目的  探讨羽扇豆醇通过调控Notch信号通路对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的机制。

方法  体外培养肺癌细胞A549，用浓度为0、15、30、60 mg/L的羽扇豆醇处理细胞，其中0 mg/L记对照组，其余记为羽扇豆醇各剂量组；采用浓度为60 mg/ L羽扇豆醇和浓度为10  μmol/L Notch通路抑制剂DAPT处理细胞，记为羽扇豆醇+DAPT组。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞增殖变化；流式细胞术检测细胞凋亡；Transwell检测细胞迁移和侵袭；Western blot检测细胞增殖核抗原（PCNA）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、神经钙粘素（N-cadherin）、上皮钙粘素（E-cadherin）、Notch-1、发状分裂相关增强子（Hes-1）蛋白表达。

结果  15、30、60 mg/L羽扇豆醇组能明显抑制肺癌细胞的活力、迁移和侵袭细胞数目，提高凋亡率，降低PCNA、N-cadherin、Bcl-2、Hes-1、Notch-1表达，上调E-cadherin表达（P＜0.05）。与羽扇豆醇组相比，羽扇豆醇+DAPT组明显降低细胞活力、迁移细胞数目、侵袭细胞数目，增加细胞凋亡率，降低PCNA、Bcl-2、Hes-1、Notch-1、N-cadherin蛋白表达，增加E-cadherin蛋白表达（P＜0.05）。

结论  羽扇豆醇可能通过Notch信号通路阻碍肺癌细胞侵袭、迁移和增殖，诱导凋亡。

肺癌是常见的恶性肿瘤，也是死亡率和发病率较高的癌症，与生活环境、吸烟、大气污染和遗传等因素有关，其中吸烟是主要的危险因素，发病率占全部肺癌的80%~90%[1]。中国目前肺癌患者超过75%就医时已经确诊处于晚期，5年预后效果较差，仍未超过20%，严重影响患者生命健康安全[2]。因此，寻找有效治疗和诊断肺癌的方法至关重要。五环三萜类化合物羽扇豆醇是一种天然产物，广泛存在蔬菜和水果内，毒副作用较低、安全性高，具有良好的抗肿瘤活性[3]。羽扇豆醇可诱导胃癌细胞凋亡，阻碍其增殖、侵袭和迁移，与上调p53蛋白的表达、下调MDM2蛋白表达有关[4]。近期研究显示，羽扇豆醇通过下调miR-100-5p抑制肺癌NCI-H1299细胞迁移侵袭和增殖[5]，但是对肺癌细胞A549的研究机制尚不明确。Notch信号通路在生物进化上是一种高度保守的信号转导通路，在多种癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中起着关键作用[6-7]。有研究结果显示，下调LBX2-AS1通过阻滞Notch信号通路抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭[8]。目前关于羽扇豆醇与Notch信号通路的研究尚不清楚，本研究通过体外实验探讨羽扇豆醇是否能够通过调控Notch信号通路影响肺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，以期为肺癌患者的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

CO₂细胞培养箱（型号：Heracell 150i GP）购自美国赛默飞公司；酶标仪（型号：SpectraMax Mini）购自上海美谷分子仪器有限公司；流式细胞仪（型号：FACSAria™ Fusion）购自美国BD公司；显微镜（型号：DM750）购自德国徕卡显微系统公司；凝胶成像系统（型号：ChemiDoc™）购自上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 细胞和主要试剂

肺癌细胞A549（批号：JNO171-304）购买于广州吉妮欧生物公司；羽扇豆醇（HPLC≥98.0%，批号：18692）、Notch通路抑制剂DAPT（HPLC≥98.0%，批号：D5942）购买自美国Sigma公司；凋亡试剂盒（批号：C1062S）、四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒（批号：C0009S）购于碧云天生物；Transwell（批号：3460）购买于美国Corning公司；Matrigel基质胶（批号：356234）购买于美国BD公司；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（批号：PC0020）、化学发光液（批号：PE0010）购买于北京索莱宝公司；细胞增殖核抗原（PCNA）抗体、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）抗体、神经钙粘素（N-cadherin）抗体、上皮钙粘素（E-cadherin）抗体、Notch-1抗体、发状分裂相关增强子-l（Hes-1）抗体、3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（批号：71395）购买于美国Cell Signal Technology公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记（批号：7074）的二抗购买于美国Santa Cruz公司。

1.3 细胞培养与分组

从液氮罐内取出肺癌细胞A549放置在37  ℃、5% CO₂培养箱内，用RPMI-1640培养液培养，里面添加10%胎牛血清。取对数期的肺癌细胞A549接种于6孔板内，采用羽扇豆醇浓度为0、15、30、60 mg/L处理，其中0 mg/L记为对照组，其余记为15、30、60 mg/L羽扇豆醇各剂量组；采用浓度为60 mg/L的羽扇豆醇和浓度为10 μmol/L的Notch通路抑制剂DAPT处理细胞，记为羽扇豆醇+DAPT组。

1.4 MTT检测细胞增殖

取各组处理的肺癌细胞，在37 ℃、5% CO₂培养箱培养24、48、72 h时，添加MTT试剂20  μL，温育4 h。然后将细胞在150  μL二甲基亚砜中培养2~3 min，用酶标仪测定490  nm处的吸光度，并计算细胞活力。细胞活力 =实验组吸光度/对照组×100%，计算半抑制浓度（IC₅₀）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组处理的肺癌细胞培养48 h，用胰蛋白酶消化细胞，预冷PBS冲洗2次，加入500  μL的Binding Buffer制备细胞悬液，分别加入AnnexinⅤ-FITC和PI试剂各5 μL，轻轻混匀后，避光反应15 min，1 h置于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Transwell检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移实验：收集各组肺癌细胞A549，采用不含血清的RPMI-1640培养液调整密度为2×10⁵个/mL，Transwell上室添加100 μL细胞悬液，下室补充500 μL含血清RPMI-1640，37 ℃温育24 h。细胞在4%多聚甲醛和结晶紫中分别温育20 min。然后用显微镜和Image J软件分析迁移细胞的数目。侵袭实验：Matrigel平铺在Transwell上室内，使其凝固，后续步骤同迁移实验一致。

1.7 Western blot检测PCNA、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin、Notch-1、Hes-1蛋白表达

取各组处理的肺癌细胞干预48 h，加入RIPA提取细胞内总蛋白，采用BCA试剂盒对提取的蛋白进行定量分析，100 ℃煮沸变性蛋白，同时制备分离胶和浓缩胶。取45 μg蛋白样品经过12% SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗PCNA、Bcl- 2、N-cadherin、E-cadherin、Notch-1、Hes-1抗体，稀释比例均为1 ∶ 800，4 ℃温育过夜，第2天用HRP标记二抗（1 ∶ 2 000）在37 ℃温育1 h，添加化学发光试剂用于显色，Image J扫描胶片，以GAPDH为内参，计算分析目的蛋白的表达变化。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。数据以表示，多组样本的比较行单因素方差分析，两组样本的比较行t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量羽扇豆醇抑制肺癌细胞增殖并诱导凋亡

羽扇豆醇15、30、60 mg/L组相较于对照组，24、48、72 h细胞活力、PCNA、Bcl-2蛋白表达下降（P＜0.05），凋亡率增加（P＜0.05），见图1。A549细胞24  h、48 h、72 h的IC₅₀值分别为66.41、58.51、53.74 mg/L。

• 
  图1 不同浓度羽扇豆醇对肺癌细胞增殖和凋亡的影响（n=3）

  Figure 1.Effect of different concentrations of lupeol on lung cancer cell proliferation and apoptosis (n=3)

  注：A. 细胞活力；B. 细胞凋亡率；C. PCNA、Bcl-2蛋白表达；与对照组比较，aP＜0.05。

  

2.2 不同剂量羽扇豆醇抑制肺癌细胞迁移和侵袭

与对照组比较，15、30、60  mg/ L羽扇豆醇组内迁移细胞数目、侵袭细胞数目和N-cadherin表达下降（P＜0.05），E-cadherin表达增高（P ＜0.05）。见图2。

• 
  图2 不同浓度羽扇豆醇对肺癌细胞迁移侵袭的影响（n=3）

  Figure 2.Effect of different concentrations of lupeol on the migration and invasion of lung cancer cells (n=3)

  注：A. 迁移、侵袭图（200×）；B. N-cadherin、E-cadherin蛋白表达；与对照组比较，aP＜0.05。

  

2.3 不同剂量羽扇豆醇抑制肺癌细胞Notch信号通路相关蛋白表达

与对照组比较，15、30、60 mg/ L羽扇豆醇组内Notch-1、Hes-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）。见图3。

• 
  图3 不同浓度羽扇豆醇对肺癌细胞中Notch-1、Hes-1蛋白表达的影响（n=3）

  Figure 3.Effects of different concentrations of lupeol on the expression of Notch-1 and Hes-1 proteins in lung cancer cells (n=3)

  注：与对照组比较，aP＜0.05。

  

2.4 羽扇豆醇通过Notch信号通路对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

图4和图5显示，与羽扇豆醇组比较，羽扇豆醇+DAPT组Notch-1、Hes-1蛋白表达下调（P ＜0.05），细胞活力、PCNA、Bcl-2蛋白表达下降（P ＜0.05），凋亡率增高（P＜0.05）。

• 
  图4 各组细胞Notch信号通路蛋白表达（n=3）

  Figure 4.Protein expression of Notch signaling pathway in each group (n=3)

  注：与羽扇豆醇组比较，aP＜0.05。

  

• 
  图5 羽扇豆醇通过Notch信号通路对肺癌细胞增殖和凋亡的影响（n=3）

  Figure 5.Effect of lupeol on lung cancer cell proliferation and apoptosis through the Notch signaling pathway (n=3)

  注：A. 细胞活力；B. 细胞凋亡率；C. PCNA、Bcl-2蛋白。与羽扇豆醇组比较，aP<0.05。

  

2.5 羽扇豆醇通过Notch信号通路对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

与羽扇豆醇组比较，羽扇豆醇+DAPT组内迁移细胞数目和侵袭细胞数目及N-cadherin表达下降（P＜0.05），E-cadherin表达增高（P＜0.05）。见图6。

• 
  图6 羽扇豆醇通过Notch信号通路对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

  Figure 6.Effect of lupeol on lung cancer cell migration and invasion through the Notch signaling pathway

  注：A. 迁移、侵袭图（100×）；B. N-cadherin、E-cadherin蛋白表达；与羽扇豆醇组比较，aP＜0.05。

  

3 讨论

羽扇豆醇是一种安全有效、毒性较低的天然药物，在多种癌症中已经证实具有明显的抗肿瘤作用[9]。在乳腺癌研究中发现，羽扇豆醇能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[10-11]。刘博佳等 [12]研究通过体外实验观察羽扇豆醇对肝癌细胞的作用发现，羽扇豆醇阻碍肝癌细胞的侵袭、增殖和迁移，促进凋亡，下调N-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶-9蛋白表达，上调N-cadherin蛋白表达。张小鹰等[13]研究结果显示，羽扇豆醇通过联合miR-145-5p抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞的凋亡。以上实验说明羽扇豆醇具有良好的抗肿瘤作用，但是关于羽扇豆醇对肺癌细胞的研究报道尚不清楚，因此本研究以肺癌A549细胞作为研究对象，观察羽扇豆醇对肺癌A549细胞增殖、凋亡和转移的影响，以及可能相关的作用机制。本研究结果显示，不同浓度的羽扇豆醇处理肺癌细胞后，各剂量组羽扇豆醇呈剂量效应抑制细胞的活力、迁移细胞数目、侵袭细胞数目，促进细胞凋亡率，说明羽扇豆醇能够抑制肺癌发展。N-cadherin和E-cadherin是上皮间充质转化的标志物，Bcl-2是细胞凋亡的标志物，PCNA则是细胞增殖的标志物。本研究发现，羽扇豆醇干预降低了A549细胞中PCNA、Bcl-2、N-cadherin蛋白表达，增高了E-cadherin蛋白表达，与表型结果一致，提示羽扇豆醇通过降低PCNA蛋白表达抑制增殖，通过下调Bcl-2蛋白表达促进凋亡，并通过降低N-cadherin蛋白表达、提高E-cadherin蛋白表达抑制迁移和侵袭，进而发挥抗癌作用。

1917年Notch基因首次被发现是在果蝇体内，在多种组织和器官内分布，Notch信号通路能参与癌细胞增殖、迁移、侵袭抑制，以及凋亡促进等过程[14-15]。Notch信号通路Notch1受体能激活下游Hes-1蛋白介导参与肺癌细胞生长和转移[16]。有研究结果显示，Notch1等在非小细胞肺癌组织内表达上调，能够参与癌细胞增殖、转移[17]。张媛媛等[18]研究结果显示，Notch1蛋白在肺癌组织内表达上调，与患者预后相关。Hao等[19]研究结果显示，木犀草素部分通过调节circ_0000190/miR-130a-3p/Notch1/Hes-1信号通路阻滞肺癌细胞侵袭、迁移和增殖。本研究用不同浓度羽扇豆醇处理肺癌细胞，结果显示，羽扇豆醇处理肺癌细胞后能降低Notch-1、Hes-1表达，且高剂量羽扇豆醇对Notch-1、Hes-1表达的降低作用更明显，提示羽扇豆醇可能通过Notch信号通路介导肺癌细胞的凋亡、增殖、侵袭和迁移。进一步实验结果显示，加入Notch信号通路抑制剂后，能有效抑制羽扇豆醇对肺癌细胞恶性生物学行为及蛋白表达的影响，说明羽扇豆醇可能通过调控Notch信号通路影响肺癌细胞的发展。

综上所述，羽扇豆醇可能通过下调Notch信号通路促进肺癌细胞凋亡，阻滞其侵袭、迁移和增殖，为肺癌的研究提供进一步实验验证。然而，本研究仅采用正向实验验证羽扇豆醇对Notch信号通路的抑制作用，机制研究不够完善，未来将通过使用Notch信号通路激活剂进行反向验证，进一步证实羽扇豆醇对Notch信号通路的抑制作用。

1.Chen P, Liu Y, Wen Y, et al. Non-small cell lung cancer in China[J]. Cancer Commun (Lond), 2022, 42(10): 937-970. DOI: 10.1002/cac2.12359.

2.徐转转, 涂超超, 龚章沁, 等. 重组人血管内皮抑制素不同给药方式治疗非小细胞肺癌恶性胸腔积液的有效性和安全性的网状Meta分析[J]. 中国药师, 2024, 27(4): 697-710. [Xu ZZ, Tu CC, Gong ZQ, et al. Network Meta-analysis of the efficacy and safety of different administration methods of recombinant human endostatin in the treatment of malignant pleural effusion of non-small cell lung cancer[J]. China Pharmacist, 2024, 27(4): 697-710.] DOI: 10.12173/j.issn.1008-049X.202311198.

3.乔文姝, 赵海田, 姚磊. 羽扇豆烷型五环三萜生物活性研究进展[J]. 食品科学, 2020, 41(13): 235-241. [Qiao WS, Zhao HT, Yao L. Advances in understanding the biological activity of lupinane-type pentacyclic triterpenoids[J]. Food Science, 2020, 41(13): 235-241. DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20190715-194.

4.吴元元, 费素娟, 苗蓓, 等. 羽扇豆醇介导MDM2-p53通路对胃癌细胞生物学行为的影响[J]. 现代生物医学进展, 2021, 21(1): 46-49, 57. [Wu YY, Fei SJ, Miao  B, et al. Lupeol-mediated MDM2-p53 pathway affects on the biological behavior of gastric cancer cells and related mechanisms[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2021, 21(1): 46-49, 57.] DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2021.01.008.

5.黄昱刚, 谭伶娟, 陈广. 羽扇豆醇调控miR-100-5p对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞生物学行为的影响[J]. 天津医药, 2023, 51(2): 118-123. [Huang YG, Tan  LJ, Chen G. Effects of lupeol on the biological behavior of non-small cell lung cancer NCI-H1299 cells by regulating miR-100-5p[J]. Tianjin Medical Journal, 2023, 51(2): 118-123.] DOI: 10.11958/20220899.

6.吴振, 胡彦建, 尹琦, 等. Notch信号通路与肿瘤细胞凋亡的研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2021, 29(5): 901-906. [Wu Z, Hu YJ, Yin Q, et al. Advance of notch signaling pathway regulating cell apoptosis in malignant tumor[J]. Journal of Modern Oncology, 2021, 29(5): 901-906.] DOI: 10.3969/j.issn.1672-4992.2021.05.041.

7.Chen Y, Chen Y, Liu W. Chaperonin containing TCP1 subunit 6A may activate notch and wnt pathways to facilitate the malignant behaviors and cancer stemness in oral squamous cell carcinoma[J]. Cancer Biol Ther, 2024, 25(1): 2287122. DOI: 10.1080/15384047.2023.2287122.

8.Tang LX, Su SF, Wan Q, et al. Novel long non-coding RNA LBX2-AS1 indicates poor prognosis and promotes cell proliferation and metastasis through notch signaling in non-small cell lung cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(17): 7419-7429. DOI: 10.26355/eurrev_201909_18851.

9.Liu K, Zhang X, Xie L, et al. Lupeol and its derivatives as anticancer and anti-inflammatory agents: molecular mechanisms and therapeutic efficacy[J]. Pharmacol Res, 2021, 164: 105373. DOI: 10.1016/j.phrs.2020.105373.

10.Zhang X, Gao Z, Chen K, et al. Lupeol inhibits the proliferation and migration of MDA-MB-231 breast cancer cells via a novel crosstalk mechanism between autophagy and the EMT[J]. Food Funct, 2022, 13(9): 4967-4976. DOI: 10.1039/d2fo00483f.

11.张昕. 羽扇豆醇通过促进自噬抑制三阴性乳腺癌的作用机制研究[D]. 广州: 广州中医药大学, 2023. DOI: 10.27044/d.cnki.ggzzu.2023.000003.

12.刘博佳, 宁青, 钟荣玲, 等. 羽扇豆醇对人肝癌细胞HepG2和SK-HEP-1侵袭、转移的影响及机制研究[J]. 中国中药杂志, 2020, 45(24): 6028-6035. [Liu BJ, Ning Q, Zhong RL, et al. Effect of lupeol on invasion and metastasis of human hepatoma HepG2 and SK-HEP-1 cells and its mechanism[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2020, 45(24): 6028-6035.] DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20200901.403.

13.张小鹰, 何金花, 王浩, 等. 羽扇豆醇联合miR-145-5p对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2020, 36(8): 1413-1421. [Zhang XY, He  JH, Wang H, et al. Effects of lupeol and miR-145-5p on proliferation and apoptosis of prostate carcinoma cells[J]. Chinese Journal of Pathophysiology, 2020, 36(8): 1413-1421.] DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2020.08.010.

14.Cai F, Guo S, Huang S, et al. Rubimaillin suppresses proliferation, migration and invasion of prostate cancer cells via the Notch-1/MMP signaling pathway[J]. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2020, 66(2): 130-134. DOI: 10.14715/cmb/2020.66.2.21.

15.Ding R, Li G, Yao Y, et al. Transgelin-2 interacts with CD44 to regulate notch1 signaling pathway and participates in colorectal cancer proliferation and migration[J]. J Physiol Biochem, 2022, 78(1): 99-108. DOI: 10.1007/s13105-021-00843-8.

16.Jiang J, Ren H, Xu Y, et al. TRIM67 promotes the proliferation, migration, and invasion of non-small-cell lung cancer by positively regulating the notch pathway[J]. J Cancer, 2020, 11(5): 1240-1249. DOI: 10.7150/jca.38286.

17.Guo Y, Chi X, Qu S, et al. E3 ubiquitin-protein ligase 2 inhibits cell proliferation, migration, and invasion of non-small cell lung cancer through ubiquitination of notch1[J]. Acta Histochem, 2022, 124(1): 151818. DOI: 10.1016/j.acthis.2021.151818.

18.张媛媛, 马静, 何会娜, 等. 非小细胞肺癌组织中Notch1、PTEN表达相关性及其与患者预后的关系[J]. 山东医药, 2022, 62(29): 58-61. DOI: 10.3969/j.issn.1002-266X.2022.29.014.

19.Hao Z, Xiaoyu Z, Enhui G, et al. Luteolin suppresses lung cancer progression through targeting the circ_0000190/miR-130a-3p/notch-1 signaling pathway[J]. Journal of Chemotherapy (Florence, Italy), 2023, 35(4): 330-342. DOI: 10.1080/1120009X.2022.2102303.