目的  制备槲皮素纳米晶提高其溶出速率，并考察不同稳定剂种类和比例对纳米晶稳定性的影响。

方法  采用溶剂超声法制备槲皮素纳米晶，分别比较3种不同稳定剂（聚维酮K30、泊洛沙姆F188、十二烷基硫酸钠），以粒径为筛选指标考察放置的稳定性，并结合扫描电镜、红外光谱和X射线衍射的方法，表征纳米晶的微观形态，以及探讨稳定剂与纳米晶的作用机制。

结果  通过试验筛选，结果显示聚维酮K30的稳定性能最好，纳米晶同样为棒状结晶形态，纳米晶的溶出速率较原料药有了明显的提高。

结论  稳定剂的种类和用量会影响纳米晶的稳定性。

据估计，90%的新药溶解度低，或其溶解度需依赖外界的pH值[1]。生物制药分类系统表明，这类化合物近70%属于Ⅱ类（低溶解性、高渗透性），而20%属于Ⅳ类（低溶解性、低渗透性）。如果药物在胃肠道内的溶解性低，则会限制其释放和吸收，口服生物利用度差，影响药效的发挥，这在一定程度上极大地限制了其新药产品开发，而纳米制剂是最有希望解决上述问题的给药系统。在过去的几十年里，已有大量研究表明材料表面的微米或纳米结构对细菌和细胞的活力、黏附、运动等行为有显著影响[2]。纳米制剂分为两类：一类是纳米颗粒，另一类是不含载体的纳米晶。纳米颗粒由于有大量的高分子化合物和表面活性剂等，其安全性和载药量一直备受关注，且纳米颗粒有脱载现象，靶向率低，不易进行工艺设计。药物纳米晶体指小于１μm的药物晶体颗粒，当纳米结晶态固体颗粒分散在液体介质中时形成纳米混悬液，通过干燥等手段进一步固化可得到固态纳米晶体。药物纳米晶作为一种配方简单、增溶有效、载体毒性小[3]、生产工艺具有延展性的新型技术，在工业化大生产中具备良好的开发潜能。然而纳米尺寸带来的稳定性问题以及固体制剂的再分散稳定性限制了纳米晶体技术的发展与应用，不稳定现象包括晶体聚集[4]、沉降[5]以及Ostwald熟化[6]。采用合适的稳定剂可以降低纳米晶体的表面张力，防止纳米晶体的团聚，是提高药物纳米晶体稳定性的重要措施。

槲皮素是一种广泛存在于植物中的类黄酮化合物，具有多种生物活性，包括抗氧化能力、广谱的抗菌特性、抗肿瘤、抗炎和免疫抑制作用、心血管保护、抗寄生虫等[7]。此外，槲皮素可以逆转认知障碍，增强衰老过程中的记忆力[8]。但槲皮素的溶解度低，阻碍了槲皮素的应用。将其制备成纳米晶后，可以提高槲皮素的生物利用度，从而提高疗效。

本研究通过反沉淀联合超声法制备槲皮素纳米晶，考察了泊洛沙姆F188（F188）、聚维酮K30（PVP K30）及十二烷基硫酸钠（SDS）3种表面活性剂对槲皮素纳米晶的稳定性影响作用，并讨论可能的稳定性作用机制。

1 材料

1.1 主要仪器

SHA-B双功能水浴恒温振荡器（江金坛亿通电子有限公司）；Nano ZS90 激光粒度仪（马尔文仪器有限公司）；ZEN3690 Zeta电位分析仪（马尔文仪器有限公司）；IRAffinity-1傅里叶红外色谱仪（日本岛津公司）；Smart Lab SE X射线衍射仪（日本Rigaku公司）；XS105电子天平（METTLER TOLEDO）；Heraeus Megafuge 8R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；DSC 214 Polyma 差示扫描量热仪（德国耐驰仪器制造有限公司）；TU-1950双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医大仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

槲皮素原料药（上海创诺制药有限公司，批号：100081-201610，纯度98.0%）；PVP K30（北京风礼精求商贸有限公司，批号：G81907PTO）；F188（上海麦克林生化科技有限公司，批号：20170118）；SDS（天津市凯通化学试剂有限公司，批号：20181026）；无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司，批号：D2121155）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 槲皮素纳米晶的制备

先精密称取一定量槲皮素，用乙醇超声溶解；移取一定量稳定剂溶液，冰浴，探头超声粉碎，探头位置距离液面0.5 cm，每次5 s，间隔5 s，总时间5 min，功率30%，同时以0.01 mL/s的速度滴加药液；将制备好的纳米晶混悬液用50 nm的聚碳酸酯膜抽滤，再用10 mL蒸馏水清洗滤饼3次；超声分散至含有相同稳定剂的10 mL溶液中，再次按照之前的粉碎参数粉碎1 min[9]，即得。

2.2 槲皮素纳米晶的外观性状

将制备好的纳米晶和原料药用导电胶粘附少许，置于喷金仪中，在真空状态下喷金，然后固定于圆柱铜台，于扫描电镜下观察其微观表面形态。如图1所示，槲皮素原料药为棒状，粒径并不均一；纳米晶在镜下仍呈现成棒状形态。

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  图1 槲皮素原料药(A)和纳米晶(B)扫描电镜图

  Figure 1.Scanning electron microscope images of raw materials (A) and nanocrystals (B) of quercetin

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2.3 稳定剂的筛选

依据文献[10]和前期工作基础，筛选可用于纳米晶制备的稳定剂：F188、PVP K30和SDS。稳定剂配制方法：精密称取一定量的稳定剂置于100 mL量瓶中，加蒸馏水超声溶解后定容，即得。按照槲皮素与稳定剂的质量比为10 ∶ 1、20 ∶  1、100 ∶ 1分别制备纳米晶，考察室温下各个纳米混悬剂1周内的粒径变化：将制备好的纳米晶混悬液放置在4 ℃的冰箱内，隔天取样；吸取100 μL纳米晶混悬液，用1 mL水稀释，采用马尔文粒径仪来测定纳米粒的粒径以及多分散指数（polydispersity index，PDI）。

2.3.1 以F188为稳定剂时纳米晶的粒径变化

图2结果显示，当槲皮素与F188质量比为10 ∶ 1时，纳米晶的粒径甚至增加了约14 倍；质量比为20 ∶ 1时，纳米晶的粒径增加约2 倍；质量比为100 ∶ 1时，其前期变化明显，纳米晶粒径在3 d增加了约24 nm，后趋于平缓，与第1天相比增加了35 nm。综上所述，以F188 为稳定剂的纳米晶，其粒径在1周之内变化明显，故不适宜作为纳米晶的稳定剂。

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  图2 以F188为稳定剂的纳米晶的粒径变化

  Figure 2.The particle size change of nanocrystals with F188 as stabilizer

  注：A. 槲皮素与F188质量比为10 ∶ 1；B. 槲皮素与F188质量比为20 ∶  1；C. 槲皮素与F188质量比为100 ∶ 1。

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2.3.2 以 PVP K30为稳定剂时纳米晶的粒径变化

图3结果显示，当槲皮素与PVP K30的质量比为10 ∶ 1时，纳米晶的粒径在1周内增加了约40 nm；质量比为20 ∶ 1，粒径仅增加了12 nm，在该比例下纳米晶的粒径在1 周内变化较小，同时其PDI 也均小于0.3；质量比为100 ∶ 1时，纳米晶的粒径在1周内增加了约580 nm。综上所述，槲皮素与PVP K30的质量比为20 ∶ 1时能满足要求，并在一定时间内保持纳米晶混悬液的稳定。

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  图3 以PVP K30 为稳定剂的纳米晶的粒径变化

  Figure 3.The particle size change of nanocrystals with PVP K30 as stabilizer

  注：A. 槲皮素与PVP K30质量比为10 ∶ 1；B. 槲皮素与PVP K30质量比为20 ∶  1；C. 槲皮素与PVP K30质量比为100 ∶ 1。

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2.3.3 以SDS为稳定剂的纳米晶的粒径变化

图4结果显示，以SDS为稳定剂的纳米晶的粒径变化较大，当槲皮素与SDS的质量比为10  ∶  1和100 ∶ 1时粒径变化较为显著，其粒径在3 d内均增加30 nm，1周内粒径的变化在50 nm以上；质量比为20 ∶ 1时，粒径在1周内比上述两种比例的变化更显著。综上所述，SDS不适宜作为纳米晶的稳定剂。

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  图4 以SDS为稳定剂的纳米晶的粒径变化

  Figure 4.The particle size change of nanocrystals with SDS as stabilizer

  注：A. 槲皮素与SDS质量比为10 ∶ 1；B. 槲皮素与SDS质量比为20 ∶  1；C. 槲皮素与SDS质量比为100 ∶ 1。

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2.4 稳定剂PVP K30用量的考察

减少稳定剂的用量可以充分发挥纳米晶高载药、低载体的优势。因此，本课题组在槲皮素与PVP K30质量比为20 ∶ 1的基础上，考察了40 ∶ 1、60 ∶ 1、80 ∶ 1 3个不同比例。分别按照上述步骤制备纳米晶，考察室温下各个纳米混悬剂1周内的粒径和PDI变化。结果如图5所示，当槲皮素与PVP K30 的质量比超过40 ∶ 1时，纳米晶的粒径在3 d内迅速增加，制备的纳米晶在1周内增加了100 nm。故槲皮素与PVP K30的质量比为20 ∶  1时稳定效果最好，稳定剂的用量最少。

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  图5 不同比例PVP K30的纳米晶粒径变化

  Figure 5.Changes in the particle size of fluorescent nanocrystals with different proportions of PVP K30

  注：A. 槲皮素与PVP K30质量比为10 ∶ 1；B. 槲皮素与PVP K30质量比为40 ∶  1；C. 槲皮素与PVP K30质量比为60 ∶ 1；C. 槲皮素与PVP K30质量比为80 ∶ 1。

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2.5 稳定剂与药物相互作用机理的考察

2.5.1 傅里叶变换红外光谱测定

采用傅里叶变换红外光谱对槲皮素、稳定剂、槲皮素稳定剂物理混合物、纳米晶进行测定。取样品约1 mg和溴化钾约170 mg在玛瑙研钵中混合并充分研磨后，取适量用压片机进行压片，然后装入红外光谱仪进行测定，在500~4 000 cm^-1波长范围内进行扫描。

槲皮素在3 399 cm^-1处的振动峰是其-OH 的特征峰，在1 610 cm^-1和1 521 cm^-1处的振动峰是其苯环的特征峰。对比物理混合物和纳米晶的红外谱图，可以看出加入稳定剂基本不影响槲皮素的主要振动峰。因此稳定剂的加入不会影响纳米晶的晶体状态。具体见图6。

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  图6 傅里叶红外色谱测定结果

  Figure 6.Fourier infrared chromatographic results

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2.5.2 X射线衍射光谱测定

采用X射线衍射光谱对槲皮素、稳定剂、槲皮素稳定剂物理混合物、纳米晶进行测定。按照扫描速度20°/min，扫描范围5~60°进行X射线衍射光谱分析，记录图谱。在5~30°范围内，原料药于6.18、10.64、12.32、23.64、27.28°有明显的特征衍射峰，表明槲皮素原料药有晶体结构特征；PVP K30没有明显的衍射峰，不具有晶体结构特征；物理混合物、槲皮素纳米晶具有与槲皮素原料药一致的特征衍射峰，将槲皮素制备成纳米晶后，粒径有了较大改变，但仍保留了主要的晶体衍射峰，电镜下也能观察到槲皮素纳米晶仍是棒状晶型，晶型状态未发生改变。具体见图7。

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  图7 X射线衍射光谱测定结果

  Figure 7.X-ray diffraction spectroscopy results

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3 讨论

纳米晶的不稳定现象包括晶体聚集[4]、沉降 [5]以及Ostwald熟化[6]。其中晶体聚集是由于混悬液中的粒子进行布朗运动，粒子之间由于范德华力作用的吸引碰撞黏在一起，最终导致晶体尺寸增加，这一现象在纳米晶混悬液制备及储存过程中都有可能发生。Ostwald熟化是指大小不同的晶体粒子因溶解度不同而导致大颗粒不断变大，小颗粒不断变小甚至消失的现象，结果使晶体尺寸变大。

稳定剂稳定纳米晶体系的机制有两种，即空间位阻稳定和静电稳定。聚合物和非离子表面活性剂类的稳定剂通过建立空间位阻，防止粒子聚集，提高体系稳定性，而离子型表面活性剂通过提供静电斥力维持体系的稳定性[11]。稳定剂的浓度、亲水性/疏水性、相对分子质量、Zeta电位值、临界胶束浓度、联合应用等会影响其对药物纳米晶体的稳定作用。

相对分子质量较大的稳定剂相较于相对分子质量较小的稳定剂具有更好的稳定性能。聚合物稳定剂可通过提供空间斥力来维持体系的稳定性，长链聚合物能够提供更强的空间斥力作用以阻止药物粒子的团聚，提高体系的稳定，PVP K30较F188和SDS的分子量都大，PVP K30的分子长链可阻止纳米晶粒子的相互吸引和聚集，保持较好的稳定性。另外纳米晶体的稳定性与稳定剂的浓度不成正比，当稳定剂的浓度低于最佳浓度时，稳定剂对纳米晶体表面覆盖不完全，导致颗粒聚集长大；而当稳定剂用量过大时，可能会增加药物分子的溶解度，进而加速Ostwald熟化现象导致颗粒长大[12-13]。正如本试验结果所示：槲皮素与PVP K30以质量比超过40 ∶ 1时，纳米晶的粒径在3 d内迅速增加，制备的纳米晶在1周内增加了100 nm。因此槲皮素与PVP K30 的质量比为20 ∶ 1时稳定效果最好，稳定剂的用量最少。

本研究结果显示，可通过稳定剂的优选、制备工艺以及储存条件的改变等多种策略，改善药物纳米晶体制备过程中的稳定性以及再分散稳定性问题。但对于稳定剂与药物纳米晶体之间的相互作用以及各种因素对纳米晶体药物稳定性的具体影响机制尚不明确，仍需进一步通过多维表征探讨药物纳米晶体的稳定机制，根据不同的作用机理和影响因素，确定最合适的稳定剂和处方变量，稳定技术的发展对于纳米晶体技术的发展至关重要。

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