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目的 考察影响汽相过氧化氢灭菌时不锈钢载体生物指示剂芽孢计数的因素。
方法 分别对洗脱液、洗脱方式、洗脱时间3个因素在2个水平上进行芽孢洗脱的全因子试验，并按照中国药典2020年版生物指示剂耐受性检查法指导原则对洗脱的芽孢悬液进行热激活、培养、计数，找出芽孢计数回收率最高的组合。
结果 洗脱时间对回收率的影响无统计学意义。洗脱液和洗脱方式两种因素对芽孢计数回收率的影响均有统计学意义，且两者之间存在交互作用，其中洗脱方式的主效应最强。
结论 使用纯化水作为洗脱液，超声洗脱15 min，可获得较好的回收率，该方法成本低、易操作，可用于不锈钢载体的汽相过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数。
自无菌隔离系统指导原则被独立收载入中国药典以来[1]，无菌隔离技术在我国药品质控领域得到了快速推广，其一般使用汽化过氧化氢对舱体进行灭菌从而达到无菌试验的环境要求。生物指示剂作为药品灭菌工艺监控、确认和验证的关键物质[2]，被认为是衡量灭菌效果是否达标的“金标准”，因此保证灭菌效果是否合理与生物指示剂的耐受性、产品特性、应用标准化等息息相关[3]。
由于汽相过氧化氢灭菌的原理是表面灭菌，芽孢悬液安瓿等形式的载体并不合适，而纸质等纤维基质或其他易吸收过氧化氢蒸汽或水分的高吸附性表面载体可能对过氧化氢蒸汽的浓度产生不利影响，因此用于汽相过氧化氢灭菌的生物指示剂载体通常为玻璃、金属、塑料等不透气的材质，其指示微生物可选用嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）等，芽孢数一般应大于1×106 cfu[4-6]。
芽孢计数作为生物指示剂稳定性的重要评估指标之一，其方法在各国药典和法规中均有收录，但关键的芽孢洗脱环节却无金属、塑料等不溶性载体的处理方法[4-5, 7-8]。本研究拟通过对可能影响芽孢洗脱的因素进行考察，找出影响芽孢计数的因素，以提高生物指示剂芽孢计数的准确性。
1 仪器与试剂
SK8210LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；ThermoMixer C型混匀仪（德国Eppendorf公司）；TW20型水浴槽（德国Julabo公司）；KS 18型生物安全柜（美国Thermo公司）；KB 400型恒温培养箱（德国Binder公司）。
Apex Discs生物指示剂（菌种：Geobacillus stearothermophilus 12980，美国Mesa Labs公司）；胰酪大豆胨琼脂培养基（德国Merck公司），蛋白胨（北京三药科技开发公司）；吐温80（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯化水（实验室自制）。
2 方法与结果
2.1 考察因素
本试验的生物指示剂载体为直径8.89 mm、厚度0.203 2 mm的铺有单层芽孢的304不锈钢圆片。根据供应商提供的芽孢计数操作指南，并结合文献，综合分析对芽孢洗脱可能产生影响的因素，主要有洗脱液、洗脱方式和洗脱时间[2, 4-5, 7, 9-13]。洗脱液中吐温80的加入对回收率的影响程度不同研究间存在差异[12-13]，洗脱方式和时间的选择至关重要，既需要尽量多地将微生物洗脱至洗脱液中，又不能破坏微生物的结构致其死亡[8-10]。
2.2 试验方法
将Apex Discs生物指示剂的菌片取出，接入内含4粒直径4~6 mm的玻璃珠和10 mL灭菌洗脱液的15 mL规格离心管中，洗脱液分两种：纯化水、含0.1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液。分别以超声（功率：500 W，频率：53 Hz）和2 000 r·min-1涡旋振荡的方式洗脱芽孢，洗脱时间分为设定为15 min和30 min。洗脱完成后按中国药典2020年版生物指示剂耐受性检查法指导原则进行后续的热激活处理、培养和计数[5]。
2.3 结果分析
2.3.1 芽孢计数回收率
生物指示剂在不同洗脱液、洗脱方式和洗脱时间的处理后进行芽孢计数并计算回收率，回收率应在0.5~3范围内[5]。结果见图1。
2.3.2 基于试验设计考察各因素对芽孢计数回收率的影响
利用Minitab 19.2020.1软件进行全因子实验设计（DOE），并以芽孢计数回收率为统计量进行方差分析，结果见表1。
根据芽孢计数回收率影响因素的方差分析结果以及帕累托图（图2）可知，洗脱液、洗脱方式对回收率的影响均有统计学意义（P=0.001或P＜0.001），且两者间存在交互作用（P＜0.05），而洗脱时间对回收率的影响无统计学意义（P＞0.05）。
芽孢计数回收率影响因素的主效应图（图3）表明，洗脱方式的主效应最强，超声相对于涡旋振荡可提高回收率；洗脱液的主效应次之，0.1%吐温80的0.1%蛋白胨相较于纯化水可提高回收率；洗脱时间的主效应无统计学意义，但考虑到试验效率，选择15 min作为最终洗脱时间。
芽孢计数回收率影响因素的交互作用图（图4）表明，洗脱液与洗脱方式存在交互作用，其他因素两两间无明显交互作用。
综上，获得最高回收率的处理方式为使用0.1%吐温80的0.1%蛋白胨，超声（功率：500 W，频率：53 Hz）洗脱15 min。
3 讨论
3.1 洗脱液的影响
试验结果表明，无论是超声还是涡旋振荡，使用0.1%吐温80的0.1%蛋白胨作为洗脱液，得到的回收率均略高于纯化水，但如果同时考虑成本和易得性，纯化水为较优选择。
3.2 洗脱方式的影响
使用涡旋振荡的回收率远低于要求，且若无专用支架，产生的涡旋与手部施加的压力有关，得到的结果可能存在较大浮动[10]。
超声波由于频率高、波长短，所以传播的方向性好，穿透力强，使用超声洗脱可得到较好的回收率，但在使用超声时需要注意以下几点：①应使用金属，最好是不锈钢支架放置样品，以减少对超声波的吸收和屏蔽，并确保样品底部不直接接触超声仪清洗槽的底部，以免影响换能器产生超声波；②控制同时进行超声的样品量，并确定其位置，最好是均匀等距分布，以免因为驻波、样品阻挡、超声波吸收和衰减等原因，导致清洗槽中的超声强度不均匀，同时过多的样品量和杂乱的摆放也会影响超声效果；③应确保液面浸没过样品，以保证洗脱效果；④在将样品放入超声仪前，应开启超声排气5 min，以消除气泡对超声能量传递的阻碍[9-10, 14-16]。
3.3 洗脱时间的影响
在前期预试验中，当超声时间设置为5 min和10 min时，芽孢计数回收率均小于0.5，且根据供应商提供的生物指示剂芽孢计数操作指南建议超声的最短时间为15 min，故试验选择15 min和30 min作为考察的洗脱时间[9]。在同样的洗脱液和洗脱方式下，15 min洗脱时间的回收率均略高于30 min，说明洗脱时间并不是越长越好。造成该现象的原因可能是超声和涡旋时间过长造成了部分微生物的物理损伤和死亡[10]。此外，随着洗脱时间的延长清洗槽内的温度会升高，有研究表明，在其他条件不变的前提下，超声波在35~60℃时的空化效果较好，当清洗槽内的温度过高时，空化气泡的蒸气压也随之上升，导致空化强度下降，影响洗脱效果[14-15]。
另外，在洗脱体系中适当添加玻璃珠可增加表面摩擦，帮助微生物的洗脱，进而提高回收率。但过量或体积过大的玻璃珠会增加微生物黏附的表面面积，且超声和振荡的时间过长、频率过大，也会造成玻璃珠对微生物的损伤，应注意适当使用[10]。
3.4 小结
使用纯化水作为洗脱液，加入4粒直径4~6 mm的玻璃珠，超声洗脱（功率：500 W，频率：53 Hz）15 min，可获得较好的回收率，该方法成本低、易操作，可用于不锈钢载体的汽相过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数。
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