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目的 筛选砂仁生药粉最佳灭菌工艺。
方法 以乙酸龙脑酯含量、指纹图谱相似度、灭菌率、抗氧化活性以及综合外观性状的综合评分为指标，采用层次分析（AHP）-熵权逼近理想解排序（TOPSIS）法综合评价干热灭菌、湿热灭菌、紫外灭菌、辐照灭菌4种灭菌方法对砂仁生药粉灭菌效果和质量的影响。
结果 4种灭菌方式对砂仁生药粉质量影响的优劣顺序为：辐照灭菌 > 湿热灭菌 > 紫外灭菌 > 干热灭菌。其中辐照灭菌在剂量8 kGy及以上能完全杀灭砂仁生药粉中的微生物，同时较好地保留了砂仁生药粉中的有效成分。
结论 与其他灭菌方法相比，辐照灭菌法在保证灭菌效果的同时，能更大程度地保留砂仁生药粉中的有效成分，具有低温、短时、相对安全等优势，可获得符合规定的砂仁生药粉。优选的灭菌工艺稳定可行、重复性好，可为后续工艺开发及工业化生产提供参考。
砂仁药材为姜科植物阳春砂（Amomum villosum Lour.）、绿壳砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen）或海南砂（Amomum longiligulare T.L.Wu）的干燥成熟果实，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效［1］，临床应用广泛。中药固体制剂中饮片原粉入药较为常见，为保证临床用药安全，入药的生药粉需满足微生物限度要求，因此选择适宜的灭菌方法对保证中药制剂质量具有重要意义［2］。灭菌工艺参数是影响中药生药粉品质及制剂疗效的关键，既要达到灭菌效果，又要保证药材质量。但目前关于砂仁生药粉灭菌工艺的研究较少。
砂仁生药粉质量涉及有效成分、图谱特征、理化性状、生物活性等多个评价维度，各指标的表征意义与评价侧重点各不相同，无法通过单一指标评价灭菌工艺优劣，而多指标综合评价的核心难点在于各指标权重的科学合理分配。层次分析（analytic hierarchy process，AHP）-熵权逼近理想解排序（technique for order preference by similarity to ideal solution ，TOPSIS）法是主客观融合、多指标协同、结果精准可解释的综合评价模型，可有效解决中药生药粉多指标评价的权重分配难题［3］。基于此，本研究采用AHP-熵权 TOPSIS 法，以砂仁生药粉为研究对象，从乙酸龙脑酯含量、指纹图谱、灭菌率、抗氧化活性以及外观性状5个方面进行综合评价，筛选出最佳灭菌方式，为砂仁的产品开发以及制剂研究提供参考。
1 仪器与试药
1.1 主要仪器
GC-2030气相色谱仪，包括2998 PDA检测器和C21SMC430G柱温箱（日本SHIMADZU公司）；Waters Alliance e2695高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XS105DU型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SPECORD 210 PLUS紫外光分光光度计（耶拿分析仪器有限公司）；MQS0.6型脉动真空灭菌柜（张家港市环宇制药设备有限公司）；XD255F-1紫外线消毒柜（广东德玛仕智能厨房设备有限公司）；US1020高能电子加速器［同方威视科技（北京）有限公司］；B3 WINdose辐照剂量计（美国GEX公司）。
1.2 主要药品与试剂
砂仁药材购自河北一达饮片有限公司，经鲁南厚普制药有限公司高级工程师高艳红鉴别，其性状、显微、TLC及含量均符合《中国药典》2025年版一部“砂仁”项下规定［1］；乙酸龙脑酯对照品（中国食品药品研究检定院，批号：110759-202007，纯度99.3%）；甲醇（色谱纯，批号：24102420R12）和乙腈（色谱纯，批号：2410140720R12）购自天津鑫彩华豪科技发展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：D273092）；其余试剂均为分析纯；水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 灭菌样品的制备
2.1.1 砂仁生药粉
取砂仁药材，置于50~60 ℃电热鼓风干燥箱中低温干燥后，粉碎过三号筛，得砂仁生药粉（X0组）。
2.1.2 干热灭菌样品
根据既往研究经验及相关文献报道［3］，将100 g砂仁生药粉均匀平铺于托盘中，药粉厚度约为2 cm，置于热风循环烘箱中，设置不同的灭菌温度和时间：110 ℃/5 h（X1组）、110 ℃/6 h（X2组）、130 ℃/5 h（X3组）、130 ℃/6 h（X4组），灭菌后真空干燥30 min，取出粉碎后过三号筛，即得干热灭菌样品。
2.1.3 湿热灭菌样品
参考其他药材生药粉的灭菌研究［3-4］选择灭菌参数。将100 g砂仁生药粉均匀平铺于托盘中，药粉厚度约为2 cm，置于脉动真空灭菌器中，分别设置不同的灭菌温度和时间：100 ℃/60 min（X5组）、100 ℃/30 min（X6组）、115 ℃/60 min（X7组）、115 ℃/30 min（X8组）、121 ℃/60 min（X9组）、121 ℃/30 min（X10组），灭菌后真空干燥30 min，取出粉碎后过三号筛，即得湿热灭菌样品。
2.1.4 紫外灭菌样品
取100 g砂仁生药粉均匀平铺于托盘中，铺粉厚度约为2 cm，置于紫外灭菌柜中，设置灭菌时间分别为30、60、90、120 min（X11~X14组），灭菌后真空干燥30 min，取出粉碎后过三号筛，即得紫外灭菌样品［3］。
2.1.5 辐照灭菌样品
查阅相关文献［3，5］设置辐照灭菌参数。取100 g砂仁生药粉，用双层PE袋包装后，分别按照辐照剂量2、4、6、8、10、15 kGy进行辐照灭菌（X15~X20组），灭菌后真空干燥30 min，取出粉碎后过三号筛，即得辐照灭菌样品。
2.2 乙酸龙脑酯的GC含量测定
2.2.1 色谱条件
采用HP-5MSUI色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱温为100℃，进样口温度为230 ℃，氢火焰离子化检测器温度为250 ℃，分流比为10∶1，运行时间为30 min，进样量为1 μL［1］。
2.2.2 溶液的制备
对照品溶液：取乙酸龙脑酯对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含0.298 4 mg的溶液，即得。
供试品溶液：取本品粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声（功率：300 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 样品的含量测定
分别精密吸取4种灭菌方法制备的砂仁样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表1。干热灭菌条件下，乙酸龙脑酯含量大幅度下降，与灭菌前相比下降30%，尤其在130 ℃灭菌条件下，乙酸龙脑酯的含量已不符合《中国药典》2025年版一部“砂仁”项下不得少于0.90%的规定［1］。湿热灭菌条件下，乙酸龙脑酯含量与灭菌前相比下降15%~25%，下降也较为明显。而紫外灭菌和辐照灭菌对含量影响较小。
2.3 指纹图谱的建立
2.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×46 mm，5 μm）；流动相：0.05%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~15 min，5%→10% A；15~20 min，10%→15% A；20~35 min，15%→25% A；35~55 min，25%→40% A；55~65 min，40%→70% A；65~70 min，70%→90% A；70~80 min，90%A；80~81 min，90%→5% A；81~90 min，5% A）；柱温：30 ℃；检测波长：300 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。
2.3.2 供试品溶液的制备
称取各组样品约1 g，置锥形瓶中，加甲醇20 mL超声处理（功率：450 W，频率：40 kHz）30 min，放冷滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇定容至5 mL，滤过即得。
2.3.3 精密度试验
取同一供试品溶液（样品编号：X0），按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次。以乙酸龙脑酯峰作为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD均 < 3.0%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
取同一份供试品溶液（样品编号：X0），分别于室温条件下放置0、2、4、6、8、12 h后，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以乙酸龙脑酯峰作为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD均 < 3.0%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.3.5 重复性试验
取同一份样品（样品编号：X0），按“2.3.2”方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以乙酸龙脑酯峰作为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD均 < 3.0%（n=6），表明本方法重复性较好。
2.3.6 指纹图谱的测定
精密吸取供试品溶液（样品编号：X0~X20）各20 μL，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，将所得图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.130723版软件计算相似度，结果见图1和表2。干热灭菌相似度范围在0.400~0.521，湿热灭菌相似度范围在0.565~0.686，指纹图谱相似度较低；紫外灭菌和辐照灭菌指纹图谱相似度范围为0.991~0.999，灭菌前后化学成分一致性较高。
2.4 灭菌率检测
2.4.1 检测方法
按照《中国药典》2025年版四部中非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则1107）［6］进行实验，并依据以下公式计算灭菌率，结果见表3。
其中，菌数包括细菌和霉菌。干热灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌3种灭菌方式灭菌效果较好，紫外灭菌效果较差，对灭菌率的影响顺序为：辐照灭菌 > 湿热灭菌 > 干热灭菌 > 紫外灭菌。
2.5 抗氧化活性
采用抗氧化实验（DPPH法）［3］测定20组样品中砂仁抗氧化活性。精密称取上述20组药材粉末0.5 g，置入无水乙醇中，超声（功率：450 W，频率：40 kHz）处理40 min，制备生药质量浓度为10 mg/mL的样品溶液，分别吸取1 mL于试管中，等量加入0.1 mg/mL的DPPH-乙醇溶液1 mL，使之充分混匀，避光反应20 min后于517 nm波长下检测吸光度（A样）；将等量的无水乙醇和样品溶液混合，测定的吸光度记为A对；空白组采用水替代样品溶液，吸光度记为A空，根据以下公式计算DPPH自由基清除率，结果见表4。干热灭菌、湿热灭菌后样品的抗氧化活性降低，而紫外灭菌和辐照灭菌对样品抗氧化活性的影响较小。
2.6 砂仁粉末外观性状评分
参照文献［7］建立砂仁粉末外观性状评分标准（表5），颜色变化、结块程度、流动性、吸湿性等4项指标评分各为1分，总分为4分，各样品评分结果见表6。4种灭菌方法处理的砂仁生药粉物理性质有一定差异，其中干热灭菌颜色稍加深，过筛后粉末流动性较好。湿热灭菌颜色加深明显并结成块状，流动性差。辐照灭菌、紫外灭菌样品色差小，而且在保持流动性上有优势，尤其辐照灭菌的样品在灭菌前后物理性质差异不大。
2.7 基于AHP-熵权TOPSIS法的综合评价
2.7.1 权重系数的确定
（1）AHP法计算权重系数［8］：根据砂仁质量评价体系指标的重要程度，对各项指标的权重进行量化，确定优先顺序为：灭菌率 > 指纹图谱相似度 > 乙酸龙脑酯含量=抗氧化活性 > 综合外观性状，构建两两比较的优先判断矩阵，结果见表7。采用几何平均法计算得到乙酸龙脑酯含量、指纹图谱相似度、灭菌率、抗氧化活性以及综合外观性状的权重系数分别为0.141 1、0.184 2、0.441 5、0.141 1、0.092 1，一致性比例（consistency index，CR）＝ 0.003 < 0.10，表明该判断矩阵的权重系数有效。
（2）熵权TOPSIS法［9-10］：采用SPSSAU软件，对数据进行“标准化”处理，再通过熵权TOPSIS分析得到乙酸龙脑酯含量、指纹图谱相似度、灭菌率、抗氧化活性以及综合外观性状的权重系数分别为0.150 2、0.284 8、0.146 1、0.248 0、0.170 9。
（3）AHP-熵权TOPSIS法：将AHP法和熵权TOPSIS法得到的权重系数采用以下公式进行混合加权：
式中，RAHP为AHP法计算的权重系数，R熵权TOPSIS为熵权TOPSIS法计算的权重系数。依据公式计算得到的乙酸龙脑酯含量、指纹图谱相似度、灭菌率、抗氧化活性以及综合外观性状的权重系数分别为0.111 6、0.276 3、0.339 7、0.184 3、0.088 1。
2.7.2 综合评分
综合评分结果见表8。干热灭菌、湿热灭菌的综合评分较低，提示这两种灭菌方法对砂仁生药粉质量影响较大；辐照灭菌的综合评分最高。
2.7.3 AHP-熵权TOPSIS模型计算结果
分析计算样本中各评价指标与正理想解和负理想解的距离（Di+与Di-）及指标对最优解的相对贴近度（Ci）［11］，排序结果见表9。根据Ci的大小对砂仁粉灭菌方法进行排序，相对贴近度越大，越贴近理想解，被评价事物越优；反之，则越差。
从Ci排序可以看出，4种灭菌工艺的优劣顺序依次为：辐照灭菌 > 湿热灭菌 > 紫外灭菌 > 干热灭菌，表明辐照灭菌更适于砂仁药材生药粉灭菌。辐照灭菌条件下，灭菌率与辐照剂量呈正相关，在剂量8 kGy及以上能完全杀灭砂仁生药粉中的微生物，并较好地保留了砂仁生药粉中的有效成分。
2.8 验证试验
根据AHP-熵权TOPSIS模型筛选出的最优灭菌工艺参数，即100 g 砂仁生药粉采用辐照灭菌，剂量为8 kGy，按此灭菌条件重复3次，结果见表10。结果表明，制得的砂仁生药粉质量稳定且微生物限度符合要求。
3 讨论
灭菌对于以原粉入药的药材来说是必要的一项前处理操作。传统热力灭菌工艺如干热灭菌、湿热灭菌，其效率高、灭菌率高，工业生产中仍被广泛应用［11］，然而该类工艺常会引起生药粉性状明显改变及成分破坏，不适用于具有热敏性成分以及对外观色泽有高要求的中药原粉［12］。紫外灭菌虽然对生药粉性状影响较小，挥发性及热敏性的有效成分保留率高，但灭菌效果不佳，不适用于生药粉工业化的最终灭菌。辐照灭菌对生药粉性状及有效成分含量影响较小，生药粉的物理性质及药效基础未发生改变。此外，原粉采用PE复合膜袋包装可有效减少辐照能量流失及防止二次污染，灭菌效果更加稳定，故而辐照灭菌比其他3种灭菌方式更加适合生药粉灭菌［4］。
以单一指标性成分或指纹图谱评价不能全面反映中药生药粉灭菌质量，药材入药前需同时确保安全性与有效性，故基于“理化特性-生物活性”的评价模式是目前评价中药质量的重要手段［9］。AHP法是一种人为判断各评价指标先后顺序，将确定指标进行两两比较的权重计算方法，此法忽略了实际数据的信息［13-14］。熵权TOPSIS法是将多个指标的有限数据通过建立数学模型逼近理想解，实现多目标的决策分析，与中药多指标综合评价思路相吻合［15-16］。本研究采用AHP法与熵权TOPSIS数学模型相结合的组合赋权法，并进行针对性优化，在指标选择上整合有效成分（乙酸龙脑酯含量）、质量一致性（指纹图谱相似度）、安全性（灭菌率）、抗氧化活性及综合外观性状五大核心指标，全面覆盖砂仁生药粉入药质量要求。在赋权方法上通过一致性检验（CR<0.1）验证并优化专家判断矩阵，避免主观判断导致的权重偏差；同时利用熵权法挖掘实测数据的客观规律，对核心指标（如指纹图谱相似性、灭菌率）赋予更高权重，实现主观专业经验与客观数据规律的有机融合，显著提升了评价模型的稳定性。
本研究结果显示，AHP法计算的权重系数中灭菌率占比最大，为44%，其次是指纹图谱相似度为18%；熵权TOPSIS法中指纹图谱相似度权重系数最大，其次是抗氧化活性，两者总和为53%，灭菌率为14%。AHP-熵权TOPSIS混合加权后，灭菌率占比最大，其次是指纹图谱相似度，两者总和为61%。而在药品生产中，安全最为重要，其次是有效性，故此法所得的权重系数不仅体现了灭菌的重要性，又兼顾了药效物质基础，避免了“重成分、轻安全”“重药效、轻应用”的片面评价，更贴合砂仁生药粉临床入药的实际需求。
本研究经3批验证，参数稳定，灭菌率达标且能最大限度保留乙酸龙脑酯等有效成分，同时维持砂仁生药粉良好的外观性状与抗氧化活性，避免了传统灭菌工艺易导致有效成分分解、外观性状变差或灭菌不彻底的问题，更适合砂仁生药粉的工业化生产，为砂仁生药粉的进一步开发利用提供可靠的技术保障，具有重要的实践意义。
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