目的 建立UPLC特征图谱及多指标成分含量测定方法，比较不同产地猪殃殃药材的质量差异。

方法 收集13批分别来源于河南、安徽、广西的猪殃殃药材，采用超高效液相色谱法（UPLC）建立特征图谱，并进行相似度评价。以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及芦丁为指标性成分，同步进行含量测定。运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对不同产地药材进行化学模式识别，筛选引起质量差异的关键标志物。

结果 建立了猪殃殃的UPLC特征图谱，共标定出9个共有峰，其中指认了新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及芦丁4个成分。PCA显示，13批不同产地样品的综合得分由高到低依次为：河南产地 > 安徽产地 > 广西产地。进一步通过OPLS-DA筛选出6个质量差异标志物，分别为峰9（芦丁）、峰4（隐绿原酸）、峰7、峰8、峰1（新绿原酸）及峰6。同时，对上述4个指标性成分进行含量测定，结果表明，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和芦丁的含量在不同产地间均存在显著差异。

结论 采用UPLC特征图谱联合多指标含量测定的方法，可全面、有效地评价不同产地猪殃殃药材的质量，为完善其质量控制标准提供参考。

猪殃殃别名为八仙草、锯子草、拉拉藤等，为茜草科植物猪殃殃（Galium aparine L.）的干燥全草，在《中国药典》1977年版^［1］及河北、湖北、四川、上海等地方标准中均有记载。猪殃殃作为一种传统中草药，主要分布在安徽、贵州、河北、河南、湖南等产地的山坡、旷野、田间、草地，含有挥发油^［2］、黄酮类^［3］、酚酸类^［4］、蒽醌类、萜类和甾体类及烷烃类等化合物成分^［5-7］，具有清热解毒、利尿消肿的功效，临床常用于治疗肿瘤、痢疾、乳腺炎、尿路感染、妇女闭经、创伤肿胀、胆病、骨病及遗精等^［8］。

目前，关于猪殃殃的质量分析研究相对有限，现有报道多聚焦于单一化学成分的测定。部分文献^［9-10］以绿原酸为指标成分建立含量测定方法，李建晨等^［11］则采用TLC法对猪殃殃药材进行定性鉴别。然而，单一指标成分的含量难以全面反映药材的整体质量，TLC法亦无法系统表征药材的整体化学成分。因此，开展猪殃殃质量控制的系统性研究具有重要的现实意义。近年来，通过构建特征图谱或指纹图谱联合高分辨质谱解析物质基础，已成为中药材质量评价体系建立的主流技术手段^［12-14］。基于此，本研究采用该技术模式对不同产地猪殃殃药材进行系统对比分析，旨在为猪殃殃的质量控制与评价提供更全面的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

Waters H-Class型高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；Thermo Q Exactive Focus Orbitrap型高分辨质谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；ME204E型万分之一天平和XP26型百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；Mili-Q Direct型超纯水系统（德国默克股份有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

绿原酸对照品（批号：110753-202018，纯度96.1%）和芦丁对照品（批号：100080-202012，纯度92.2%）购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18030107，纯度98.0%）；隐绿原酸对照品（成都乐美天医药科技有限公司，批号：DST210427-035；含量98.24%）；甲酸、磷酸和乙腈为色谱纯；其余试剂分析纯；水为超纯水。

本研究收集了13批不同产地的猪殃殃药材，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，均为茜草科植物猪殃殃（Galium aparine L.）的干燥全草，样品信息见表1。

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  表格1 猪殃殃的样品信息

  Table 1.Sample information of Galium aparine L.

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2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液

取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、芦丁对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL各含20 μg的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

采用超高效液相色谱（UPLC）法。色谱条件如下：色谱柱为Waters HSS T3柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~5 min，6% A；5~20 min，6%~21% A；20~20.1 min，21%~90% A；20.1~25 min，90% A）；检测波长为330 nm；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.3 特征图谱方法学验证

2.3.1 精密度试验

取同一份供试品溶液（编号：Z5），按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，以2号峰绿原酸为参照峰，计算得9个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次药材（编号：Z5），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定，以2号峰绿原酸为参照峰，计算得9个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液（编号：Z5），按“2.2”项下色谱条件，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h后进行测定，以2号峰绿原酸为参照峰，计算得9个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），结果表明供试品溶液在室温放置24 h稳定性良好。

2.4 特征图谱的建立

2.4.1 共有峰的标定

取13批猪殃殃样品，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将所得色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.0版，标定出9个共有峰。以分离度好、响应高且位置居中的2号峰（绿原酸）为参照峰。具体见图1和图2。

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  图1 13批猪殃殃药材UPLC特征图谱共有峰

  Figure 1.Overlay chart of characteristic peaks of 13 batches of Galium aparine L.

  注：R为对照图谱。

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  图2 猪殃殃样品共有峰对照品归属图

  Figure 2.Attribution map of common peak control products of Galium aparine L.

  注：A. 对照品；B. 样品；1. 新绿原酸；2. 绿原酸（参照峰）；4. 隐绿原酸；9. 芦丁。

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2.4.2 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.0版对13批猪殃殃药材的UPLC特征图谱进行数据处理。以平均数法生成对照特征图谱，设置时间窗口为0.1，采用自动匹配模式，计算各批次图谱与对照图谱的相似度。结果显示，13批药材的相似度均大于0.98，表明同一药材不同批次间的化学成分组成基本一致。相似度计算结果见表2。

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  表格2 猪殃殃药材样品相似度评价结果

  Table 2.Similarity evaluation results of Galium aparine L.

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2.4.3 主成分分析

以13批药材样品中9个共有峰的相对峰面积为变量，进行主成分分析（principal component analysis，PCA），计算相关矩阵的特征值及方差贡献率，结果见表3。分析结果共提取了2个主成分（特征值 ＞ 1），累计方差贡献率达90.850%。由表4的初始因子载荷矩阵结果可知，权重值占比较大（＞ 0.8）的分别为峰1（新绿原酸）、峰3、峰5、峰7、峰8及峰9（芦丁）。结合上述分析结果，对相关数据进行标准化处理，并计算各样品之间的主成分得分，结果见表5和图3。结果表明得分按产地从高到低排序分别为：河南产地 ＞ 安徽产地 ＞ 广西产地。

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  表格3 主成分特征值及贡献率

  Table 3.Contribution rate of characteristic roots and principal components

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  表格4 主要因子载荷矩阵

  Table 4.Initial factor loading matrix of each factor

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  表格5 主成分得分及排名

  Table 5.Initial factor loading matrix of each factor

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  图3 不同产地猪殃殃药材PCA得分图

  Figure 3.PCA score plot of Galium aparine L. from different producing areas

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2.4.4 偏最小二乘判别分析

在PCA的基础上，建立偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）监督模型，以进一步筛选不同产地猪殃殃药材的差异标志物。模型评价参数如下：R²X（cum）=0.988，R²Y（cum）=0.961，Q²（cum）=0.901，均大于0.5，表明所建模型稳定可靠。如图4所示，13批猪殃殃样品按产地明显分为3组，该结果与PCA分析结果一致，进一步证实了不同产地猪殃殃药材化学成分含量存在差异。以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值＞1.0为筛选标准，从9个共有峰中筛选出6个差异标志物（图5），其VIP值排序依次为：峰9（芦丁） > 峰4（隐绿原酸） > 峰7 > 峰8 > 峰1（新绿原酸） > 峰6。结果表明，上述6个成分为引起不同产地猪殃殃药材质量差异的主要标志物。

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  图4 不同产地猪殃殃药材OPLS-DA得分图

  Figure 4.OPLS-DA score plot of Galium aparine L. from different producing areas

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  图5 不同产地猪殃殃药材OPLS-DA的VIP值图

  Figure 5.OPLS-DA VIP value plot of Galium aparine L. from different producing areas

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2.5 多指标成分含量测定

2.5.1 线性关系考察

分别精密量取含新绿原酸浓度为115.93 μg/mL、绿原酸浓度为330.97 μg/mL、隐绿原酸浓度为238.14 μg/mL、芦丁浓度为110.58 μg/mL的混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，按“2.2”项下色谱条件进样分析，以待测成分浓度（X，μg/mL）与峰面积（Y）拟合标准曲线，线性关系考察结果见表6。

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  表格6 线性关系考察结果

  Table 6.Results of linear relationship investigation

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2.5.2 精密度试验

取同一混合对照品溶液（新绿原酸浓度为57.96 μg/mL、绿原酸浓度为165.498 μg/mL、隐绿原酸浓度为119.07 μg/mL、芦丁浓度为55.29 μg/mL），按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁峰面积的RSD分别为0.21%、0.37%、0.28%、0.41%（n=6），均小于3%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验

取同一批样品（编号：Z5），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁的平均含量分别为0.498、3.916、0.989、0.432 mg/g，RSD分别为1.18%、0.95%、1.23%、1.06%（n=6），均小于3%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号：Z5），于室温放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁峰面积的RSD分别为0.85%、1.03%、0.97%、0.58%（n=6），均小于3%，结果表明供试品溶液室温放置24 h稳定性良好。

2.5.5 加样回收试验

精密称取已知含量的样品0.5 g（编号：Z5）6份，分别加入一定量对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样分析，并计算回收率。结果得到新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁的平均回收率分别为97.68%、98.82%、100.87%、98.33%，RSD分别为2.78%、2.12%、2.57%、2.41%（n=6），均小于3%，结果表明方法准确性良好。

2.5.6 样品的含量测定

取13批不同产地的猪殃殃药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计算4个指标成分的含量，结果见表7。结果显示，不同批次间各成分含量均存在一定差异。以RSD评价其离散程度，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和芦丁的RSD分别为59.86%、58.35%、60.07%和40.75%。

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  表格7 13批猪殃殃含量测定结果（mg/g，n=3）

  Table 7.Results of the content determination of 13 batches of Galium aparine L. (mg/g, n=3)

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2.5.7 不同产地猪殃殃药材指标成分含量差异分析

以4种指标成分含量为检验变量，产地为分组变量，采用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并以Tukey's多重比较检验进行两两比较，显著性水平α=0.05，结果见图6。统计分析表明：河南与安徽产地间，新绿原酸和芦丁含量存在极显著差异（P < 0.01）；河南与广西产地间，绿原酸和芦丁含量存在极显著差异（P < 0.01）；隐绿原酸在3个产地两两之间均存在极显著差异（P < 0.01）。综上，不同产地猪殃殃药材中4种指标成分含量具有显著统计学差异，表明产地因素对化学成分积累有重要影响。

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  图6 不同产地猪殃殃药材中4种成分含量的统计学分析结果

  Figure 6.Statistical analysis results of the contents of 4 components in Galium aparine L. from different producing areas

  注：aP < 0.01。

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3 讨论

本研究在建立特征图谱及含量测定方法时，系统考察了不同流动相体系（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%乙酸水），最终选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为洗脱系统，该条件下各色谱峰分离度良好、峰形最优。

目前，猪殃殃质量分析多限于单一成分测定或TLC鉴别。本研究首次将UPLC特征图谱系统应用于猪殃殃药材，成功指认新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及芦丁4个特征成分。上述成分具有抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤等明确药理活性，可能是猪殃殃清热解毒、利尿消肿功效的主要物质基础，作为指标成分具有科学合理性^［15-17］。

本研究首次将PCA与OPLS-DA引入猪殃殃质量评价。PCA显示13批药材按产地明显聚类，综合得分排序：河南 ＞ 安徽 ＞ 广西；OPLS-DA筛选出6个质量差异标志物（芦丁、隐绿原酸、峰7、峰8、新绿原酸、峰6），为揭示产地间质量差异提供了数据支撑。同时，本研究实现了特征图谱与多指标含量测定的协同应用，经方差分析验证产地间差异具有极显著统计学意义，形成了“图谱-含量-统计”三位一体的系统评价模式。

本方法操作简便、重复性好、灵敏度高，适用于不同产地猪殃殃药材的快速鉴别与质量比较。河南产地4种指标成分含量均显著高于安徽与广西产地，为优质产地筛选及产业化开发提供了依据。所建立的技术路线具有较强的普适性，可推广应用于其他中药材的质量评价研究。

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