目的 探究金花葵的抗疲劳功效及其潜在作用机制，为金花葵资源的高值化开发及抗疲劳功能食品的研发提供依据。

方法 采用昆明小鼠负重游泳力竭实验评价金花葵水提物的抗疲劳活性，及对小鼠血乳酸、肝糖原及肌糖原含量的影响。基于网络药理学方法筛选金花葵活性成分，预测其作用靶点，与疲劳相关靶点取交集后构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并进行基因本体论功能注释和京都基因与基因组百科全书通路富集分析，预测其抗疲劳潜在机制。通过分子对接验证核心成分与关键靶点的结合能力。

结果 研究共纳入32只小鼠，金花葵水提物可显著延长小鼠负重游泳力竭时间，降低血乳酸水平，提高肝糖原与肌糖原含量（P < 0.05）。共筛选得到金花葵15种关键活性成分（以黄酮类、生物碱及氨基酸衍生物为主）及13个核心靶点，主要涉及有氧氧化电子传递链、无氧糖酵解及炎症反应等生物过程。分子对接结果显示，白杨素等关键成分与核心靶点具有良好的结合活性。

结论 金花葵可能通过其黄酮类、生物碱等活性成分，调控蛋白激酶Bα、热休克蛋白90αA1等关键靶点及相关通路，发挥抗疲劳作用。

疲劳是机体身心层面共同出现的能量代谢衰减状态，其中身体和认知功能因表现疲劳度和感知疲劳度之间的相互作用而受到限制^［1］。疲劳可能是一种原发性的症状表现，也可能是由于其他疾病导致的继发性症状，并与多种疾病密切相关，例如癌症性疲劳、慢性肾病性疲劳，以及肌肉硬化综合征等^［2-3］。根据疲劳发生的部位和机制不同可以分为中枢性疲劳和外周性疲劳，也会在心理或身体方面分别有所表现，进而不同程度地影响生活质量^［4］。疲劳研究具有多学科性和碎片化特征，这种复杂性与研究视角的局限性，使得疲劳的分子调控机制尚未完全阐明，其临床干预与治疗均受到显著限制^［1］。中医药因其多成分、多靶点、多途径的特点，在治疗疲劳方面展现出独特优势，可通过多种途径缓解疲劳^［5-7］。中药活性成分如多糖、生物碱、黄酮类物质等，可通过调节能量代谢、清除氧化自由基、抑制神经炎症等途径发挥抗疲劳作用^［5-6］。多种药食同源物质及营养素在抗疲劳方面也有出色表现，且具有安全性高、易开发的优势，更具应用潜力^［8-13］。

金花葵（Hibiscus manihot L.）别名菜芙蓉等，在中国具有悠久的栽种和食用历史记载，含有丰富的营养物质和生物活性成分，包括生物碱、不饱和脂肪酸、有机多糖、黄酮类化合物等，这些成分均为天然产物中常见的抗疲劳活性物质类型^［14-15］。研究证实，金花葵具有解热抗炎、调节血脂、抗氧美白、抑制肿瘤、改善心脑血管、保护肝脏等多种生物学作用，其中抗氧化、抗炎及调节代谢的作用，与机体疲劳发生过程中的氧化应激、炎症反应、能量代谢紊乱等病理环节密切相关^［16-17］。同属锦葵科的黄秋葵已被证实具有一定抗疲劳作用，但相关活性成分与分子机制仍有待深入探究^［18-20］。与黄秋葵相似，金花葵兼具丰富的营养与药用价值，且含有大量黄酮类、多糖类等潜在抗疲劳活性成分，但其抗疲劳相关研究仍较为匮乏。基于此，本研究结合动物体内药效实验与网络药理学对金花葵的抗疲劳作用进行研究，明确金花葵的抗疲劳作用效果，预测其作用靶标和生物学机制，为金花葵药食同源开发、抗疲劳功能产品研发以及中药抗疲劳的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

TG16-WS台式高速离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV1800紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；DKM610C烘干机（上海亨东仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

金花葵药材在邢台学院试验田内种植采收，经邢台学院食品科学与生物工程学院刘华梁讲师鉴定为锦葵科秋葵属植物金花葵（Hibiscus manihot L.）全株。

对羟基联苯（上海麦克林生化科技有限公司，分析纯）；氟化钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；无水乙醇（天津益力化学试剂有限公司，分析纯）；DL-乳酸锂（上海麦克林有限科技公司，纯度97%）；硫酸铜（天津市化工三厂有限公司，分析纯）；三氯乙酸（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；石油醚（天津益力化学试剂有限公司，分析纯）；浓硫酸（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；标准葡萄糖溶液（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。0.9%氯化钠溶液：氯化钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯），加超纯水配制成质量分数0.9%的氯化钠溶液，分装后121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却至室温后用于小鼠灌胃操作。

1.3 动物

6~8周龄雄性昆明小鼠，体重（20 ± 2）g，购自河北医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（冀）2018-004，饲养于清洁的室温22~25 ℃的动物房内，给予正常昼夜节律光照，自由饮水摄食。动物实验已经通过华北医疗健康集团邢台总医院实验动物福利伦理委员会审批（批件：XTZYY-21-2412-04）。

1.4 网络药理学数据与软件

TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemicalBook（https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx）PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中国知网（https://www.cnki.net/）、SwissTargetPrediction网站（http://www.swisstargetprediction.ch/）、SEA Search Server网站（https://sea.bkslab.org/）、蛋白质数据库UniProt（https://www.uniprot.org/）、韦恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、STRING数据库（https://cn.string-db.org/）、PDB数据库（https://www.rcsb.org/）、DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）、微生信在线生物信息学分析平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）、Cytoscape 3.10.3软件、Open Babel GUI、Autodock tools软件、PyMOL 3.1软件。

1.5 体外实验方法

1.5.1 金花葵提取液的制备

金花葵全株50~60 ℃烘干至恒重后研磨粉碎，过60目筛，称取质量后按药液比1∶10 （g/mL）的比例加入适量石油醚，室温震荡脱脂6 h，置于通风处过夜，待石油醚完全挥发晾干后称定质量，加入20倍量的蒸馏水，90 ℃水浴2 h，提取液离心（700 × g）10 min取上清液，然后40 ℃浓缩至含原药0.50 g/mL，并分别配成含原药0.15 g/mL，0.30 g/mL的溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.5.2 动物分组与负重游泳力竭实验

将32只小鼠随机分为4组（每组8只），分别给予生理盐水（NS组）和低（0.15 g/mL，L组）、中（0.30 g/mL，M组）、高（0.50 g/mL，H组）浓度金花葵水提液灌胃，1次/d，0.1 mL/次，连续灌胃14 d，期间对小鼠做1次适应性训练，实验前后各称量1次体重。L组有1只小鼠意外溺水死亡，其余动物在实验过程中均正常。

将小鼠尾部缠绕自身体重5%的铅丝，依次置于游泳箱中游泳［游泳箱水深大约30 cm、温度（30 ± 1）℃］，随时用温度计测量水温，保持水温的恒定。当小鼠开始30 s内连续呛水5次或5次以上时即代表小鼠力竭，此时立即将小鼠捞出，记录小鼠自下水至力竭的时间。力竭小鼠捞出后迅速摘取眼球取血，随后采用脱颈法处死小鼠取肝脏及腿部肌肉组织，进行后续实验^［5］。

1.5.3 生化指标测定

血乳酸含量测定^［21］：将血液置于室温环境中静置，凝固后离心（1 370 × g）15 min，取上清液即得血清。取0.01 mL血清加入0.48 mL 1%氟化钠和1.5 mL 10%三氯次酸溶液，混匀后离心10 min，取上清液0.5 mL置于带塞刻度试管中，先后加入4%硫酸铜溶液0.03 mL和3 mL浓硫酸，沸水浴15 min后取出，冰浴至15 ℃，滴加0.05 mL 1.5%对羟基联苯溶液并摇匀，转温水浴15 min，每5 min摇晃均匀1次，取出，沸水浴90 s，冷却，同时配置标准与空白，于560 nm波长处进行比色测定。

肝糖原和肌糖原含量测定^［22］：小鼠肝脏置于0 ℃生理盐水中清洗并吸干表面水分，称取1 g置于研钵中，加入少量石英砂和1 mL 10%三氯乙酸、2 mL 5%三氯乙酸研磨充分，离心（700 × g）10 min，取上清液加入等体积的95 %乙醇静置20 min，离心（700 × g）10 min，弃去上清液，在滤纸上将离心管倒放5 min，然后向沉淀中加入2 mL蒸馏水，摇晃均匀即为糖原提取液，同时配置空白与标准，分别加入蒽酮试剂10 mL，摇晃均匀，待温度冷却，沸水浴15 min，冷却后于620 nm波长处进行比色测定。另取小鼠腿部肌肉2 g，按上述步骤制作糖原提取液，采用蒽酮法测定肌糖原含量。

1.6 网络药理学研究

1.6.1 金花葵活性成分与相关靶点筛选

使用TCMSP、PubMed、中国知网以“金花葵”“Hibiscus manihot L”为关键词搜索化学成分。在ChemicalBook网站查询化合物CAS号，并输入PubChem数据库获取化合物2D结构文件sdf格式，利用Open Babel GUI软件转化为SMILES格式，在SwissADME数据库筛选活性成分（以胃肠吸收率为“high”，且Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge中至少有4项为“yes”为筛选条件），并整理成表格。使用SwissTargetPrediction 数据库（设置Probability > 0）和SEA数据库（设置P ≤ 0.01）进行潜在活性成分靶点预测。

1.6.2 疲劳相关靶点筛选

“fatigue”为疲劳对应的英文术语，登录GeneCards数据库后输入疾病名称，设置类别为“protein coding”，检索疲劳疾病的相关靶点。

1.6.3 韦恩图的制作

使用在线 Venny 2.1.0绘图工具通过导入金花葵活性成分靶点与疲劳靶点取交集，绘制韦恩图，得到交集作用靶点。

1.6.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络模型和“成分-靶点”网络构建

在STRING数据库中导入交集靶点，物种参数设定为智人“Homo Sapiens”，最小互作可信度分值（minimum required interaction score）设置为0.7，得到蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图和数据，下载tsv格式数据表，导入Cytoscape3.10.3软件进一步可视化处理，绘制PPI图，利用Cytohubba插件进行重要靶点分析，用MCODE插件进行靶点聚类分析。建立network和tape格式数据集，导入Cytoscape 3.10.3软件呈现成分与靶点的关系网络图，同时采用Network Analyzer模块进行拓扑结构解析，筛选出金花葵抗疲劳的核心活性成分。

1.6.5 京都基因与基因组百科全书通路及基因本体论功能富集分析

用DAVID数据库进行基因本体论（gene ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。选择基本参数物种“Homo Sapiens”，提取生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3组数据集，得出交集靶点富集的生物学通路，解析金花葵抗疲劳的潜在生物学机制。按P值升序排序，取前10条GO功能注释条目和前20条KEGG通路，导入微生信在线生物信息学分析平台进行可视化分析。

1.6.6 “成分-靶点-通路”网络构建

使用 Cytoscape 3.10.3软件，对筛选出的核心成分、重要靶点、重点通路进行网络化展示，构建“成分-靶点-通路”网络图。

1.6.7 分子对接

从UniProt数据库查找靶蛋白UniProt ID，再从PDB数据库下载蛋白三维晶体结构pdb格式文件。核心活性成分作为小分子配体，自PubChem数据库获取其3D结构sdf格式，并用Open Babel GUI软件将小分子转化为mol2格式，用Autodock软件进行检测和选择扭转键，作为配体保存为pdbqt格式。用PyMOL软件剔除靶蛋白结构内的水分子、无机盐及配体等组分，保存为pdb格式，再用Autodock软件对其进行加氢、计算Gasteiger电荷、确定刚性结构等操作，作为大分子受体保存为pdbqt格式。用Autodock软件将核心活性成分与靶蛋白进行半柔性对接，参数选择默认，设置对接次数50次，选择结合能最低的配对形式进行数据保存及可视化。用PyMOL软件进行结合位点的可视化操作，打开pdbqt文件，将背景修改为白色，通过find选项寻找结合的氢键，并将结合的氨基酸显示和标记，调整3D视图合适的视野和角度，保存图片。

1.7 统计学分析

所有实验结果以表示，使用 GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，采用箱线图四分位数法识别并剔除异常值。基于预设仅比较金花葵各剂量组与NS组的实验设计，为保证各指标统计方法的一致性与稳健性，统一采用Mann‑Whitney U 检验分别进行独立组间比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金花葵提取液抗疲劳效果

各组小鼠实验末期体重无明显差异（P > 0.05）；相比NS组，H组游泳时长显著增加（P < 0.05），M、H组小鼠血乳酸含量显著下降（P < 0.05），H组小鼠肌糖原含量显著升高（P < 0.05），各实验组小鼠肝糖原含量均显著升高（P < 0.05）。具体见图1。

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  图1 金花葵对小鼠体重、游泳时长和血清指标的影响

  Figure 1.Effects of Hibiscus manihot L. on body weight， exhaustive swimming time and serum biochemical indexes in mice

  注：与对照组相比，aP < 0.05。

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2.2 金花葵活性成分与靶点

通过数据库和文献检索得到金花葵活性物质381个，通过胃肠吸收率和类药性指标筛选后获得具有高类药性的潜在活性成分99个，其中96个成分共得到对应作用靶点1 036个（表1）。

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  表格1 金花葵活性成分

  Table 1.Active ingredients of Hibiscus manihot L.

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2.3 疾病靶点获取和韦恩图分析

从GeneCards数据库和OMIM数据库分别搜索得到8 885个和247个疲劳相关疾病靶点，取GeneCards结果中Relevance score降序排列前1 500个靶点与OMIM 靶点合并去重后，获得1 521个疾病靶点，取金花葵作用靶点与疲劳疾病靶点交集，共获得305个金花葵-疲劳相关靶点（图2）。

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  图2 金花葵作用靶点与疲劳疾病靶点韦恩图

  Figure 2.Venn diagram of action targets of Hibiscus manihot L. and fatigue-related targets

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2.4 PPI网络分析及成分-靶点图的构建

基于STRING数据库构建交集靶点PPI网络（图3-A），去除孤立的与其他蛋白没有联系的靶点，得到292个节点和2 337条边的网络图（图3-B）。用cytohubba插件对所有节点进行拓扑分析，取度值降序排列前10个靶点、接近中心性排序前10个靶点和中介中心性排序前10靶点，筛选出13个靶点为关联度最高的核心靶点进行分析（表2）。用MCODE插件对PPI网络进行聚类子网络分析，发现3个重要子网络，分别命名为cluster1、cluster2、cluster3（图3-C~E）。

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  图3 金花葵治疗疲劳靶点PPI图

  Figure 3.PPI network of fatigue-related therapeutic targets of Hibiscus manihot L.

  注：A. 基于STRING构建的原始PPI网络图；B.去除孤立靶点后的PPI网络图；C. MCODE分析结果聚类1；D. MCODE分析结果聚类2；E. MCODE分析结果聚类3。

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  表格2 核心靶点关联度参数

  Table 2.Correlation parameters of the core target

  注：EGFR.表皮生长因子受体；AKT1.蛋白激酶Bα；STAT3.信号转导与转录激活因子3；SRC.原癌基因酪氨酸蛋白激酶scr；IL-6.白细胞介素6；CTNNB1. β-连环蛋白1；HSP90AA1.热休克蛋白90αA1；TNF.肿瘤坏死因子；STAT1.信号转导与转录激活因子1；JUN. Jun原癌基因；GAPDH.甘油醛-3-磷酸脱氢酶；ESR1.雌激素受体1；CASP3.胱天蛋白酶3。

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金花葵“成分-靶点”网络共包含93个成分节点和305个靶点节点，对网络进行拓扑属性分析，按节点度值降序筛选出前15的活性成分为核心成分进行后续分析（表3和图4）。结果显示，金花葵抗疲劳的重要活性成分主要包括黄酮类物质、生物碱、氨基酸衍生物等。

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  表格3 金花葵抗疲劳核心成分信息

  Table 3.Information of core anti-fatigue ingredients in Hibiscus manihot L.

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  图4 金花葵抗疲劳成分-靶点图

  Figure 4.Component-target network of anti-fatigue ingredients from Hibiscus manihot L.

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2.5 GO和KEGG通路富集分析

将305个交集靶点数据导入DAVID数据库进行分析，GO功能注释分析得到BP条目982个，CC条目124个，MF条目244个。按照P值由小到大排序，将每组数据前10的条目进行可视化展示（图5-A）。KEGG通路富集分析共获取189条通路。按P值由小到大排序，选取前20条通路作气泡图（图5-B）。结果显示，金花葵抗疲劳作用主要涉及三大类：癌症发生发展的相关通路（如癌症相关通路、化学致癌作用-活性氧）；糖尿病及糖尿病并发症相关通路［如糖尿病性心脏病、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end products- receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信号通路］；与病毒感染和肝脏损伤密切相关的通路（如卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎）。其中癌症通路、卡波西肉瘤和乙肝病毒通路、糖尿病AGE-RAGE信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号等通路包含较多靶蛋白。

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  图5 GO功能注释及KEGG通路分析

  Figure 5.GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis

  注：A.GO 功能注释分析前10个条目可视化图；B.KEGG 通路富集分析前20条通路气泡图。

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对上述获得的3个核心网络簇分别进行GO和KEGG分析，结果显示：cluster1所涉及基因均与线粒体能量代谢过程中的电子链传递相关；而cluster2则主要涉及癌症相关通路、糖尿病并发症、乙肝感染等分子通路；cluster3和cluster2类似，还涉及卡波西肉瘤、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-AKT信号通路、JAK激酶（Janus kinase，JAK）-STAT信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路。结果与交集靶点的GO和KEGG通路富集结果大致相符。

2.6 成分-靶点-通路网络图构建

采用Cytoscape 3.10.3软件绘制“核心成分-靶点-通路”网络，包含15个核心成分、与疲劳相关的20条通路，以及相应的靶点（图6）。结果表明，金花葵核心成分主要通过作用于246个靶点蛋白调控20条相关通路，发挥抗疲劳的作用。

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  图6 核心成分-靶点-通路

  Figure 6.Core component-target-pathway network

  注：圆形代表靶点，菱形代表活性成分，正方形代表通路。

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2.7 分子对接结果

上述13个核心靶点中，EGFR、SRC、ESR1、AKT1、HSP90AA1、JUN 6个核心靶点与关键成分有对应关系。将此6个靶点蛋白分别与对应的关键成分进行分子对接，以进一步分析核心成分对靶点的潜在直接作用能力。使用AutoDock tools软件将6个核心靶点与相应关键成分进行分子对接，结果显示上述分子对结合能均小于0，具有较强的亲和力（表4）。将结合能小于-6 kcal/mol且相对最低的蛋白-小分子复合物，使用PyMOL软件可视化，以表征小分子与关键氨基酸的作用方式（图7）。

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  表格4 金花葵核心成分与核心靶点分子对接结果

  Table 4.Molecular docking results between core ingredients and core targets of Hibiscus manihot L.

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  图7 分子对接可视化图

  Figure 7.Visualization diagram of molecular docking

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3 讨论

基于金花葵丰富的活性成分及其潜在的抗疲劳作用价值，用小鼠负重游泳实验进行了初步观察验证。该模型属于检测生理性疲劳的诱发性疲劳模型，具有制作简单、成本低、重复性良好等特点，适合初步筛选抗疲劳物质^［5］。本研究结果发现，金花葵提取液能显著延长小鼠的负重游泳时长，同时提高动物的肝糖原、肌糖原储备量，降低运动后血液中乳酸水平，金花葵提取液具有良好的抗疲劳效果。研究还发现，在游泳时长及3项生化指标检测中，金花葵低、中剂量组抗疲劳效果不显著，虽呈现一定剂量依赖趋势，但未形成完整的剂量‑效应关系。本研究为预设药效验证加剂量梯度探索，所设置的浓度梯度区间未完全覆盖金花葵有效剂量窗口；该结果仅提示游泳、肌糖原指标下低、中剂量未达起效阈值，不影响高剂量下金花葵具有显著抗疲劳作用的核心结论。

中药的多糖、多酚、黄酮类、氨基酸等活性物质可通过提高糖原储存、减少乳酸堆积、富有抗氧化活性等不同途径发挥抗疲劳作用^［6，12］。金花葵的活性成分十分丰富，其中黄酮类物质，尤其金丝桃苷，不仅含量较高，并且被认为是其发挥药理作用的主要成分^［16］。但经口服用是药食同源食物的主要利用途径，其各种作用效果均受机体肠道吸收效率和分子转化等生理学过程的影响^［23］。本次实验筛选出的96个有作用靶点的活性成分中，根据成分与靶点蛋白相关联的度值进一步筛选出15个关键成分，以黄酮类物质为主，另外包括生物碱、氨基酸衍生物、香豆素类等，表明金花葵发挥上述抗疲劳作用的主要活性物质可能是黄酮类物质。

MCODE分析筛选出3个蛋白簇形成的子网络（cluster1、cluster2、cluster3），其中cluster1的节点全部由线粒体呼吸链的复合物亚基蛋白组成，而靶向这些蛋白的活性物质只有松柏醇1种。松柏醇是一种天然的萜类植物次生代谢产物，广泛存在于植物中，具有醇基和松柏酸基的结构，在植物中起到多种生理功能，如抗氧化、抗菌、抗逆境等。此外，松柏醇还具有镇静、抗焦虑、抗抑郁等药理学活性，因此在药物和香料行业具有重要的应用价值，实验室合成的松柏醇在动物体内外实验中显示出明显的抗炎镇痛效果，但目前关于松柏醇自身的生物学作用研究较少^［24］。

中药抗疲劳机制研究侧重“整体观”“辩证观”的思维，如一些疏肝理气类中药五味子、酸枣仁等均有一定的抗疲劳作用。由GO功能注释结果可知，金花葵抗疲劳机制与多维度生物学过程密切相关。BP层面，其或可通过调控线粒体电子传递、三磷酸腺苷合成、有氧呼吸过程改善缺氧状态下的能量代谢，同时参与胰岛素、雌激素受体通路、丝裂原活化蛋白激酶级联反应调控，协同缓解机体疲劳。CC层面，作用靶点集中于线粒体、质膜及受体复合物等，为能量合成与信号传导提供结构基础。MF方面，或通过影响还原型辅酶Ⅰ（NADH）脱氢酶等酶活性、各类受体活性及蛋白结合能力，从分子层面调控能量代谢与信号通路，多途径发挥抗疲劳作用。以上结果与目前认为的中药抗疲劳作用机制观点大致相符^［25］。

研究结果筛选出的13个关联度最高的核心靶点多数都与癌症发生发展、病毒感染、无氧酵解等生物过程密切相关，提示金花葵的抗疲劳作用可能通过上述途径实现。癌症相关通路中，HIF‑1通路可调控细胞缺氧适应与能量代谢^［26］，EGFR经PI3K‑AKT1通路、IL‑6经JAK/STAT3通路协同调控HIF‑1α，活性氧通路可缓解氧化应激损伤，共同改善缺氧与应激诱导的疲劳；IL‑6、TNF‑α可通过STAT3/STAT1与AKT1介导炎症、氧化应激及细胞凋亡^［27］；病毒感染与肝脏损伤相关通路中，PI3K-AKT信号通路调控能量代谢与糖原合成^［28］，肝脏保护相关通路则能够维持物质代谢平衡，减少感染及器官损伤导致的能量消耗与疲劳。上述通路或从代谢调控、氧化应激缓解、器官功能保护多维度协同，协同介导金花葵抗疲劳的通路网络。

将有相互映射关系的核心活性成分和核心靶点进行了分子对接分析，结果显示，所有配体-受体之间均有结合能力，其中SRC、AKT1、HSP90AA1 3个靶蛋白与对应的配体均有较好的结合活性。从成分层面分析，甲基山柰酚可强效结合AKT1、较好结合HSP90AA1；Z-甘氨酸-N-N琥珀酰亚胺酯强效结合HSP90AA1、较好结合SRC；白杨素与SRC结合能力最优，臭矢菜素C与AKT1结合能力最优。SRC为src基因编码的非受体酪氨酸激酶，作为信号枢纽调控基因转录、细胞凋亡、迁移等生物学过程，同时可介导葡萄糖摄取、糖酵解等代谢通路^［29］。AKT1是核心信号分子，调控细胞存活与代谢，激活后可促使细胞代谢由线粒体氧化磷酸化转向糖酵解^［30］。HSP90AA1为应激诱导型热休克蛋白，参与蛋白稳态维持，可协同HIF-1α、STAT1调控炎症与糖酵解过程，且其表达水平与机体疲劳程度显著相关^［31-32］。现有研究证实，AKT1是多种中药发挥抗疲劳作用的关键靶点^［33-36］，本研究也发现，金花葵黄酮类核心成分可与AKT1高度结合。结合本研究分子对接结果，推测金花葵中白杨素、臭矢菜素C、甲基山柰酚等黄酮类成分，或通过结合 / 调控AKT1、SRC、HSP90AA1靶点，参与能量代谢与氧化应激过程，进而潜在缓解机体疲劳。

本研究仍存在一定局限性。首先，体内抗疲劳药效评价仅采用小鼠负重游泳模型，且仅检测负重游泳时长和肝糖原、肌糖原、血乳酸等生化指标，评价体系较为单一，缺少氧化应激、炎症因子、线粒体功能等更深层次的分子指标验证，无法全面解析金花葵调控疲劳的多维度生理机制。其次，网络药理学与分子对接仅为计算机层面的虚拟预测分析，未开展细胞水平、分子蛋白层面实验对核心靶点、通路进行实验验证，成分‑靶点‑通路的因果关系仍有待进一步证实。此外，本研究仅探究金花葵水提物整体的抗疲劳活性，未分离单体活性成分开展剂量‑效应与机制验证，无法明确发挥药效的关键物质基础。后续研究可通过扩大评价指标体系、开展细胞与分子实验、分离单体成分等方式，进一步完善金花葵抗疲劳作用的机制研究。

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