目的  建立痛经软膏多组分定量联合化学计量学、灰色关联度分析法综合质量评价的方法。

方法  以姜黄素为内参物，通过高效液相色谱一测多评（HPLC-QAMS）法同时检测痛经软膏中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的含量，结合聚类分析、主成分分析、正交最小二乘判别分析和灰色关联度分析法对其质量进行综合评价。

结果  12种成分在浓度范围内线性关系良好（r均≥0.999 1）；平均加样回收率为96.58%~100.19%（RSD均小于2.0%，n=9）。HPLC-QAMS计算值与外标法实测值无显著差异（P＞0.05）。化学计量学将其分为3类，显示姜黄素、6-姜辣素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、柠檬苦素和延胡索乙素是影响痛经软膏产品质量的主要潜在标志物。灰色关联度分析显示相对关联度在0.317 3~0.624 8范围内，痛经软膏质量存在一定的差异。

结论  建立的方法可以全面地评价痛经软膏的质量。

脐部给药始于春秋战国，属于中医“内病外治”疗法[1]，因使用方便、起效快，越来越多地应用于临床。痛经软膏属于脐部给药，具有活血散寒、调经止痛等功效，常用于痛经、下腹坠胀、腰背疼痛等症。痛经软膏由吴茱萸、姜黄、干姜和延胡索加工而成，吴茱萸具有温中散寒的功效，外用具有较好的止痛效果；延胡索是难得的止痛良药，尤其对气血凝滞造成的各种疼痛效果最佳；干姜治胃寒呕吐、脘腹冷痛；姜黄归脾、肝经，破血行气、通经止痛。痛经软膏现行质控标准WS-11402(ZD-1402)-2002-2012Z [2]和相关文献[3]

仅针对延胡索药材中的延胡索乙素进行含量测定，不能全面体现该产品的质量水平。为保障用药安全，提高质量控制手段，现对痛经软膏中4味中药材均进行分析，采用高效液相色谱一测多评法（high performance liquid chromatography-quant_itat_ive analysis of mult_i-component_s by a single marker, HPLC-QAMS） [4]法同时测定柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的含量，并结合化学计量学[5]和灰色关联度分析（grey correlat_ion analysis, GRA）[6]进行差异分析和质量评价，旨在为全面控制痛经软膏的质量提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Primaide 1430型，日本日立公司；Agilent 1260型，美国安捷伦科技公司）；色谱柱Cosmosil C₁₈柱、Agilent Eclipse Plus C₁₈柱和Prevail C₁₈柱，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm；PL203型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DS-2510DTH型超声波清洗器（上海生析超声仪器公司）。

对照品柠檬苦素（批号：110800-201707，含量97.9%）、吴茱萸碱（批号：110802-202111，含量99.8%）、吴茱萸次碱（批号：110801-202109，含量99.3%）、双去甲氧基姜黄素（批号：112004-201501，含量95.0%）、去甲氧基姜黄素（批号：112003-201501，含量98.5%）、姜黄素（批号：110823-202107，含量98.1%）、6-姜辣素（批号：111833-202007，含量99.3%）、8-姜酚（批号：111993-202202，含量94.6%）、10-姜酚（批号：111994-202102，含量99.1%）和延胡索乙素（批号：110726-202020，含量99.3%）源于中国食品药品检定研究院；去氢紫堇碱（批号：PRF8062141，含量97.8%）和紫堇碱（批号：PRF15123121，含量99.2%）源于成都普瑞法科技开发有限公司。乙腈和甲醇（色谱级，德国Merck公司）；磷酸（色谱级，美国Fisher公司）；其余试剂为分析纯。阴性样品所用原药材及主要辅料来源：吴茱萸（批号：20220702）、姜黄（批号：20221001）源于石药（山东）中药饮片有限公司；干姜（批号：20220902）、延胡索（批号：20221002）源于山东万福堂中药饮片有限公司；甘油（批号：20220503）、聚山梨酯-80（批号：20220101）源于江西益普生药业有限公司；液状石蜡（吉林市吉化江城油脂化工有限公司，批号：220102）；硬脂酸（湖南芙蓉制药有限公司，批号：220201）；蜂蜡（沧州森林蜡业有限公司，批号：20220302）；羟苯乙酯（广州市汉普医药有限公司，批号：20220501）。

12批痛经软膏（规格：5 g/支，批号：20200704、20200802、20200807、20200904、20210207、20210308、20210406、20210905、20220206、20220306、20220601、20220602，编号：S1~S12）源于贵州绿太阳制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 HPLC-QAMS方法学考察

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取12个对照品，用75%甲醇制成混合对照品贮备液（柠檬苦素0.312 0 mg·mL^-1，吴茱萸碱0.098 0 mg·mL^-1，吴茱萸次碱0.156 0 mg·mL^-1，双去甲氧基姜黄素1.670 0 mg·mL^-1，去甲氧基姜黄素2.054 0 mg·mL^-1，姜黄素3.730 0 mg·mL^-1，6-姜辣素1.892 0 mg·mL^-1，8-姜酚0.468 0 mg·mL^-1，10-姜酚0.530 0 mg·mL^-1，延胡索乙素0.184 0 mg·mL^-1，去氢紫堇碱0.270 0 mg·mL^-1和紫堇碱0.072 0 mg·mL^-1）。精密吸取贮备液适量，经75%甲醇稀释20倍得混合对照品溶液：柠檬苦素15.60 μg·mL^-1，吴茱萸碱4.90 μg·mL^-1，吴茱萸次碱7.80 μg·mL^-1，双去甲氧基姜黄素83.50 μg·mL^-1，去甲氧基姜黄素102.70 μg·mL^-1，姜黄素186.50 μg·mL^-1，6-姜辣素94.60 μg·mL^-1，8-姜酚23.40 μg·mL^-1，10-姜酚26.50 μg·mL^-1，延胡索乙素9.20 μg·mL^-1，去氢紫堇碱13.50 μg·mL^-1和紫堇碱3.60 μg·mL^-1。

2.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的配制

取痛经软膏约1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，经75%甲醇超声提取（功率：200 W，频率：40 kHz）45 min，冷却后经溶剂定容，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液。按痛经软膏质量标准中处方比例，分别制备痛经软膏阴性样品（缺吴茱萸、缺姜黄、缺干姜、缺延胡索），并制备相应的阴性样品溶液。

2.1.3 色谱条件

采用Cosmosil C₁₈ HPLC柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；波长切换：215 nm（0~15 min检测柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱）[7-11]、425 nm（15~23 min检测双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素）[12-15]和280 nm（23~65 min检测6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱）[16-19]；乙腈-0.1%磷酸[20]为流动相，在流速1.0 mL·min^-1条件下梯度洗脱（0~10 min，11.0%乙腈；10~19 min，11.0%→25.0%乙腈；19~29 min，25.0%→45.0%乙腈；29~42 min，45.0%→70.0%乙腈；42~54 min，70.0%→82.0%乙腈；54~60 min，82.0%→11.0%乙腈）；进样量：10 µL，柱温：30℃。

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下5种溶液各10 µL，进样检测，记录色谱图。痛经软膏供试品溶液在对照品溶液相同保留时间处有相应的色谱峰，且色谱峰峰形对称，与相邻色谱峰完全分离；阴性样品则未出现相应的色谱峰（图1）。

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  图1 混合对照品（A）、痛经软膏供试品（B）、缺吴茱萸阴性样品（C）、缺姜黄阴性样品（D）、

  Figure 1.缺干姜阴性样品（E）、缺延胡索阴性样品（F）的HPLC色谱图

  Figure. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A), Tongjing ointment test sample (B), sample without euodiae fructus (C), sample without curcumae longae rhizoma (D),sample without zingiberis rhizoma (E) and sample without corydalis rhizoma (F)

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2.1.4 标准曲线与线性范围

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和5.0 mL，置于6个20 mL量瓶中，用75%甲醇加至刻度线，制得系列标准曲线溶液Ⅰ~Ⅵ，分别按“2.1.3”项下色谱条件进样10 µL，记录色谱图，以对照品浓度为横坐标（X，µg·mL^-1），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。结果表明，12个成分在各自浓度范围内线性关系良好。

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  表格1 12个成分的标准曲线和线性范围

  Table 1.Standard curves and linear ranges for 12 components

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2.1.5 精密度试验

取痛经软膏（编号：S1）供试品溶液1份，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，结果柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD分别为1.20%，1.38%，1.32%，0.95%，0.87%，0.59%，1.02%，1.19%，1.21%，1.32%，1.25%，1.46%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取痛经软膏（编号：S1）适量，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，测定峰面积，用外标法（external standard method, ESM）计算得柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的含量平均值分别为0.433 0，0.094 0，0.180 0，2.365 0，3.076 0，5.145 0，2.854 0，0.517 0，0.721 0，0.221 0，0.298 0，0.078 0 mg·g^-1，RSD依次为1.47%，1.83%，1.72%，1.22%，1.18%，0.94%，1.47%，1.65%，1.58%，1.71%，1.63%，1.92%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取痛经软膏（编号：S1）样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，制备后室温放置，并于制备后0，2，5，9，14，20，24 h测定峰面积，结果柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD依次为1.37%，1.51%，1.53%，1.26%，1.12%，0.98%，1.34%，1.58%，1.75%，1.94%，1.81%，1.97%（n=7），表明痛经软膏供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知12个成分含量的痛经软膏（编号：S1）9份，每份0.5 g，精密称定后均分成3组，分别加入已知含量80%，100%，120%的混合对照品溶液（柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品质量浓度分别为0.219 0，0.046 0，0.089 0，1.175 0，1.538 0，2.527 0，1.419 0，0.258 0，0.364 0，0.109 0，0.15 0，0.039 0 mg·mL^-1），按“2.1.2”项下方法处理后测定，计算回收率，测得12个成分的平均加样回收率分别为98.15%，96.58%，97.86%，99.11%，98.32%，100.19%，98.19%，98.05%，97.92%，97.58%，98.60%，96.78%，RSD分别为1.14%，1.25%，1.12%，1.10%，1.13%，0.97%，1.10%，1.03%，1.26%，1.77%，1.54%，1.55%（n=9）。

2.1.9 相对校正因子计算

精密吸取“2.1.4”项下6个混合对照品溶液进样，测定峰面积，以姜黄素为内参物，按相对校正因子多点法计算公式RCF_i/s=（ρ_i×A_s）/（ρ_s×A_i）（式中RCF_i/s表示相对校正因子，ρ_i表示内参物浓度，ρ_s表示其他成分浓度，A_i表示内参物峰面积，A_s表示其他成分峰面积）分别计算姜黄素与其他11个成分的相对校正因子，结果见表2。

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  表格2 以姜黄素为内参物的各成分的相对校正因子

  Table 2.Relative correction factors of each component with curcumin as the internal reference substance

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2.1.10 相对校正因子重现性

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，依法进样，测定峰面积，以姜黄素为内参物，分别计算各成分在不同检测条件下的相对校正因子，并计算RSD值，结果见表3，不同检测条件对建立的相对校正因子无明显影响（RSD＜2.0%）。

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  表格3 不同检测条件下各成分的相对校正因子

  Table 3.Relative correction factors of each component under different detection conditions

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2.1.11 色谱峰定位

记录“2.1.10”项下采用高效液相色谱仪（Primaide 1430型和Agilent 1260型）和色谱柱（Cosmosil C₁₈柱、Agilent Eclipse PlusC₁₈柱和Prevail C₁₈柱）时的色谱峰保留时间，以姜黄素为内参物，采用相对保留时间值法对色谱峰进行定位，计算公式为（式中t_is表示相对保留值，t_i表示姜黄素的保留时间值，t_s表示待测成分的保留时间值），结果见表4。

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  表格4 仪器及色谱柱对相对保留时间值的影响

  Table 4.Effects of instruments and chromatographic columns on relative retention time

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2.2 ESM与QAMS法比较

对12批痛经软膏（编号：S1~S12），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法进样，测定峰面积，分别运用ESM和HPLC-QAMS法计算痛经软膏中12个成分的含量，每批样品平行3份，结果见表5。再运用统计软件SPSS 26.0对两种方法测得数据进行配对t检验，结果以x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。结果两种方法测定的含量差异无统计学意义（P＞0.05），表明HPLC-QAMS法适用于痛经软膏中12个成分的含量测定。

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  表格5 ESM与QAMS法分别测定痛经软膏中12个成分的含量（x±s，mg·g-1，n=3）

  Table 5.Determination of 12 components in Tongjing Ointment by ESM and QAMS (x±s, mg·g-1, n=3)

  注：ESM：外标法；QAMS：一测多评法

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2.3 化学计量学对12批痛经软膏的分析

2.3.1 聚类分析

采用平均联接法，以Euclidean距离为测度，运用SPSS 26.0软件对12批痛经软膏中12个化学成分含量数据进行聚类分析（cluster analysis, CA），CA图见图2。结果以距离小于10为标准，将12批痛经软膏分为3类，S5、S7、S8和S6为一类，S3、S4、S1和S2为一类，S10、S11、S12和S9为一类。

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  图2 12批样品CA图

  Figure 2.CA dendrogram for 12 batches of samples

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2.3.2 主成分分析

采用主成分分析（principal component analysis, PCA）法，以12批痛经软膏中12个化学成分含量为变量，得到12×12阶原始数据矩阵，导入SPSS 26.0软件进行分析，以特征值大于1为提取标准，12批痛经软膏提取出2个主成分（PC₁和PC₂），其中特征值分别为8.996和1.826，方差贡献率分别为74.966%和15.214%，累积方差贡献率达90.180%，表明选取前2个主成分可代表痛经软膏中12个化学成分含量90.180%的信息量，可反映痛经软膏的综合质量（表6）。同时吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、去氢紫堇碱和紫堇碱对PC₁贡献度高，柠檬苦素和延胡索乙素对PC₂贡献度显著（表7）。再以PC₁和PC₂建立坐标系进行投影得12批痛经软膏样品PCA得分图（图3）。结果显示S9~S12位于得分图左侧，S1~S4位于得分图右上侧，S5~S8位于得分图右下侧，呈现一定分类趋势，与CA结果基本一致。

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  表格6 痛经软膏中主成分方差分析

  Table 6.Analysis of variance of principal components in Tongjing Ointment

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  表格7 痛经软膏中12种成分的载荷矩阵表

  Table 7.Composition matrix table of 12 components in Tongjing Ointment

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  图3 12批痛经软膏的PCA得分图

  Figure 3.PCA score chart for 12 batches of Tongjing Ointment

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2.3.3 正交偏最小二乘法-判别分析

本试验将12批痛经软膏中12个化学成分含量数据矩阵导入SIMCA 14.1软件，进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal part_ial least squares discriminant analysis, OPLS-DA），获得相应模型，该模型具有良好的解释程度和预测能力（R²X=0.987，R²Y=0.946，Q²=0.848），得分矩阵图见图4，显示这12个成分的含量存在显著差异，且所有样品均在正常范围内分布，未出现异常点。结合模型变量重要性投影（VIP）法，以VIP＞1为筛选标准，进一步筛选出6个差异标志物（图5），其中VIP_姜黄素=1.603 4，VIP6_-姜辣素=1.369 7，VIP_{双去甲氧基姜黄素}=1.334 3，VIP_{去甲氧基姜黄素}=1.330 5，VIP_柠檬苦素=1.168 9，VIP_{延胡索乙素}=1.009 9，表明这6个成分是造成痛经软膏质量差异的主要原因。

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  图4 12批痛经软膏样品OPLS-DA模型得分图

  Figure 4.Score chart of OPLS-DA model for 12 batches of Tongjing Ointment

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  图5 12批痛经软膏样品VIP图

  Figure 5.VIP images of 12 batches of Tongjing Ointment

  注：1.柠檬苦素；2.吴茱萸碱；3.吴茱萸次碱；4.双去甲氧基姜黄素；5.去甲氧基姜黄素；6.姜黄素；7.6-姜辣素；8.8-姜酚；9.10-姜酚；10.延胡索乙素；11.去氢紫堇碱；12.紫堇碱

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2.4 GRA评价体系的建立

分别以12批痛经软膏中12个化学成分含量数据为参考序列，运用GRA法建立相关性数理统计模型，计算关联度。

2.4.1 无量纲化处理

参考文献[21]对12批痛经软膏中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱含量数据进行无量纲化处理，得均值化数列，见表8。

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  表格8 痛经软膏中12个组分含量数据的均值化数列

  Table 8.The mean value series of the content data of 12 components in Tongjing Ointment

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2.4.2 关联系数的计算

以12批痛经软膏中各评价指标无量纲化处理后的最大值为最优参考序列，最小值为最差参考序列，按文献[22]参考序列关联系数公式（1）、（2）计算各评价单元相对于最优、最差参考序列关联系数和。

其中，Δ_min=min|Y_ij-Y_bj|、Δ_max=max|Y_ij-Y_bj|、=min|Y_ij-Y_sj|、=max|Y_ij-Y_sj|,ρ为分辨系数，取值0.5，为各评价单元相对于最优参考序列关联系数，为各评价单元相对于最差参考序列关联系数。

2.4.3 关联度及相对关联度的计算

关联度为每批次痛经软膏样品中12个组分关联系数的平均值，按公式（3）、（4）计算被评价对象相对于最优、最差参考序列的关联度。再按公式（5）计算被评价对象的相对关联度R_i。R_i数值越大，样品综合质量最优，反之越差，见表9。结果12批痛经软膏样品相对关联度0.317 3~0.624 8，S11、S10、S9和S12分别位于排名前4位，S2、S3、S4和S1位于排名中间位置，S5、S7、S6和S8位于排名后4位。

其中，R_i(b)为最优参考序列的关联度，R_i(s)为最差参考序列的关联度，R_i为被评价对象的相对关联度。

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  表格9 12批痛经软膏相对关联度排序结果

  Table 9.Ranking results of relative correlation degree of 12 batches of Tongjing Ointment

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3 讨论

对于痛经软膏供试品溶液的制备方法，本试验考察了提取溶剂（70%乙醇、乙醇、75%甲醇、甲醇）、提取方式（超声、回流）、提取时间（30，45，60 min），结果发现75%甲醇超声提取45 min时，所测12种成分的响应值均较高，同时色谱峰分离度与峰形均较好，故以75%甲醇超声提取45 min为痛经软膏供试品最佳提取方式。对于流动相的选择，本试验先后对比了柱压较低的乙腈为有机相的体系：乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%冰醋酸，结果发现当乙腈-0.1%磷酸为流动相时，12个成分峰形较好，峰面积较大，分离度较高，基线平稳。

痛经软膏由吴茱萸、姜黄、干姜和延胡索组方而成，方中的吴茱萸温中散寒，延胡索止痛，干姜治胃寒呕吐、脘腹冷痛，姜黄破血行气、通经止痛；诸药合用，共奏活血散寒、调经止痛之功效。本文选取吴茱萸活性成分柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，姜黄特征性成分双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素，干姜主要活性成分6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚，延胡索代表成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱为目标成分，同时姜黄素在该制剂中含量最高，也是姜黄药材中含量最高的姜黄素类成分，其对照品较易获得，故本试验选择姜黄素作为内参物。

本试验以姜黄素为内参物，采用HPLC-QAMS法同时检测痛经软膏中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱含量，HPLC-QAMS计算值与ESM实测值差异无统计学意义（P＞0.05），所建立的方法操作便捷、结果准确。

化学计量学将12批样品聚为3类，同时挖掘出姜黄素、6-姜辣素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、柠檬苦素和延胡索乙素对痛经软膏质量影响较大。GRA模型综合评价结果显示S9~S12位于排序前4位，S1~S4位于排序中间位置，S5~S8位于排序后4位。化学计量学结合GRA综合评价模型全面可靠，避免了人为主观性，有助于药品生产企业结合原药材来源及制剂生产过程控制等参数挖掘各评价指标在生产过程中的转化率，进一步稳定原药材种属、产地等，完善痛经软膏制剂生产过程控制参数，最终达到痛经软膏产品质量的稳定性和疗效的一致性，化学计量学结合GRA综合评价模型可作为源痛经软膏质量优劣的综合评价方法。

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