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目的 建立固相萃取-离子色谱-抑制电导（SPE-IC-CD）测定盐酸普萘洛尔片剂及辅料中亚硝酸根和硝酸根离子的方法，探讨其与基因毒性杂质N-亚硝基普萘洛尔（NPPN）形成的相关性及来源。
方法 采用DionexIonPac™ AS11-HC RFIC™ 阴离子分析柱（250 mm×4.0 mm，9 μm）及AG11-HC RFIC™配套保护柱（50 mm × 4.0 mm），柱温：35 ℃，电导检测器池温：40 ℃，流速：0.8 mL/min，进样体积：100 μL，以淋洗液发生器在线产生的氢氧化钾溶液为流动相进行梯度洗脱。
结果 亚硝酸根和硝酸根在10.00~500.00 ng/mL范围内线性良好（r > 0.999 6）；平均回收率分别为97.8%和98.0%，RSD分别为1.3%和0.8%（n=9）；检测限均为3.00 ng/mL，定量限均为10.00 ng/mL。在NPPN含量不同的片剂及辅料中均检出目标离子，相关性分析显示NPPN含量与亚硝酸根、硝酸根含量呈显著正相关（P < 0.05），且离子来源均为制剂辅料。
结论 本法灵敏度高、专属性强，适用于片剂及辅料中亚硝酸盐和硝酸盐的测定；NPPN的产生与辅料中残留的亚硝酸盐和硝酸盐直接相关，研究结果为制剂中NPPN杂质的质量控制策略制定提供了重要试验依据与理论参考。
基因毒性杂质是指直接或间接损伤DNA，引发基因突变、染色体畸变或DNA链断裂的微量杂质，即使极低浓度下，长期暴露也可能增加癌症风险或导致可遗传的基因缺陷［1-2］。亚硝胺类杂质是公认的基因毒性杂质［3］，其生成的根本原因在于前体胺（二级胺、三级胺、季铵盐或酰胺）与亚硝酸试剂在酸性条件下反应（图1）［4］。
盐酸普萘洛尔片主要用于高血压、心绞痛和心律失常的治疗［5］，其分子中的仲胺结构是生成N-亚硝基普萘洛尔（N-nitrosopropranolol，NPPN）的核心前体，而药品生产全链条中水、起始物料、中间体、催化剂等可能残留亚硝化试剂，其中亚硝酸根离子（NO₂⁻）和硝酸根离子（NO₃⁻）因来源广、稳定性较高，成为最主要的风险诱因——NO₃⁻在酸性环境下可转化为NO₂⁻，进而与仲胺反应生成基因毒性杂质NPPN，即使痕量残留也需严格定量控制［6］。
NO₂⁻和NO₃⁻的常见检测技术包括滴定法、比色法、UV法、电化学法、荧光光谱法、GC法、HPLC法和离子色谱法等。其中，滴定法和比色法操作繁琐且误差较大［7］；UV法易受样品基质干扰［8］；电化学法重现性不佳［9］；荧光法灵敏度低且操作复杂［10］；GC法需衍生化处理，耗时且易引入误差［11］；HPLC法依赖衍生或特殊检测器，成本高且易受基质干扰［12］；而离子色谱法具有专属性强、灵敏度高、操作简便、绿色低毒等优势，广泛应用于复杂基质中NO₂⁻与NO₃⁻的痕量分析［13-14］。
为系统探究盐酸普萘洛尔中NPPN的生成与辅料中NO₂⁻、NO₃⁻残留的关联性，完善该类药物的基因毒性杂质质量控制体系，本研究以盐酸普萘洛尔片剂及其辅料为对象，建立了固相萃取-离子色谱-抑制电导法（solid-phase extraction coupled with ion chromatography-suppressed conductivity detection，SPE-IC-CD）测定痕量NO₂⁻与NO₃⁻，通过统计分析确定NPPN与残留NO₂⁻与NO₃⁻的相关性并探究其来源，以期为片剂中NPPN的控制提供参考。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器
CS-6000+离子色谱仪（包括 EG 淋洗液在线发生器、电导检测器、ASRS 300 抑制器、AS自动进样器及Chromelon软件）、OnGuard Ⅱ RP Cartridge 2.5cc和OnGuard Ⅱ Ag-H Cartridge 2.5cc固相萃取柱均购自美国Dionex公司；Milli Q IQ7000型超纯水仪（德国Millipore公司）；MSE125P-000-DU电子天平（美国Sartorius公司）；WIGGENS-UA22MFD型超声波清洗器（德国Wiggens公司）；Eppendorf AG 22337高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Seven Excellence pH计（瑞士Mettler-Toledo公司）。
1.2 主要药品与试剂
NO₂⁻ 标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号：248053-1，含量：1 000 μg/mL）；NO₃⁻ 标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号：247055-1，含量：1 000 μg/mL）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。
本研究所用样品为2024年国家药品抽检计划中抽取的盐酸普萘洛尔片（规格：10 mg），共计18批次，涉及A、B、C、D、E、F共6家生产企业；同时收集了其中5家生产企业所用辅料，以及G企业生产的3批次参比样品（批号：60048437、60048438、60048566）。
2 方法与结果
2.1 测定方法
2.1.1 SPE-IC-CD法测定NO₂⁻与NO₃⁻的色谱条件
色谱条件：采用Dionex IonPac™ AS11-HC RFIC™ 阴离子色谱柱（250 mm × 4.0 mm，9 μm）及同系列AG11-HC RFIC™ 保护柱（50 mm × 4.0 mm），配备Dionex ASRS® 300型抑制器（4 mm）；柱温为35 ℃；流动相为淋洗液发生器在线产生的氢氧化钾溶液，梯度洗脱（0~5 min，5 mmol/L；5~18 min，5→20 mmol/L；18~21 min，20 mmol/L；21~21.1 min，20→30 mmol/L；21.1~24 min，30 mmol/L；24~24.1 min，30→5 mmol/L；24.1~30 min，5 mmol/L）；流速为0.8 mL/min；电导检测器池温为40 ℃；进样体积为100 μL。
2.1.2 NPPN测定方法色谱和质谱条件
色谱条件：采用Agilent Pursuit XRs Diphenyl色谱柱（150 mm × 3.0 mm，2.7 μm），以含10 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸溶液为流动相A，以含0.1%甲酸的甲醇溶液为流动相B，进行梯度洗脱（0~2 min，10% B；2~5 min，10% → 50% B；5~14 min，50% → 70% B；14~17 min，70%→90% B；17~19 min，90% B；19~19.1 min，90%→10% B；19.1~23 min，10%B）；流速为0.4 mL/min，柱温为40 ℃，进样体积为5 μL［5］。
质谱条件：采用三重四极杆质谱分析器，电喷雾离子源正离子模式；干燥气温度为325 ℃，干燥气流速为7 L/min；喷雾电压为40 psi；鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为11 L/min；毛细管电压为3 000 V；采用多反应监测模式，监测离子对为m/z289.2→72.1（定量离子）、m/z289.2→259.2和m/z289.2→145.2（定性离子）［5］。
2.2 溶液的配制
2.2.1 供试品溶液
取盐酸普萘洛尔片剂20片，精密称定，研细，精密称取适量粉末（约相当于盐酸普萘洛尔100 mg），置50 mL离心管中，精密加入10 mL去离子水，涡旋混匀10 min，振摇10 min，离心（10 800 ×g）10 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，用10 mL注射器吸取续滤液8 mL，置处理后的OnGuard Ⅱ RP Cartridge 2.5cc 和OnGuard Ⅱ Ag-H Cartridge 2.5cc 固相萃取柱上（2根固相萃取柱上下串联，依次用注射器吸取甲醇5mL与水10 mL冲洗活化），推动注射器活塞过滤或用抽滤泵抽滤，待续滤液流出，收集第6~8 mL续滤液，即得。
2.2.2 空白溶液
精密加入10 mL去离子水，置处理后的OnGuard Ⅱ RP Cartridge 2.5cc 和OnGuard Ⅱ Ag-H Cartridge 2.5cc 固相萃取柱上，推动注射器过滤，待续滤液流出，收集第 6~8 mL续滤液，即得。
2.2.3 辅料溶液
精密称取约100 mg单一辅料，置50 mL离心管中，精密加入10 mL去离子水，涡旋混匀10 min，振摇10 min，离心（10 800 ×g）10 min，0.45 μm滤膜过滤，即得。
2.2.4 混合对照品储备液
精密量取NO₂⁻ 与NO₃⁻ 标准溶液各0.1 mL，置同一100 mL量瓶中，加去离子水定量稀释成每1 mL中各约含1 000 ng的溶液，即得。
2.2.5 系列对照品溶液
精密量取混合对照品储备液1.0 mL，分别置100、50、25、15、10、5、2 mL量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL约含10、20、40、60、100、200、500 ng的系列对照品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性试验
精密量取空白溶液、100 ng/mL混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图（图2）。在该色谱条件下空白溶液和供试品溶液在NO₂⁻与NO₃⁻的出峰处无干扰，证明该方法专属性良好。
2.3.2 线性关系考察
精密量取“2.2.5”项下系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以浓度为横坐标（X，ng/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。
2.3.3 定量限和检测限
精密量取“2.2.4”项下混合对照品储备液，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比为10和3计算定量限和检测限。结果NO₂⁻与NO₃⁻的检测限均为3.00 ng/mL，相当于供试品溶液的浓度0.3 mg/kg，定量限均为10.00 ng/mL，相当于供试品溶液的浓度1.0 mg/kg。
2.3.4 精密度试验
取浓度为100 ng/mL的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6针，结果计算得NO₂⁻与NO₃⁻峰面积的RSD分别为0.6%和0.3%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.5 重复性试验
取同一批次样品（批号：2111007），按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，按标准曲线法计算含量。计算得NO₂⁻与NO₃⁻的平均含量分别为1.99 mg/kg和22.04 mg/kg，RSD分别为0.5%和0.8%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.3.6 回收率试验
精密称取9份B企业提供的未检出NO₂⁻与NO₃⁻的处方量的混合空白辅料100 mg，置50 mL离心管中，再分别加入1 000 ng/mL混合对照品溶液0.1、0.5、1.0 mL，制成3个浓度分别为10、50、100 ng/mL的加标样品溶液，每个浓度样品制备3份，按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法平行制备9份加标回收率测定溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得NO₂⁻与NO₃⁻的平均回收率分别为97.8%和98.0%，RSD分别为1.3%和0.8%（n=9），表明本方法回收率良好。
2.4 样品测定
取6家生产企业的抽检样品（18批次）、参比样品（3批次）、5家生产企业提供的辅料，按“2.2.1”项下制备供试品溶液，“2.2.3”项下制备辅料溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，采用标准曲线法计算片剂和辅料中NO₂⁻与NO₃⁻含量，结果见表2和表3。
采用实验室建立并经过方法学验证的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法［5］，对上述6家生产企业18批次抽检样品和3批次参比样品中的NPPN进行定量检测，结果见表2。比较6家生产企业NPPN的检出量，图3结果显示，在6家生产企业的18批次样品中，企业D的2批样品超过拟定限度（6.25 ppm）［15-16］，其他生产企业样品均小于拟定限度，但检测结果普遍高于限度的10%，属于高风险控制杂质。
比较6家生产企业的抽检样品和参比样品中NO₂⁻与NO₃⁻含量，图4结果显示，抽检样品和参比样品均检出NO₂⁻，检出量均小于3 mg/kg，其中D企业片剂中NO₂⁻含量明显高于其他5家生产企业样品；NO₃⁻的检出量明显高于NO₂⁻的检出量，其中D企业和F企业样品中NO₃⁻检出量明显高于其他生产企业样品。
对片剂中NPPN检出量与NO₂⁻、NO₃⁻含量之间进行Pearson相关性分析，由NPPN、NO₂⁻、NO₃⁻含量3个变量两两之间的矩阵散点图（图5）可知，NO₂⁻和NPPN之间存在显著正相关（P < 0.05），Pearson相关系数为0.434（表4）；而NO₃⁻和NPPN之间相关性不显著，提示片剂中NO₂⁻的残留是产生NPPN的主要因素，NO₃⁻的残留是次要因素。
在进行亚硝胺类杂质风险评估时，通常认为亚硝胺的生成需要3个要素：亚硝化试剂、胺和酸性条件。其中评估物料中亚硝化试剂的来源，可从起始物料、溶剂和试剂、副产物、生产用水和辅料中的杂质、操作单元以及辅助操作等方面进行评估［17-18］。在实验室条件下，为了考察亚硝化试剂的来源，对各生产企业提供的部分原料和辅料中的NO₂⁻与NO₃⁻进行测定，原料中均未检出NO₂⁻与NO₃⁻，而辅料中检出不同含量的NO₂⁻与NO₃⁻，说明NO₂⁻与NO₃⁻主要由辅料引入。
对各生产企业提供的辅料进行检测，结果显示玉米淀粉、糊精、蔗糖和羟丙甲纤维素中检出了不同量的NO₂⁻与NO₃⁻；辅料中残留的NO₂⁻与NO₃⁻是产生NPPN的主要因素；用量较大的辅料糊精和羟丙甲纤维素中引入NO₂⁻风险较高；当存在蔗糖等还原性辅料时，玉米淀粉中残留的NO₃⁻也会作为间接亚硝化试剂，促进亚硝化反应生成NPPN；不同来源的辅料NO₂⁻与NO₃⁻的残留量差异较大。
3 讨论
3.1 前处理方法的优化
3.1.1 称样量的选择
盐酸普萘洛尔片剂中辅料占比较高，易对检测造成较强干扰，因此称样量的选择对试验结果至关重要。称样量过大时，样品会出现严重糊化现象，主成分与氯离子（Cl-）会干扰目标峰；称样量过小则无法满足检测灵敏度要求。本研究考察了5、10、20片3个称样量水平，结合色谱峰形、分离度、灵敏度及基线稳定性进行综合评价，结果表明，称样量为10片（约相当于盐酸普萘洛尔100 mg）时效果最佳。
3.1.2 固相萃取条件优化
采用 50 mL离心管进行提取，精密加入10 mL去离子水，涡旋混匀10 min，振摇10 min，离心分离上清液；上清液依次过SH-C18柱、SH-Ag 柱净化；由于样品中主成分干扰测定，采用SH-C18柱去除大部分主成分。Cl-含量较高，使用SH-Ag柱去除Cl-，避免过量的Cl-干扰NO₂⁻与NO₃⁻的测定。并对涡旋时间进行优化，涡旋5 min时样品提取回收率偏差较大，延长涡旋时间至10 min后，回收率接近100%且趋于稳定。
3.2 色谱条件优化
3.2.1 色谱柱与淋洗液的选择
选用ThermoDionexIonPac AS11 阴离子交换色谱柱（250 mm × 4.0 mm，9 μm），搭配AG11保护柱（50 mm × 4.0 mm），针对NO₂⁻与NO₃⁻的分离特性，对比考察了氢氧化钾（KOH）溶液（5~30 mmol/L）梯度洗脱与碳酸钠-碳酸氢钠（Na2CO3-NaHCO3）混合淋洗液。Na2CO3-NaHCO3体系中2种离子保留时间接近，分离度小于1.5，且存在基质干扰；KOH 梯度洗脱（同“2.1”项下色谱条件），5.0~18.0 min KOH浓度由5 mmol/L线性升至20 mmol/L，NO₂⁻与NO₃⁻分离度大于3.0，出峰时间分别为14.2 min 和19.6 min，无辅料基质峰和Cl-的干扰，且基线噪音低，最终选定KOH梯度洗脱模式，淋洗液由淋洗液发生器在线产生，避免手动配制带来的误差。
3.2.2 流速与抑制器条件优化
流速考察0.8~1.2 mL/min，抑制器电流考察50 ~ 100 mA。流速1.0 mL/min时，与峰形对称，柱压稳定在12 MPa以内；抑制器电流设为50 mA时，背景电导 < 5 μs/cm，目标离子响应值最高，且基线漂移 < 0.1 μs/cm，满足定量要求。因此，最终确定流速为1.0 mL/min，抑制器电流为50 mA。
3.2.3 柱温的优化
考察柱温30、35、40 ℃对保留时间与重现性的影响，随温度升高，保留时间略有所提前，但分离度变化不大；35 ℃时保留时间的RSD < 0.5%，基线稳定性最好，故选择柱温为35 ℃。
3.2.4 进样量的选择
由于样品中NO₂⁻与NO₃⁻多为痕量水平，对仪器灵敏度有较高要求。适当增加进样量虽可提升检测灵敏度，但进样量过大则易引发色谱柱过载，造成主成分峰、Cl-峰等色谱峰展宽变形，进而干扰目标待测物的分离与准确定量。基于此，本研究考察了50、80、100、200 μL 4种不同进样量，从分离效果、峰形对称性、峰面积响应值及基线稳定性等维度进行综合评价。结果表明，当进样量为100 μL时，色谱峰峰形规整、对称性良好，兼具较高的检测灵敏度，且基线平稳、噪音水平低，可兼顾检测灵敏度与分离效果的最优平衡。NO2-与NO3-的检出限均达到 0.3 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg，既能满足辅料与片剂中低含量离子的检测需求，又无过载现象，最终确定进样量为100 μL。
3.3 小结
本研究以盐酸普萘洛尔片及其辅料为研究对象，建立了SPE-IC-CD法检测法测定盐酸普萘洛尔片剂及其辅料中痕量的NO₂⁻与NO₃⁻，采用SH-C18柱、SH-Ag柱去除药物主成分和Cl-，效果较好，经方法学验证，该方法灵敏度高、专属性强、分离度好、前处理简单，可用于盐酸普萘洛尔片剂及其辅料中痕量NO₂⁻与NO₃⁻的检测；并通过统计学相关性分析以确定盐酸普萘洛尔片剂中的基因毒性杂质NPPN的产生与辅料中残留的NO₂⁻与NO₃⁻直接有关。该方法可为基因毒性杂质的质量控制体系完善与药品监管科学决策提供数据支撑，既助力制药企业优化产品质量内控流程、实现原辅料高效快速筛查与风险分级管控，对完善同品种药品杂质控制体系、提升药品安全监管水平具有重要应用价值与研究意义。
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