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目的 比较干式荧光免疫层析（FICA）法与HPLC法检测丙戊酸血药浓度的结果差异，评价FICA法在临床应用中的适用性。
方法 对FICA法检测丙戊酸血药浓度进行性能验证；分别用FICA法和HPLC法测定50例患者血浆中丙戊酸浓度，并运用Shapiro-Wilk检验、Bland-Altman偏差图及Passing-Bablok回归分析等方法进行一致性评价。
结果 FICA法性能验证符合要求。Bland-Altman偏差图显示2种方法一致性欠佳；Spearman相关系数为0.918（P< 0.01），Passing-Bablok回归方程为Y=1.186X-11.311（n=47），截距为-11.311［95%置信区间（CI）（-16.512，-4.111）］，斜率为1.186［95%CI（1.055，1.314）］。
结论 FICA法和HPLC法检测丙戊酸血药浓度结果一致性欠佳，不宜直接互换，可使用回归方程进行换算。FICA法可作为急诊筛查及HPLC法的应急补充。
丙戊酸是治疗癫痫和双相情感障碍的一线药物［1-2］，血药浓度与其临床疗效及不良事件存在显著药动学/药效学关联，在丙戊酸使用过程中进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）具有重要的临床意义，而准确、快速检测丙戊酸血药浓度是TDM的重要环节［3-5］。丙戊酸血药浓度的检测方法众多，其中，国内应用较广泛的是HPLC法［6］或液相色谱-质谱法［7］，以及免疫分析法［4］等。HPLC法具有灵敏度高、精密度好、选择性强等优点［6］，但设备成本及对人员技术要求较高，耗时较长；酶放大免疫法及化学发光免疫法等自动化程度高，但设备及试剂费用昂贵，试剂规格偏大，而开封后有效期过短。很多基层医疗机构受资金、人员、技术和样本量的限制，较难采用上述方法开展丙戊酸血药浓度检测。
近期，干式荧光免疫层析法（dry fluorescence immunochromatographic assay，FICA）已应用于临床丙戊酸血药浓度检测［8］，其具有成本低廉、操作简单，结果“立等可取”等特点，且检测试剂单人份包装，可能适用于基层医院开展丙戊酸血药浓度检测。该方法目前应用不多，关于丙戊酸血药浓度检测方法学比较的研究仅见2篇结论不一致的报道［8-9］，尚未见使用FICA法检测丙戊酸血药浓度并与其他方法进行比较的研究报道。本研究对FICA法检测丙戊酸血药浓度进行性能验证，并对比FICA法和HPLC法的检测结果，评估其一致性，探讨FICA法的临床应用注意事项场景，为丙戊酸TDM的方法选择提供参考。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器与材料
AFS2000A型干式荧光免疫分析仪（广州蓝勃生物科技有限公司）；FLC2421型全自动二维液相色谱仪及一维色谱柱Aston SC2-1A柱（25 mm × 3.5 mm，5 μm）、中间色谱柱Aston SN（10 mm × 4.6 mm，5 μm）、二维色谱柱Aston SCB-2A柱（100 mm × 4.6 mm，5 μm）均购自湖南德米特仪器有限公司；L500型低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Eppendorf5424型高速离心机及移液器（德国艾本德公司）。
1.2 主要药品与试剂
丙戊酸检测试剂盒（荧光免疫层析法用，北京丹大生物技术有限公司，批号：FFE04W）；VCV-1D移动相（批号：20241203-1）、OPI-1有机移动相（批号：20241129-1）、BPI-1碱性移动相（批号：20241203-1）、API-1酸性移动相（批号：20240516-1）以及预处理试剂ACP-1去蛋白剂（批号：20240923-1）、ACG-1A保护剂（批号：20241010-1）、丙戊酸钠调试溶液（批号：20200407）等均购自湖南德米特仪器有限公司。
1.3 样本收集
收集2024年7月—2025年1月在弥渡县人民医院就诊并使用丙戊酸药物的患者的常规检验剩余血液样本50例次为研究样本。血液样本离心（2 500 ×g）5 min分离血浆，置于-30 ℃冰箱备用。本研究经弥渡县人民医院医学伦理委员会审核批准（批准号：2024伦理L第1号），并豁免受试者知情同意。
2 方法与结果
2.1 FICA法
2.1.1 检测方法
将校准信息卡插入干式荧光免疫分析仪中，读取内置校准曲线。精密吸取10 μL血浆样本，加入含缓冲液的试剂管中，涡旋混合10 s使其充分混匀。随后准确吸取80 μL混合液，加至测试卡的加样孔中，将测试卡插入分析仪，于设定条件下进行孵育。仪器自动检测荧光信号强度，并根据已读取的校准曲线自动计算样本中丙戊酸的浓度。本方法的线性检测范围为10~160 μg/mL。
2.1.2 方法验证
（1）选择性：取5份不同来源的空白人血浆进行检测，结果显示丙戊酸浓度均低于10 μg/mL，表明本方法在空白基质中无明显干扰，选择性良好。
（2）准确度：分别对高、低2个浓度水平（129.76 μg/mL和68.95 μg/mL）的质控品各进行3次重复检测，计算各水平3次测定结果的平均值，并与质控样品标示值进行比较。结果显示，高、低浓度水平的相对偏差分别为0.41%和-4.03%，均在可接受范围内，表明本方法准确度良好。
（3）精密度：分别选取线性范围内的高、低浓度水平样本，各重复检测5次，计算测定结果的变异系数（coefficient of variation，CV）。结果低浓度水平样本的CV为2.49%，高浓度水平样本的CV为5.78%，均小于10%，表明本方法具有较好的精密度。
2.2 HPLC法
2.2.1 色谱条件
色谱柱：一维柱为Aston SC2-1A柱（25 mm×3.5 mm，5 μm），中间柱为Aston SN（10 mm×4.6 mm，5 μm），二维柱为Aston SCB-2A柱（100 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：一维流动相为VCV-1D溶液，初始流速为0.5 mL/min；辅助流动相为纯水，初始流速为2 mL/min；二维流动相为BPI-1碱性移动相、API-1酸性移动相和OPI-1有机移动相梯度混合，流速为1.0 mL/min；色谱柱柱温为40 ℃；紫外检测波长为305 nm；进样量为200 μL［6］。
2.2.2 检测方法
精密吸取200 μL血浆，加入ACP-1去蛋白剂600 μL，涡旋混匀1 min后，高速离心（18 407 ×g）8 min，取上清液650 μL移至进样瓶中，再加入65 μL ACG保护剂，涡旋振荡，进样200 μL，系统实时采集色谱图谱并记录特征峰面积数据，基于预先建立的标准曲线，由工作站自动匹配峰面积并计算目标物浓度值，线性检测范围为9~150 μg/mL。
2.2.3 方法验证
（1）选择性：取5份不同来源的空白人血浆，按“2.2.2”项下方法处理并测定，结果显示丙戊酸均未被检出，表明血浆内源性物质对测定无干扰，本方法选择性良好。
（2）线性范围与定量下限：取标准曲线样品，按“2.2.2”项下方法处理并测定，以丙戊酸的峰面积（Y）对浓度（X， μg/mL）进行线性回归。结果显示，丙戊酸在6.41~205.03 μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y = 2 934.69X + 174.57，r = 0.999 3。本方法的定量下限为6.41 μg/mL。
（3）准确度与精密度：取低、中、高（22.59、59.51、119.01 μg/mL）3个浓度水平的质控样品，按上述方法处理并测定，每个浓度各设5份平行样，用以评价准确度和日内精密度；连续测定3 d，用以评价日间精密度。结果表明，各浓度水平质控样品的准确度在96.5%~102.9%（n=5）之间，日内及日间精密度的CV均小于5.0%，符合生物样品分析方法指导原则的要求，说明本方法的准确度与精密度良好。
2.3 统计学分析
采用MedCalc®V20.100软件对检测结果进行统计分析。通过Shapiro-Wilk法检验样本差值的正态性；采用Bland-Altman偏差图和Passing-Bablok法进行一致性评价［10-11］，临床可接受的一致性界限设定为±20%［12］。其中FICA法为比较的待评价系统，HPLC法为检测系统。
2.4 正态检验结果
50份标本中有3份检测结果超出线性范围的15%，最终47份标本结果纳入统计。对2种检测方法的结果差值进行Shapiro-Wilk检验，显示服从正态分布（W= 0.978 1，P= 0.518）。当W值趋近于1且P> 0.05时，表明数据符合正态分布假设，因此2种方法的检测结果差异符合正态分布特性。
2.5 Bland-Altman偏差图
采用MedCalc统计分析软件对两种检测方法的测定数据集进行Bland-Altman一致性评估［11-12］，结果如图1所示。以2种检测方法测定值的算术均值为横坐标（X轴），以二者相对偏差百分比［（差值/均值）×100%］为纵坐标（Y轴），图中2条水平虚线表示95%一致性界限，中央实线为平均偏差线，中央虚线代表差值均数为0。FICA法比HPLC法平均偏高7.4%；95%一致性界限内有45个散点，其占总点数的95.74%（45/47）。
2.6 回归分析结果
将2种方法的检测值输入MedCalc软件进行Passing-Bablok回归分析，以FICA法检测结果为X，HPLC法检测结果为Y，分析结果如图2所示。其中，线性度测试P= 0.62 > 0.05，说明样本数据适合使用Passing-Bablok回归分析；Spearman相关系数为0.918（P< 0.01），说明具有很强的正相关关系；回归方程为Y=1.186X-11.311（n=47）；截距为-11.311，95%置信区间（confidence interval，CI）（-16.512，-4.111）；斜率为1.186，95%CI（1.055，1.314）。
3 讨论
3.1 统计方法
数据统计同时采用Bland-Altman分析和Passing-Bablok回归分析2种方法能够从不同的角度进行综合评价，避免使用1种方法的局限性对一致性评价的结果产生影响，结果更加真实可靠，是广泛应用于方法学一致性评价的统计学方法。本次分析结果显示FICA法比HPLC法平均偏高7.4%，95%一致性界限内有45个散点，占比95.74%（> 95%），说明HPLC法和FICA法一致性较好；但95%一致性界限内百分比偏差的最大值为43.33%，2025年临床检验室间质量评价计划规定可接受范围为丙戊酸靶值±20%［12］，本研究中2种方法间的最大偏差远超此范围，不建议直接替换使用。
3.2 差异分析
有报道FICA法和其他方法检测万古霉素［9，13］、去甲万古霉素［9］、霉酚酸［14］、英夫利西单抗［15］和利奈唑胺［16］等血药浓度的比较研究，多认为一致性较好。李金银等［8］比较了FICA法与液相色谱-串联质谱法检测丙戊酸血药浓度的相关性和一致性，结果显示2种方法的结果存在强相关性，无显著差异。而龙泽禹等［9］对比FICA法和HPLC法，结果显示相关性和一致性较差，FICA法结果高于HPLC法。本研究也发现FICA法检测丙戊酸血药浓度结果与HPLC法一致性不佳。
FICA法检测时是通过丙戊酸与偶联了荧光颗粒的单克隆抗体结合，形成荧光颗粒-抗体-抗原的复合物，该复合物与预包被的丙戊酸-牛血清白蛋白偶联物结合，干式荧光免疫定量分析仪对光学信号进行测量和分析处理，定量得出被测物质的浓度。FICA法检测结果普遍高于HPLC法，可能是因为FICA法存在的特异性问题而导致结果普遍偏高。在选择性试验中使用空白血浆进行丙戊酸浓度检测，虽然满足生物样品定量分析方法验证的要求，但所测得最大浓度为5.13 μg/mL，本底较HPLC法更高，提示本方法在检测丙戊酸血药浓度时结果可能会比真实值偏高。
在检测操作的过程中，FICA法仅取10 μL血浆样本加入缓冲液中，10 μL的样本量较小，更容易受到随机误差的影响，例如吸取过程中出现液滴悬挂和残留而导致较大的误差，这样较小的血浆量一定程度上会放大随机误差的影响，导致测量结果的精密度和准确度降低，建议厂家优化样本前处理方法，适当增大检测加入的样本量。
但从检测速率方面比较，单个样本用HPLC法检测约需30 min，FICA法约需20 min，若样本量增加，HPLC法按序进样，每增加1个样品约需增加10 min，而FICA多通道同时孵育，因此需增加的时间不多，速度明显较HPLC法更快。此外，FICA法试剂为单人份独立包装，有效期长，适合总检测量不大，但需即时出具结果的临床场景。
3.3 局限性
本研究样本量虽满足Passing-Bablok建议的最低样本量（30~50对观测值），但样本量仍相对有限，对偏倚的估计精度可能不足。未来研究可扩大样本量，以更全面地评估2种方法在不同浓度水平下的一致性表现。
此外，丙戊酸在临床常与拉莫三嗪、卡马西平等抗癫痫药物联用，这些药物及其代谢物可能对FICA法的免疫反应产生交叉干扰。本研究未系统评估常见联合用药对FICA法检测结果的影响，这在一定程度上限制了该方法在复杂临床用药场景下的适用性评估。
3.4 小结
本研究对FICA法与HPLC法检测丙戊酸血药浓度的一致性进行综合评价，结果显示2种方法间一致性欠佳，不建议直接互换，运用FICA检测结果进行临床决策时要关注检测方法，必要时但可以利用回归方程Y=1.186X-11.311将FICA法的检测结果换算为HPLC法的检测结果进行换算，或制订FICA法适用的参考区间。但FICA法因其简便快速、成本低廉等优势，可作为急诊筛查及HPLC法的应急补充。
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