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目的 通过网络药理学与分子对接、分子动力学模拟，探索猪苓汤干预糖尿病肾病（DKD）的核心活性成分、关键靶点及调控机制。
方法 利用TCMSP、BATMAN-TCM 2.0及SwissTargetPrediction数据库筛选猪苓汤活性成分及靶点；从GeneCards、TTD及DrugBank数据库收集DKD相关靶点，获取交集靶点；构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）及“成分-靶点”网络，筛选关键靶点和关键成分；经基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，筛选关键通路；构建“关键成分-关键靶点-关键通路”网络，采用分子对接、分子动力学模拟分析核心成分与核心靶点结合活性。
结果 筛选得到polyporoid C、猪苓酸C、啤酒甾醇和猪苓酮E 4种核心成分及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和蛋白激酶C-α（PRKCA）4个核心靶点；mTOR与核心成分结合能最低、活性最优，分子对接和分子动力学模拟显示复合物稳定；polyporoid C可靶向全部核心靶点，聚焦磷脂酰肌醇3-激酶/Akt激酶（PI3K/Akt）主通路。
结论 核心成分与核心靶点结合具备一定的结构稳定性，猪苓汤通过调控相关通路发挥DKD干预作用。polyporoid C的多靶点特性及mTOR的结合优势突出，后续可围绕“polyporoid C-核心靶点-PI3K/Akt”主通路级联调控轴开展深入研究。
糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常见微血管并发症，已成为全球终末期肾脏病的主要致病因素，防控形势严峻［1］。据统计，约40%糖尿病患者会进展为DKD，2021年全球患病人数已达1.076亿，相关死亡人数超47.7万［2］。DKD发病机制复杂，临床以持续白蛋白尿、肾小球滤过率进行性下降为主要特征；起病隐匿，出现明显症状时肾损伤多已不可逆，不仅增加患者风险，还会带来沉重的家庭与社会医疗负担［1］。
当前DKD治疗以综合干预为主，包括控糖、血压管理、生活方式干预及心肾保护药物的联合应用。血管紧张素转换酶抑制剂与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物可减轻肾小球高压、延缓肾功能减退［3］。钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂能显著降低肾衰竭及肾脏相关死亡风险，且其保护效应独立于降糖作用；胰高血糖素样肽-1受体激动剂也显示出肾脏获益［4］。临床常用DKD干预药物虽然能够缓解部分症状，但存在靶点单一、长期应用受限等问题，难以满足临床需求。
中医药具有多靶点、整体调节的特点，在改善症状、保护肾功能方面具有独特优势［5］。猪苓汤由猪苓、茯苓、泽泻、滑石、阿胶5味药材配伍而成，具有利水渗湿、清热养阴之效，常用于水热互结、阴虚内热所引发的小便不利等病症，临床研究亦证实其可改善DKD症状并调节肾脏代谢紊乱［6］。方中药味的活性成分具有利尿、抗炎、降糖及肾保护等作用，如猪苓含甾体类成分与多糖，可调节电解质平衡并调节免疫［7-8］；茯苓具有抗炎［9］、利尿活性；泽泻三萜可利尿、调糖脂，并有抗炎作用［10］；滑石可吸附毒素、辅助通淋；阿胶富含胶原蛋白与多肽，具有补血、抗氧化、抗炎效果［11］。多种成分通过协同调节水盐代谢、抑制炎症与氧化应激等，构成猪苓汤防治DKD的物质基础。
网络药理学、分子对接与分子动力学模拟是现代药物研究的重要方法，本研究借助上述方法，系统预测猪苓汤干预DKD的活性成分、核心靶点与信号通路，探析其潜在作用机制，旨在为DKD临床防治及猪苓汤的现代化开发提供参考。
1 资料与方法
1.1 猪苓汤活性成分的筛选
借助TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）［12］，对猪苓汤中猪苓、茯苓和泽泻的化学成分进行检索。以口服生物利用度 ≥ 30%［13］、类药性 ≥ 0.18［12］作为标准筛选其中的活性成分。
针对未被TCMSP数据库收录的滑石、阿胶，通过BATMAN-TCM 2.0数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）［14］检索，使用数据库默认参数检索有效成分。此外，进一步结合已发表文献［15-17］，对猪苓汤的活性成分进行补充。随后，借助PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［18］查询这些化合物的SMILES编号，通过SwissADME数据库（https://www.swissadme.ch/）［19］，以胃肠道吸收为高（high），且在Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5项药物相似性规则中至少满足2项为筛选标准［20］，筛选具有优良特性的活性成分。
1.2 猪苓汤活性成分靶点和DKD靶点的获取
有效成分的结构信息均来自PubChem数据库，并且以是PubChem CID（PubChem component ID）号作为统一标识。通过SwissTargetPrediction平台（http://www.swisstarget prediction.ch/）［21］对有效成分的潜在靶点进行预测，并筛选出物种为“Homo sapiens”且“probability > 0”的靶点。最后将有效成分对应的靶点统一转化为UniProt（https://www.uniprot.org/）［22］基因名。
以“diabetic kidney disease” 和 “diabetic nephropathy”为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）［23］、TTD数据库（Therapeutic Target Database，http://db.idrblab.net/ttd/）［24］和DrugBank 6.0数据库（https://go.drugbank.com/）［25］中进行检索，将结果汇总去重作为DKD的潜在靶点。
1.3 猪苓汤治疗DKD的潜在靶点获取
整合预测的猪苓汤有效成分作用靶点，与从疾病数据库中获取的DKD疾病靶点，导入微生信在线分析平台（https://www.bioinformatics.com.cn），绘制韦恩图，得到交集靶点，作为猪苓汤干预DKD的潜在靶点。
1.4 药物-成分-靶点网络的构建和关键成分筛选
利用Cytoscape 3.10.4软件［26］构建药物-成分-靶点网络。设定关键节点筛选标准：介数中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）与度值（degree）均高于相应平均数阈值［27］。将同时满足上述指标的有效成分初步筛选为猪苓汤干预DKD的关键成分。
1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
通过STRING 12.0数据库（https://string-db.org/）［28］构建交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。参数设定物种为“Homo sapiens”，并将最低相互作用评分阈值调整为中等置信度（0.400）。随后进一步导入Cytoscape 3.10.4软件进行可视化分析。设定介数中心性、接近中心性、度值三重筛选标准（各指标阈值均高于对应平均值），筛选得到的靶点可认为是猪苓汤发挥抗DKD作用的潜在关键靶点。
1.6 基因本体功能和京都基因与基因组合百科全书通路富集分析
将交集靶点导入Metascape分析平台（http://www.metascape.org/）［29］，分别开展基因本体（Gene Ontology，GO）功能与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。其中，GO功能富集分析涵盖生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及细胞组分（cellular component，CC）分析。选取校正后P值最小的前10条通路，作为猪苓汤干预DKD的潜在关键通路。
1.7 关键成分-关键靶点-关键通路网络构建
将得到的潜在关键成分、关键靶点与关键通路导入Cytoscape 3.10.4软件，构建关键成分-关键靶点-关键通路网络。计算网络节点度值、介数中心性等核心指标，明确各节点间的相互作用强度。
1.8 分子对接
基于关键成分-关键靶点-关键通路网络，选取度值排名前4的活性成分与靶点蛋白进行分子对接。分子对接过程中未限定特定结合口袋，以蛋白质整体结构为对接区域，全面预测配体与靶蛋白的潜在结合模式。通过RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）［30］检索靶点蛋白的X射线晶体学结构，优先下载分辨率最优的蛋白质三维结构文件，从PubChem数据库获取4种核心成分的SDF格式结构文件，采用OpenBabel 2.3.2软件［31］转化为Mol2格式。然后对蛋白质和小分子成分分别预处理：用PyMOL 3.0.3软件去除蛋白质中的配体与水分子，通过MGLTools 1.5.7［32］为二者补充氢原子，针对小分子配体进一步检测扭转键，完成后将蛋白质与小分子均输出为pdbqt格式，以适配对接计算需求。
利用AutoDock Vina 1.1.2软件［33］开展分子对接，设置每组对接次数为9次，保留各成分-靶点组合的最优对接数据。最后，采用PyMOL 3.0.3和Discovery Studio软件对分子对接获得的靶蛋白-小分子配体复合物结构进行可视化。
1.9 分子动力学模拟
使用GROMACS （2025.3）软件［34］，对分子对接筛选获得的最优复合物构象进行100 ns的分子动力学模拟。模拟体系置于周期性边界立方盒中，采用AMBER14SB力场［35］，以TIP3P水模型［36］进行溶剂化。小分子拓扑文件由Sobtop软件［37］生成，并添加离子至生理浓度（150 mol/L NaCl）。模拟先采用共轭梯度算法进行500步能量最小化［收敛容差100.0 kJ/（mol·nm），步长0.01 nm］，随后依次进行100 ps（时间步长1 fs）限制性动力学模拟和100 ns（时间步长2 fs）的正式模拟。通过V-rescale控温（时间常数0.2 ps）维持在298.15 K，C-rescale法（时间常数0.5 ps/2.0 ps）将体系压力稳定至1.0 bar。采用LINCS约束氢键，PME处理长程静电（截断半径1.0 nm），Verlet截断处理范德华相互作用（截断半径1.0 nm），并启用能量和压力色散校正。模拟过程中移除体系质心运动，正式模拟阶段对蛋白-配体复合物进行角动量移除和独立温控耦合。
分别计算体系的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）、均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）、回转半径（radius of gyration，Rg）、溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）及氢键数量等关键参数。基于RMSD与Rg构建二维及三维自由能地貌图（free energy landscape，FEL），以评价复合物构象稳定性。
2 结果
2.1 猪苓汤活性成分
检索猪苓汤各药材的有效成分，得到猪苓13个、茯苓15个、泽泻9个、滑石2个、阿胶15个，去重后共获得51个有效成分，猪苓汤活性成分见表1。
2.2 猪苓汤活性成分靶点和DKD疾病靶点
对猪苓汤各中药的活性成分预测作用靶点，得到猪苓326个、茯苓284个、泽泻316个、滑石114个、阿胶75个靶点。经过去重处理，最终确定有效成分潜在靶点共611个。整合GeneCards、TTD和DrugBank结果，最终得到2 325个DKD相关疾病靶点。
2.3 猪苓汤干预DKD的潜在靶点
将猪苓汤的611个靶点基因与DKD的2 325个靶点基因进行交集处理（图1），共获得205个交集靶点，作为猪苓汤干预DKD的潜在靶点。
2.4 药物-成分-交集靶点网络和关键成分筛选
猪苓汤干预DKD的药物-成分-交集靶点网络见图2。其中，橙色正六边形节点代表猪苓汤的组成药物，圆形节点代表潜在活性成分，浅紫色矩形节点代表共有成分，黄色矩形节点代表猪苓汤干预DKD的潜在靶点。设定关键节点筛选标准：介数中心性 ≥ 0.028 584 823、接近中心性 ≥ 0.329 053 918、度值 ≥ 23.294 117 65，将同时满足上述指标的有效成分作为猪苓汤干预DKD的潜在关键成分，见表2。
2.5 PPI网络和关键靶点
将筛选得到的205个交集靶点开展PPI分析，PPI网络图见图3。以介数中心性 ≥ 0.005 309 362、接近中心性 ≥ 0.494 000 089、度值 ≥ 61.333 333 33（均高于对应平均数）为阈值筛选靶点，作为猪苓汤干预DKD的潜在关键靶点。潜在关键靶点按照度值由大到小排列，结果见表3。
2.6 GO功能富集分析
对205个交集靶点进行GO功能富集分析，共产生2 614个条目，包括BP条目2 253个、CC条目129个、MF条目232个，BP条目主要富集于激素刺激响应、细胞迁移正调控、酶联受体信号通路及蛋白磷酸化等过程；CC条目主要涉及受体复合物、膜微结构、粘着斑及蛋白激酶复合物等细胞组分；MF条目集中在蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性及激酶结合等分子功能。按校正后的P值从小到大排列，分别取前10个显著条目进行可视化，结果见图4。
2.7 KEGG通路富集分析
对205个交集靶点进行KEGG通路富集，共获得217条通路。以校正后P值由小到大排序，将前20条通路进行可视化，结果见图5。选取前10条通路作为猪苓汤干预DKD的潜在关键通路。KEGG富集分析显示，猪苓汤干预DKD的靶点主要富集于癌症通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、癌症中的蛋白聚糖等信号通路，其中以癌症通路（hsa05200）富集最为显著，部分靶点涉及乙型肝炎等通路。其中关于DKD的通路可能为AGE-RAGE、PI3K/Akt、胰岛素抵抗、低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1）等。
2.8 关键成分-关键靶点-关键通路网络
猪苓汤干预DKD的“关键成分-关键靶点-关键通路”网络见图6。将所有节点依据度值降序排列，筛选度值前10位的潜在关键靶点、关键成分，结果见表4和表5。排序结果有助于进一步识别猪苓汤干预DKD的潜在核心靶点及调控路径。
2.9 分子对接验证
基于“关键成分-关键靶点-关键通路”网络，分别筛选度值排名前4的节点作为潜在核心成分与核心靶点。随后将4种潜在核心成分（polyporoid C、猪苓酸C、啤酒甾醇、猪苓酮E），分别与4个潜在核心靶蛋白（PIK3CA：PDB 7L1C；MAPK1：PDB 2Y9Q；PRKCA：PDB 4DNL；mTOR：PDB 4DRI）开展分子对接验证。对接结果显示，所有化合物与对应靶点的结合能均低于-5 kcal/mol，提示具有较强的亲和力［38］，见表6。其中，mTOR与4个成分的结合能最低，表现出更为显著的结合能力。对mTOR与4个关键成分对接结果进行可视化，结果见图7。对接结果显示，各潜在核心成分与核心靶点均可形成稳定结合构象，可能在猪苓汤干预DKD的过程中发挥重要作用。
2.10 分子动力学模拟
选择分子对接中表现出最强的结合力的mTOR-啤酒甾醇进行分子动力学模拟，并对结果进行分析，见图8。RMSD是构象稳定性的核心评价指标，结果显示复合物体系在30 ns后趋于平衡，最终在0.25 nm附近小幅波动，表明小分子与靶蛋白结合稳定配体未发生明显解离（图8-A）。Rg可用于反映蛋白质整体构象的改变程度，也可用于表征其内部结构的致密性。如图所示（图8-B），Rg始终维持在1.36 ~ 1.38 nm，无显著上升趋势，X、Y、Z三轴方向Rg分别稳定在1.18、1.12、1.05 nm左右，说明蛋白结构紧凑，未出现解折叠或结构松散现象，三维构象保持良好。RMSF可以表示蛋白质中氨基酸残基的柔性大小。分析显示（图8-C），复合物的RMSF值相对较低（大多在0.23 nm以下），因此其灵活性较低，稳定性较高，SASA曲线整体平稳，表明蛋白表面溶剂暴露面积无明显变化，说明配体对蛋白结构影响较小（图8-D）。氢键数量统计（图8-E）显示，配体与蛋白在模拟全程氢键数量为0 ~ 4个，多数情况下维持1个，证实二者存在良好氢键相互作用。
以Rg和RMSD为坐标构建FEL，见图9。结果表明，复合物在特定Rg（1.36 ~ 1.37 nm）与RMSD（0.24 ~ 0.25 nm）范围内存在全局自由能最小值区域（深蓝色洼池），表明此构象下体系具备最优热力学稳定性。分子动力学模拟结果显示mTOR-啤酒甾醇复合物构象稳定。
3 讨论
多年来，DKD发病率下降及患者预后改善，主要得益于糖尿病整体管理水平的进步。现阶段临床用于DKD的常规治疗手段存在作用靶点局限、远期应用耐受性不佳等短板，远不能满足临床个体化、长期化的治疗需求。因此，探索安全性高、疗效确切且不良反应少的药物，是一种科学且符合临床需求的策略。
猪苓汤对泌尿系统疾病疗效显著，在DKD干预中亦展现出良好应用前景，但其内在药理机制尚未阐明。在猪苓汤干预DKD的关键成分-关键靶点-关键通路网络中，本研究发现了polyporoid C、猪苓酸C、啤酒甾醇、猪苓酮E可能是猪苓汤干预DKD的核心成分。polyporoid C是一种从猪苓中分离得到的麦角甾类成分，具有抗炎作用，可抑制佛波酯诱导的炎症及小鼠疼痛［15］。猪苓酮E也属于麦角甾类成分，其具有抗肿瘤活性，对小鼠白血病L1210细胞有明显的细胞毒性作用［39］。近年来麦角甾类化合物研究进展显著，其药理作用主要包括抗炎、代谢调节与器官保护，多通过调控氧化应激、炎症干预及细胞代谢发挥作用［40］。polyporoid C与猪苓酮E可能存在类似作用机制，具体仍需深入探究。啤酒甾醇是一种最初从酿酒酵母中分离得到的麦角甾型真菌代谢物，具有良好的抗炎活性，能够抑制丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1（mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB/activator protein-1，MAPK/NF-κB/AP-1）信号通路并激活核因子 E2 相关因子 2 /血红素氧合酶-1（nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）信号级联反应，从而减轻脂多糖诱导的炎症反应［41］。猪苓酸C是从茯苓菌核中分离得到的羊毛甾烷型三萜类化合物，可通过阻断AP-1信号通路、下调诱导型一氧化氮合酶的表达，从而抑制NO的生成，发挥抗炎作用［42］。由上推测，猪苓汤可能通过上述四个潜在核心成分对DKD发挥干预作用。
PIK3CA、MAPK1、PRKCA、mTOR可能是猪苓汤干预DKD的核心靶点。PIK3CA编码PI3Kα催化亚基，可激活Akt/mTOR轴，调控细胞生长与代谢。其异常激活是狼疮性肾炎、多囊肾病、DKD等肾病的共性致病因素，与足细胞损伤、肾小球硬化相关，同时糖尿病高糖微环境可能会紊乱PIK3CA的表达水平［43-44］。MAPK1为MAPK通路关键分子，研究发现DKD中高糖环境可使MAPK1表达增加，同时下调磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-2（phosphofurin acidic cluster sorting protein-2，PACS-2），破坏线粒体-内质网结构、引发线粒体功能异常，甚至加重肾小管损伤与间质纤维化。而抑制MAPK1和上调PACS-2可改善肾组织病理损伤，发挥肾保护作用［45］。PRKCA编码PKCα，参与细胞增殖、凋亡与炎症调控。在DKD病变中，高糖介导 PKCα 过度激活，促使活性氧大量生成，驱动肾小球持续损伤［46］。mTOR作为重要丝氨酸/苏氨酸激酶，结合不同的亚基可分别构成mTOR复合物1（mTORC1）与mTOR复合物2（mTORC2）。高糖微环境可过度激活 mTORC1、阻断细胞自噬进程，造成受损蛋白及细胞器蓄积，最终推动肾间质纤维化进展［47-48］。这4类靶点深度参与DKD病变过程，为DKD靶向干预提供了可靠的潜在靶点。
KEGG富集分析显示，癌症通路、PI3K/Akt、AGE-RAGE及HIF-1等通路参与猪苓汤对DKD的调控，其中PI3K/Akt通路与蛋白尿、肾功能及足细胞凋亡密切相关。通路过度激活会造成系膜增生、足细胞损伤；通路活性不足则削弱细胞修复能力，两种失衡均会加重肾脏硬化与间质纤维化。已有体内外实验证实，中药活性物质可通过矫正该通路磷酸化水平，修复足细胞损伤、降低尿白蛋白，改善肾脏组织病理损伤［49］。结合分子对接和分子动力学模拟结果，猪苓汤活性组分可结合 PIK3CA、mTOR等核心靶点，协同调控PI3K/Akt通路，以此发挥肾脏保护效应。
值得注意的是，4个核心成分中，polyporoid C可同时调控4个核心靶点，为DKD靶向候选新药潜力成分。4个核心靶点共同汇聚于PI3K/Akt通路、HIF-1通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路和癌症通路，4通路间存在明确的层级互作关系。经EGFR酪氨酸激酶抑制剂抑制 EGFR活性后，细胞可通过旁路代偿机制，持续激活其下游的PI3K/Akt/mTOR等效应分子，导致耐药现象［50］；PI3K/Akt作为核心枢纽，可调控HIF-1α的蛋白稳定性与转录活性，参与缺氧应答及血管异常等病理过程［51］；上述通路的异常信号最终汇聚于癌症相关通路。PI3K/Akt通路为核心主通路，是polyporoid C发挥多靶点协同的关键枢纽。后续可围绕“polyporoid C-核心靶点-PI3K/Akt”主通路级联调控轴开展深入实验研究。
本研究还存在一定局限性：仅依靠数据库与文献筛选猪苓汤活性成分，未通过液质技术鉴定水煎液真实组分；数据库成分来源于单味药材，共煎后部分成分易降解、溶出不足，仅少数成分稳定存在；加之网络药理学存在数据、算法层面的预测偏差，相关靶点通路仅为理论推测。后续需结合汤剂成分检测、细胞与动物实验及代谢组学进一步验证，完善作用机制以支撑临床研究。
综上，本研究表明，猪苓汤干预DKD的潜在核心成分为polyporoid C、猪苓酸 C、啤酒甾醇和猪苓酮E，潜在核心靶点为PIK3CA、MAPK1、PRKCA及mTOR，其中mTOR结合活性最强。猪苓汤可通过多成分协同作用于多靶点，调控PI3K/Akt等通路发挥肾保护作用，而polyporoid C可同时调控4个核心靶点，并汇集于PI3K/Akt为主的通路，提示后续能够以“polyporoid C-核心靶点-PI3K/Akt”主通路级联调控为主要研究方向开展研究。
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