囊的质量标准。

方法  采用HPLC法测定醋乳香中11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量。根据15批样品的GC图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）”进行相似度评价和共有峰的确定。按照中国药典方法检测本品中重金属铅、镉、砷、汞、铜的含量。

结果  11-羰基-β-乙酰乳香酸的线性范围为13.346~166.824 μg·mL^-1（r=0.999 8），方法准确度好，平均回收率为100.76%，RSD为1.52%（n=6），专属性、重复性均符合要求。建立了小金胶囊的GC指纹图谱检测方法，标定出11个共有峰，15批样品的相似度均大于0.870，具有良好的相似性。15批样品中的铅、镉、砷、汞、铜含量均符合中国药典参考限度。

结论 本研究所建立的GC指纹图谱检测方法和11-羰基-β-乙酰乳香酸的HPLC含量测定方法，以及对重金属的检查，可作为小金胶囊的质量控制项，用于提升小金胶囊的质量控制标准。

小金胶囊为国家医保乙类品种，并收载于国家基本药物目录，其处方来源于中医经典名方“小金丹”[1-2]，出自清代王洪绪的《外科证治全生集》，由人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、乳香、没药、当归、五灵脂、地龙、香墨10味中药组成，具有散结消肿、化瘀止痛的功效，用于阴疽初起、皮色不变、肿硬作痛、多发性脓肿、瘿瘤、瘰疬、乳岩、乳癖等[3]，为疽症研究的代表方，临床上可用于治疗甲状腺结节、淋巴结核、子宫肌瘤、乳腺增生、乳腺癌、前列腺增生等[4-8]。

小金胶囊处方有植物药、动物药和树脂等多种药源，药材来源广泛，产地众多，且部分为贵重药材。本品制备方法为全部药材粉末入药，因而加强对其包括安全性在内的质量控制尤为重要。本品现行质量标准为中国药典2020年版品种下标准[3]，具有一定的局限性，如除【性状】项以及部分药材的显微鉴别外，仅涉及1个含量测定成分、1味药材的薄层鉴别、1味药材中2个成分的GC鉴别，在【检查】项仅有双酯型生物碱限量检查，对多味药材缺乏控制，安全性有待加强等。课题组前期研究建立了小金胶囊的HPLC指纹图谱检测方法[1]，但本品处方中多味药材含有大量挥发性有效成分[9]，对此尚未进行有效控制。故在现行质量标准的基础上，建立了小金胶囊GC指纹图谱检测方法，以及11-羰基-β-乙酰乳香酸的HPLC含量测定方法，同时增加了重金属检测。本研究旨在更全面地反映和控制小金胶囊的质量，为其临床用药的安全性和有效性提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，包括四元泵、在线真空脱气系统、温控自动进样器、柱温箱、UV紫外检测器、Chromeleon网络版在线工作站；Agilent 6890气相色谱仪，包括FID检测器；Agilent 7900单四极杆电感耦合等离子体质谱仪；CH-1型高纯氢气发生器（武汉科林普丰仪器有限公司）；CA-1型静音无油空气泵（武汉科林普丰仪器有限公司）；METTLER TOLEDO十万分之一电子分析天平、METTLER TOLEDO ME203E型千分之一天平；Milli-Q Direct 8型超纯水仪（德国默克公司）；UA800-DH型超声仪（上海欧河机械设备有限公司）。

1.2 试药

11-羰基-β-乙酰乳香酸（批号：111760-202103，纯度91.3%）、麝香酮（批号：110719-202117，纯度99.2%）对照品均来源于中国食品药品检定研究院。15批小金胶囊样品（健民药业集团股份有限公司，批号：201173、201174、201175、201176、201177、201179、201280、201281、201282、201283、201284、201285、201286、201287、210305，对应编号：S1~S15，规格：0.35 g/粒）。乙腈、甲醇（色谱纯，Meryer公司），其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.1%冰乙酸溶液（83 ∶ 17）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：250 nm；柱温：30℃；进样量：10 µL。

2.1.2 溶液的制备

对照品溶液：取11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含60 μg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品内容物适量，混匀，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取滤液，即得。

阴性样品溶液：按小金胶囊处方和工艺，制备缺醋乳香的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。    

2.1.3 系统适用性试验

分别精密吸取“2.1.2”项下的各溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（图1）。图1结果表明，色谱峰基线平稳，11-羰基-β-乙酰乳香酸与相邻色谱峰之间的分离度大于1.5，理论板数按11-羰基-β-乙酰乳香酸峰计算不低于3 500。

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  图1 小金胶囊中11-羰基-β-乙酰乳香酸

  Figure 1.含量测定的HPLC色谱图

  Figure 1. HPLC chromatogram for determination of the content of acetyl-11-keto-β-boswellic acid in Xiaojin capsules

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2.1.4 线性关系考察

精密称取11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品8.40 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取10 µL，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样浓度（X，μg·mL^-1）和峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程Y=15 056X+5 589.3，r=0.999 8。结果表明，11-羰基-β-乙酰乳香酸在13.346~166.824 μg·mL^-1的范围内线性关系良好。

2.1.5 重复性试验

取同一批（批号：201179）小金胶囊样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果样品中11-羰基-β-乙酰乳香酸的平均含量为1.19 mg·g^-1，RSD为1.87%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.1.6 精密度试验

取“2.1.5”项下制备的供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，考察仪器的精密度。结果峰面积的RSD均小于1.38％（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

取“2.1.5”项下制备的供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0，2，4，6，12，24 h注入液相色谱仪进样测定，记录峰面积。结果峰面积的RSD为1.36%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知11-羰基-β-乙酰乳香酸含量的样品，研细，取约0.5 g，精密称定，平行6份，分别置25 mL具塞锥形瓶中，各精密加入对照品溶液（浓度为26.841 μg·mL^-1）25 mL，称重，加热回流30 min，放冷，称重并用甲醇补足减少的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即样品溶液；按“2.1.1”项下色谱条件分别进行测定，结果6份样品的平均回收率为100.76%，RSD为1.52%（n=6），表明本方法的准确度良好。

2.1.9 样品含量测定

精密称取15批小金胶囊样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进行检测，按外标法计算样品含量，平行测定两次，结果见表1。

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  表格1 小金胶囊中11-羰基-β-乙酰乳香酸

  Table 1.含量测定结果（mg·g-1，n=2）

  Table 1. Determination results of acetyl-11-keto-β-boswellic acid in Xiaojin capsules (mg·g-1, n=2)

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2.2 GC指纹图谱

2.2.1 色谱条件

色谱柱：14％氰丙基-苯基86％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管色谱柱（DB1701，30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氢火焰离子化检测器；载气：高纯度氮气；载气流速：1.5 mL·min^-1；分流比：30 ∶ 1；进样口温度：230℃；检测器温度：280℃；程序升温条件见表2；进样量：1 μL。

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  表格2 程序升温条件

  Table 2.Temperature programmed

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2.2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物适量，混匀，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚5 mL，密塞，称定重量并记录，超声处理（功率：800 W，频率：40 kHz）30 min，取出，放冷，称重，并用石油醚补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.3 重复性试验

取本品内容物适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。以5号峰（麝香酮）为参照峰，计算11个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各特征峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于4.0%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.2.4 精密度试验

取“2.2.3”项中同一份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。直观观察发现，各色谱图的全貌无明显变化，峰个数完全相同。以5号峰为参照峰，计算11个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于1.5%（n=6），表明本方法的精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

取本品内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件分别于制备后0，4，8，12，18，24 h注入气相色谱仪进行检测，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算11个特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD均小于0.5%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.2%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h稳定性良好。

2.2.6 GC指纹图谱的建立及相似度评价

取15批小金胶囊样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图，所得15批样品的GC色谱叠加图见图2。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）”对15批样品的GC图谱进行分析，并拟合生成对照指纹图谱，且标定11个共有峰（图3）。以5号峰为参照峰，15批样品中其他各共有峰的相对保留时间的RSD均在1.2％以内。以对照指纹图谱为参照，15批小金胶囊样品的相似度均在0.870以上，表明样品批次间质量稳定性﹑均一性良好。

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  图2 15批样品的GC色谱叠加图

  Figure 2.Overlay diagram of GC chromatography of 15 batches of samples

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  图3 GC对照指纹图谱

  Figure 3.GC fingerprint

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2.3 重金属及有害元素

采用电感耦合等离子体质谱法[10]对15批小金胶囊样品中的铅、镉、砷、汞、铜元素进行了含量测定，结果见表3。参考中国药典中对重金属及有害元素有检查要求的大部分药材的限度规定，如甘草、白芍、当归、黄芪等[3]数10味药材的重金属及有害元素的限度要求均为：铅不得过5 mg·kg^-1；镉不得过1 mg·kg^-1；砷不得过2 mg·kg^-1；汞不得过0.2 mg·kg^-1；铜不得过20 mg·kg^-1。本品中5个重金属元素的含量均处于合格范围内，但砷、铜等部分元素含量偏高。

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  表格3 小金胶囊样品中重金属及有害元素检测结果（mg·kg-1，n=5）

  Table 3.Results of heavy metals and harmful elements in Xiaojin capsule samples (mg·kg-1, n=5)

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3 讨论

乳香为贵重的进口药材，且为小金胶囊处方中的臣药之一，11-羰基-β-乙酰乳香酸为其主要功效成分之一。本研究建立了本品中11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量测定方法，并进行了系统的方法学研究。在前期试验中系统考察了乙酸乙酯﹑甲醇﹑70%甲醇﹑乙醇等作为溶剂的提取效果，比较了样品加热回流和超声处理两种提取方式的效果，并对不同的流动相系统及梯度洗脱条件进行了优选，对不同的色谱柱、流速、进样量等进行了耐用性考察。最终确立了本研究的方法，具有专属性好、操作简便、耐用可靠等优点，且准确度和重复性良好。

本品处方中枫香脂、乳香、没药、当归等药材均含有大量挥发性有效成分，对其控制十分有必要。前期团队开展了大量试验，摸索优化了包括程序升温条件在内的GC色谱条件，以及供试品溶液提取制备方法等，在此基础上，通过15批样品，建立了一种小金胶囊的GC指纹图谱检测方法，并标定了11个共有峰，其分别归属于处方中8味药材饮片，其中1号峰为五灵脂，2、3、8、10号峰为枫香脂，4、6号峰为没药，4、8号峰为乳香，7号峰为木鳖子，9号峰为当归，11号峰为地龙，并经指认，其中5号峰为麝香酮，该方法弥补了现行标准及文献报道中对本品挥发性成分控制不足的问题。但在试验中，发现部分批次个别非共有峰存在缺失或差异，提示需进一步加强对本品及其相关来源药材或饮片的质量控制。

本品处方中有来源于动物药的地龙[11]、动物排泄物的五灵脂[12-13]、植物药当归和来源于树脂的枫香脂、乳香、没药等，需重视对本品的安全性控制。本文对15批小金胶囊样品中的重金属进行了检测，显示部分重金属含量偏高，需加强控制。另外本品处方中含有制草乌、地龙等，后续加强对小金胶囊中单酯型生物碱[14]、黄曲霉毒素等的控制十分有必要。

综上所述，本文针对小金胶囊标准提升的研究工作，将为其质量标准的提高提供依据和借鉴，为本品质量的控制和评价作参考。

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