目的 建立双波长HPLC柱前衍生化方法同时测定盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂中盐酸氮䓬斯汀与依地酸二钠的含量。

方法 色谱柱为Waters XTerra RP₁₈柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5，含10 mmol/L四丁基溴化铵），梯度洗脱；柱温为30 ℃；检测波长分别为289 nm（盐酸氮䓬斯汀）和254 nm（依地酸二钠）；流速为1.0 mL/min；进样体积为20 µL。

结果 盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠分别在10.11 ~ 202.19 μg/mL、5.47 ~ 109.53 μg/mL范围内，浓度与峰面积的线性关系良好（r ≥ 0.999 9）；平均回收率分别为99.3%和99.7%，RSD均小于0.8%（n = 9）；定量限分别为0.40、0.22 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%（n = 6）。

结论 该方法操作简便，重复性和准确度良好，可以同时测定盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂中盐酸氮䓬斯汀与依地酸二钠的含量。

盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂是第二代选择性H₁受体拮抗鼻用制剂，具有强效抗组胺与稳定肥大细胞的双重作用^［1］，且中枢嗜睡不良反应轻微，是治疗过敏性鼻炎的一线药物。依地酸二钠是药物制剂中常用的螯合剂，用于掩蔽杂质金属离子，但其对人体钙、镁等金属离子代谢的不良影响可能导致电解质紊乱，且高浓度依地酸二钠对鼻腔黏膜存在刺激。《中国药典》2025年版四部^［2］规定药用辅料应满足药品安全性和有效性的要求，并进行相应的质量控制。制剂中的依地酸二钠是否按照处方剂量进行合理添加，需要建立准确便捷的方法来测定。目前常用的依地酸二钠含量测定方法有滴定法和HPLC法。滴定法需要加入一定量有机溶剂掩蔽干扰^［3］，对环境及检验人员健康不利。HPLC法^［4-14］大多以硫酸铜或氯化铁为衍生化试剂，与依地酸二钠发生络合反应，生成具有紫外吸收的络合物，用含有离子对试剂的流动相进行分离测定。但目前尚未见到采用1个色谱系统同时测定制剂主成分与依地酸二钠含量的研究报道。本研究采用双波长HPLC柱前衍生化方法同时测定盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂中的盐酸氮䓬斯汀与依地酸二钠的含量，优化检测方法，提升检测效率，对该品种质量标准的完善具有重要的参考价值，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（包括四元泵，二极管阵列检测器及变色龙7.0软件，美国赛默飞公司）；SECURA225D-1CN电子天平（德国赛多利斯公司，精度0.01 mg）。

1.2 主要药品与试剂

盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂（昆明源瑞制药公司，批号：20241201、20241202、20241203，规格：10 mL∶10 mg）；盐酸氮䓬斯汀（批号：100604-202203，纯度99.9%）和依地酸二钠（批号：101310-202401，纯度90.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；四丁基溴化铵、冰醋酸、醋酸钠、硫酸铜均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XTerra RP₁₈柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-醋酸-醋酸钠缓冲液（取醋酸钠18 g，加冰醋酸9.8 mL及四丁基溴化铵3.2 g，用水稀释至1 000 mL，调节pH至4.5，含10 mmol/L四丁基溴化铵）（B），梯度洗脱（0 ~ 3.5 min，97% B，3.6 ~ 9.5 min，60% B，9.6 ~ 17 min，97% B）；柱温：30 ℃；检测波长：289 nm（盐酸氮䓬斯汀）、254 nm（依地酸二钠）；流速：1.0 mL/min；进样体积：20 µL。

2.2 溶液制备

2.2.1 衍生化试剂

称取硫酸铜粉末约100 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，质量浓度约为1 mg/mL，作为衍生化试剂。

2.2.2 混合对照品溶液

分别取盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠对照品适量，精密称定，加乙腈或水适量溶解，加水稀释至刻度，制成质量浓度约为1 mg/mL的盐酸氮䓬斯汀对照品贮备液和0.5 mg/mL的依地酸二钠对照品贮备液。精密量取对照品贮备液各1 mL，置同一20 mL量瓶中，加入衍生化试剂1 mL，加水稀释至刻度，用0.45 µm滤膜滤过，取续滤液即得质量浓度分别为50.549 4、27.381 8 µg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液

精密量取盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂样品1 mL，置20 mL量瓶中，加入衍生化试剂1 mL，加水稀释至刻度，用0.45 µm滤膜滤过，取续滤液即为供试品溶液。

2.2.4 空白溶剂

超纯水。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别取空白溶剂和“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各20 µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处有相应色谱峰出现，空白溶剂无干扰，表明方法专属性良好。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure1.HPLC chromatograms

  注：A. 空白溶剂（254 nm）；B. 混合对照品溶液（254 nm）；C. 供试品溶液（254 nm）；D. 空白溶剂（289 nm）；E. 混合对照品溶液（289 nm）；F. 供试品溶液（289 nm）；1. 依地酸二钠；2. 盐酸氮䓬斯汀。

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2.3.2 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下对照品贮备液1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、2.0 mL，置100、50、25、20、10、10 mL量瓶中，各加入衍生化试剂1 mL，加水稀释至刻度，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2. 1”项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X，µg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠的回归方程分别为Y = 21.554 7 X + 13.583 5、Y = 10.054 9 X + 1.788 8，r分别为0.999 9、1.000 0，线性范围分别为10.11 ~ 202.19 μg/mL、5.47 ~ 109.53 μg/mL，表明盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.3 定量限考察

取最低浓度的线性溶液，倍比稀释，以信噪比约为10时的质量浓度为定量限。结果显示，盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠的定量限分别为0.40、0.22 μg/mL。

2.3.4 破坏试验

为考察本品在实验操作时的光稳定性以及色谱系统对杂质分离的有效性，进行以下强制破坏实验：取样品倒入烧杯中，日光下放置8 h，即得光破坏样品；取样品在60 ℃烘箱中放置20 h，即得热破坏样品；取样品1 mL，加入1 mol/L盐酸溶液1 mL，放置10 min，用1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL中和，即得酸破坏样品；取样品1 mL，加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，放置10 min，用1 mol/L盐酸溶液1 mL中和，即得碱破坏样品。将上述强制破坏样品按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果显示，在正常光照条件下，本品在溶液制备过程中对光稳定。色谱系统能够将降解产生的杂质与2个待测成分有效分离。

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  图2 强制破坏试验HPLC 色谱图

  Figure2.HPLC chromatograms of forced degradation tests

  注：A. 光破坏溶液（254 nm）；B. 热破坏溶液（254 nm）；C. 酸破坏溶液（254 nm）；D. 碱破坏溶液（254 nm）；E. 光破坏溶液（289 nm）；F. 热破坏溶液（289 nm）；G. 酸破坏溶液（289 nm）；H. 碱破坏溶液（289 nm）；1. 依地酸二钠；2. 盐酸氮䓬斯汀。

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2.3.5 精密度试验

取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。结果盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠峰面积的RSD分别为0.12%、0.66%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取同一批样品（批号：241202），平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠平均含量分别为0.968、0.488 mg/mL，RSD分别为1.39%、1.02%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

取样品（批号：241202）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、5、7、9、24 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠峰面积的RSD分别为0.61%、1.74%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品（批号：241201）1 mL，置50 mL量瓶，平行9份，分别精密量取“2.2.2”项下对照品贮备液1.0、1.5、2.0 mL加入，各平行3份，各加衍生化试剂1 mL，加水稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果盐酸氮䓬斯汀和依地酸二钠的平均加样回收率分别为99.3%、99.7%，RSD分别为0.61%、0.74%（n=9），表明方法准确度良好。

2.4 样品含量测定

取3批（批号为20241201、20241202、20241203）样品各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，各平行2份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量，结果见表1。

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  表格1 3批样品中2种成分的含量测定结果（mg/mL，n=2）

  Table1.Results of the content determination of two components in three batches of samples (mg/mL, n=2)

  

3 讨论

3.1 检测波长的选择

依地酸二钠无明显紫外吸收，与硫酸铜发生络合反应后生成稳定的五元环螯合物，在254 nm有最大吸收。盐酸氮䓬斯汀的最大吸收波长为289 nm，其结构中缺乏螯合位点，与硫酸铜不发生络合反应。本研究选择双波长检测方法，分别在2个成分的最大吸收波长处测定其含量，获得满意结果。

3.2 流动相的选择

依地酸二钠与硫酸铜的络合反应受pH值的影响显著，pH 4 ~ 6为较适宜区间。反应产物为强亲水阴离子，在C₁₈柱几乎无保留，需要在流动相中加入阳离子型离子对试剂，与其形成中性疏水离子缔合物后方可获得有效保留。本研究经过多次探索试验后，最终选择乙腈与醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5，含10 mmol/L四丁基溴化铵）作为流动相，进行梯度洗脱，既让依地酸二钠在色谱柱上获得有效保留，同时还改善了盐酸氮䓬斯汀峰形拖尾的问题。

3.3 方法评价

《中国药典》自2015年版起收载盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂^［15-17］，但目前尚未设置定量测定依地酸二钠的检测项目，企业注册申报的质量标准则采用滴定法进行测定。将本研究中2种成分的含量测定结果与注册检验的测定结果进行比较，相对偏差 ≤ 0.8%，提示测定结果基本一致。

本研究建立的双波长HPLC柱前衍生化方法可以同时测定盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂中的盐酸氮䓬斯汀与依地酸二钠的含量，方法操作简便、精密度与准确度高，既避免了滴定法的不便，也避免了使用两种液相系统分别测定的繁琐，极大地提高了检验效率，为该品种质量标准的完善提供了有价值的参考。本方法的局限性是仅考察了3批供试品，也未进行耐用性考察。今后若开展本品质量标准的提高工作，将对方法的耐用性及各影响因素进行更全面深入的考察。

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