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目的 通过网络药理学与动物体内实验，探究白鲜皮致急性肝损伤的机制。
方法 通过TCMSP、TCMIP和SwissTargetPrediction数据库得到白鲜皮的化学成分和作用靶点，GeneCards和CTD数据库获取肝损伤疾病的相关靶点。利用STRING数据库对交集靶点进行蛋白质互作网络分析并筛选出核心靶点，利用DAVID数据库完成GO功能和KEGG通路富集分析，使用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点”多层次关联网络图。动物实验中，通过灌胃给予小鼠92.7 g/（kg·d）白鲜皮，7 d后取材。采用苏木精-伊红（HE）、Masson、油红O染色观察肝脏病理学变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β的表达情况；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肝脏组织蛋白激酶B1（AKT1）、IL-6、TNF-α、肿瘤蛋白p53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-1β的mRNA表达。应用分子对接验证潜在毒性成分与靶点的结合情况。
结果 通过筛选共得到白鲜皮化学成分14个，预测靶点244个；与肝损伤的交集靶点202个。GO生物过程分析主要涉及基因表达正向调控、凋亡过程的负向调控等。KEGG通路富集分析主要包括癌症途径、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶、TNF、IL-17等信号通路等。病理片结果显示，给予白鲜皮后，HE染色小鼠肝组织中可见重度出血，较大量的肝细胞坏死，核碎裂或溶解；Masson染色显示肝组织出现明显纤维化；油红O染色结果有大量脂滴生成。ELISA结果显示与空白组相比，给药组小鼠血清AST、ALT、ALP、LDH及肝脏MDA、TNF-α、IL-1β水平显著上升（P＜0.05），肝脏SOD水平显著降低（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示给药组小鼠肝脏组织相关mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）。分子对接显示黄柏酮、白鲜碱、梣酮3个白鲜皮的潜在毒性成分与AKT1、IL-6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β靶点结合性、亲和力良好。
结论 黄柏酮、白鲜碱、梣酮、柠檬苦素可能是白鲜皮致小鼠急性肝损伤潜在毒性成分，白鲜皮可能是通过改变AKT1、IL6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β等蛋白的表达，影响能量代谢、细胞分化、炎症、氧化应激及免疫等多种途径来作用于肝脏，导致肝损伤。
白鲜皮（Cortex dictamni），首载于《神农本草经》，为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的根皮，《本草原始》中记载“白鲜皮，入肺经，故能去风，入小肠经，故能去湿，夫风湿既除，则血气自活而热亦去。治一切疥癞、恶风、疥癣、杨梅、诸疮热毒”[1]。历代记载其为“无毒”中药。随着我国医药的不断发展，药品不良反应监测体系的不断完善，中药药源性肝损伤（herb-induced liver injury，HILI）越来越受到关注。HILI是指由中药本身和（或）其代谢产物等所导致的肝损伤，是中药临床应用常见的不良反应[2]。2008年，国家药品不良反应监测中心通报指出，以白鲜皮为主要成分的痔血胶囊因存在肝损伤风险被撤市 [3]。期间也有大量有关白鲜皮肝损伤的研究报道，这些研究表明白鲜碱、梣酮、柠檬苦素类等可能为白鲜皮肝毒性的主要成分[4]，严重影响临床安全用药。然而，到目前为止，关于白鲜皮毒性的相关机制研究却很少。
基于“疾病-基因-靶向-治疗”概念的网络药理学常被用于探索药物的作用机制，其不仅通过对靶点和信号的建模来识别和优化多靶点干预，还可以用来评价药物的疗效，现已广泛应用于肝损伤、肾损伤等疾病的研究[5-7]。为了进一步探究白鲜皮肝毒性机制，更好地服务于临床，本研究利用网络药理学结合动物体内实验的方法对白鲜皮致小鼠急性肝损伤的机制加以探索和说明。
1 材料及方法
1.1 主要仪器
ZMN-7803型全自动组织包埋机（常州市华利电子有限责任公司）；R139型轮转切片机（徕卡显微系统上海贸易有限公司）；EMAC20型全自动染色机（徕卡显微系统上海贸易有限公司）；FRESCO17型台式高速冷冻离心机（Thermo-Fisher）；2720型聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司）；Eclipse E100型正置光学显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 主要药品与试剂
戊巴比妥钠（天津市大茂化学试剂厂，批号：20190112）；4%多聚甲醛组织固定液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0099）；苏木精-伊红（HE）染色液（珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA4025）；PCR引物由黑龙江箭速基因科技有限公司合成；一步法荧光定量反转录（qRT）PCR试剂盒（Vazyme公司，批号：7E220E8）；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），肝组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20230415、20230419、20220126、20220923、20221215、20211207、20221105、20221026）；白鲜皮购自河北全泰药业有限公司，经黑龙江中医药大学中药鉴定学王振月教授鉴定，符合《中国药典（2020版）》一部标准。
1.3 动物
SPF级ICR雄性小鼠40只，体重18~22 g，购于辽宁长生生物科技有限公司，动物质量合格证号：SCXK（辽）2020-0001，本实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准（批件号：2023062501）。
1.4 方法
1.4.1 网络药理学研究
通过中药系统药理学平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、中医药整合药理学研究平台2.0（TCMIP，https://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）、SwissTargetPrediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch），及已有文献证实白鲜皮有毒成分[8]，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件，筛选白鲜皮的化学成分，并构建其靶标。利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）获取靶点的官方UniProt ID信息。以“药源性肝损伤（drug-induced liver injury）”“化学和药物所致肝损伤（chemical and drug induced liver injury）”为关键词在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）、比较基因组学毒理数据库（CTD，https://ctdbase.org）筛选与肝损伤相关并标记有“marker/mechanism”的基因，得到肝毒性靶标。利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），取白鲜皮成分靶点和药源性肝损伤靶点的交集作为候选核心靶点。在STRING数据库（https://cn.string-db.org/）构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。再利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对交集靶点进行GO生物过程和KEGG富集分析，选出前20条通路，并通过“微生信”在线作图工具（https://www.bioinformatics.com.cn）绘制通路气泡图。最后在Cytoscape 3.9.0软件绘制“药物-成分-靶点”多维关联网络图。
1.4.2 药物制备及动物分组给药
取白鲜皮生药300 g，8倍水量浸泡30 min，连续回流提取2次，每次30 min，滤液浓缩冻干备用[9-11]。12只雄性ICR小鼠随机分为正常对照组和白鲜皮水提液组，每组6只。白鲜皮临床成人每日最大剂量为10 g/70 kg，小鼠与人之间的剂量转换系数9.1，以成人每日最大剂量的1倍等效量作为最小剂量，最大可实现浓度作为最大浓度，计算出最小致死剂量为92.7 g/（kg·d）。白鲜皮组单次给予对应的药物溶液92.7 g/（kg·d），正常对照组给予等体积蒸馏水，给药后第7天取材，期间观察小鼠状态。
1.4.3 病理学观察
小鼠眼眶取血，颈椎脱臼处死，取2.0 g小鼠肝组织采用4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋及切片，再进行HE、Masson和油红O染色，光学显微镜下观察组织病理变化。
1.4.4 ELISA法检测小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH和肝组织中MDA、SOD、TNF-α、IL-1β的表达
取50 μL血清以及一定量肝组织，加生理盐水，按照1 ∶ 9配置10%组织匀浆，严格按照各试剂盒的说明书，测定小鼠血清和肝组织匀浆中ALT、AST、ALP、LDH、MDA、SOD、TNF-α、IL-1β水平。
1.4.5 qRT-PCR检测肝脏组织AKT1、IL-6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β的mRNA表达
取50 mg肝脏组织，采用Trizol法分离总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒合成cDNA，以GAPDH基因为内参，对各组大鼠肝脏组织内AKT1、IL-6、TNF、TP53、CASP3、IL-1β进行PCR扩增反应。扩增反应条件为：95 ℃预热30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火31 s，40个循环，95 ℃ 扩增15 s。待测样本做3个复孔，采用公式2－△△ct进行计算，引物序列见表1。
1.4.6 分子对接研究
首先准备配体和受体文件，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索潜在毒性成分的结构，转化为Mol2格式，作为配体；在PDB数据库（https://www.rcsb.org）搜索下载核心靶标的PDB格式文件。利用AutoDock软件对蛋白受体以及小分子配体进行处理，最后通过AutoDock Vina和Pymol软件进行对接和可视化。将“药物-成分-靶点”网络中度值排名靠前的成分与核心靶点进行分子对接，计算结合亲和力，结合亲和力小于-5.0 kcal/mol表明小分子配体与受体蛋白具有良好的结合活性，而小于-7.0 kcal/mol表明结合活性更强。
1.5 统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行统计分析，实验结果以
表示。多组比较应采用方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 网络药理学预测结果
共筛选和整理出14个化学成分，244个成分靶标；在Genecard、CTD数据库合并去重后共得到3 247个肝毒性靶点。成分-疾病两者的交集靶点202个，可认为这些靶点是白鲜皮致肝损伤潜在靶点（图1A）。将上述202个靶点导入STRING数据库构建PPI网络图（图1B）。将PPI网络信息导入Cytoscape 3.9.0中，构建其核心靶点互作图（图1C）。同时构建“药物-成分-靶点”关联网络图（图1D），连线越多，说明其为关键成分，从网络图中可以看出黄柏酮、白鲜碱、梣酮、柠檬苦素等成分较为主要，AKT1、IL-6、TNF、TP53、CASP3、IL-1β等为核心靶点。 白鲜皮成分信息见表2。
同时将202个交集靶点输入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，GO分析共得到1 252个结果，其中分子功能（molecular function，MF）197个，细胞组分（cellular component，CC）118个，生物学过程（biological process，BP）937个，分别从MF、CC、BP中选择排名前5位的条目通过“微生信”网站作图，可以看出核心靶点涉及基因表达正向调控、凋亡过程的负向调控、凋亡过程的正向调控等多种生物学功能。KEGG分析得到186条信号通路，主要涉及癌症途径（pathways in cancer）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、白细胞介素-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等多个通路。排名前10位的信号通路绘制KEGG气泡图，见图1E和图1F。
2.2 小鼠肝病理学染色结果
正常对照组HE染色结果显示，小鼠的肝细胞圆润，肝小叶分界清晰，排列规整，相邻门管区无明显异常，肝板整齐，肝窦无明显扩张，无明显炎性现象；Masson染色结果无明显胶原纤维，未出现组织纤维化；油红O染色结果也未见明显异常。而在白鲜皮给药组的小鼠肝组织中可见重度出血，较大量的肝细胞坏死，以及核碎裂或溶解；Masson染色显示阳性纤维面积增加，纤维间隔厚度也明显增加，肝组织出现明显纤维化；油红O染色结果显示肝细胞质、细胞间隙，染色较深，表明有大量脂滴生成。通过以上结果分析，白鲜皮可致小鼠肝组织病理学损伤，具体见图2~图4。
2.3 血清生化指标结果
与正常对照组小鼠相比，白鲜皮给药组小鼠血清ALP、LDH、AST、ALT水平显著升高（P ＜0.05），提示给予白鲜皮能导致小鼠肝损伤。与正常对照组小鼠相比，白鲜皮给药组小鼠肝脏中MDA含量显著升高，SOD水平显著降低（P ＜0.05），提示白鲜皮可能通过诱导氧化应激导致肝损伤。TNF-α、IL-1β是常见的炎症标志物，给予白鲜皮后小鼠肝脏TNF-α、IL-1β含量显著升高（P＜0.05），提示给予白鲜皮，可能会导致肝脏组织炎症发生。具体见图5。
2.4 白鲜皮上调肝脏组织AKT1、IL-6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β mRNA表达
与正常对照组小鼠相比，白鲜皮给药组小鼠肝脏组织中AKT1、IL-6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β的mRNA表达量均显著升高（P＜0.05），与网络药理学预测结果相一致，提示白鲜皮可能是通过影响AKT1、IL-6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β mRNA表达导致肝损伤。具体见图6。
2.5 分子对接结果
分子对接结果表明，活性化合物与靶标结合能均小于-6.0 kcal/mol，表明活性化合物与靶标均具有良好的结合活性，其中黄柏酮与IL-6、TNF-α、TP53；白鲜碱与IL-6；梣酮与IL-6结合能均小于-8.0 kcal/mol，具有较强的结合能力。具体见表3和图7。
3 讨论
白鲜皮在传统中医上认为是“无毒”的中药，其广泛应用于皮肤疾病治疗[12]。白鲜皮主要包括生物碱类、柠檬苦素类、黄酮类等有效成分。本研究网络药理学结果预测白鲜碱、黄柏酮、梣酮、柠檬苦素等为白鲜皮潜在肝毒性成分，目前有关白鲜碱致肝毒性的研究较多，Li[13]和Lin等[14]研究表明白鲜碱可升高肝脏AST、ALT和MDA水平。ALT、AST是与肝细胞损伤相关的转氨酶，是反应肝损伤程度的经典指标，肝脏损伤时，两者的含量均会上升。血清中ALP、LDH含量主要用于反应肝脏疾病，是肝脏损伤的重要指标[15- 16]。MDA、SOD两者是常见评价氧化应激的指标，Yuan等[17]研究表明乙醇诱导的肝损伤模型中MDA含量上升，SOD含量下降，与本研究给予白鲜皮小鼠血清指标含量变化一致；白鲜碱亲电代谢中间体与蛋白质的共价结合，从而引起蛋白质结构和功能改变，并改变与胆汁酸在体内运输相关的多药耐药相关蛋白-3、多药耐药相关蛋白-4和钠牛磺胆酸共转运肽的表达，这可能是白鲜皮致肝毒性的原因。Fan等 [18]表明柠檬苦素可能是通过改变线粒体通透性，加速耗竭ATP，引起大鼠线粒体氧化损伤，导致线粒体肿胀，进而导致细胞凋亡，引起肝损伤。Zhou等[19]分别给予小鼠50、150、300 mg/kg梣酮，发现小鼠的血清中ALT、AST的含量显著升高，且表现为剂量依赖型肝毒性。其作用机制可能为细胞色素P450介导梣酮呋喃环生物活化，导致蛋白质功能受损与DNA分子损伤，进而导致肝损伤。
在“药物-成分-靶点”关联网络图中发现AKT1、TNF-α、IL-6、IL-1β、TP53等与潜在毒性成分关联密切，AKT作为PI3K信号通路下游的核心靶蛋白，属于AGC激酶家族。AKT有3种不同的亚型（AKT1、AKT2和AKT3），其中AKT1是PI3K路径的中心介质，AKT1在肝脏中主要定位于肝细胞质及细胞核，抑制AKT1活化可改善肝细胞炎症反应[20-21]。Fan等[22]研究发现，连续28 d给予白鲜皮水提液能显著升高小鼠血清ALT、AST水平，结合网络药理学预测结果，提示白鲜皮可能是通过促进TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达，加重炎症反应，导致肝损伤。与本实验给药组小鼠血清ELISA结果ALT、AST含量上升、肝脏组织AKT1、IL6、TNF-α、TP53、CASP3、IL-1β的mRNA异常表达相互验证。
GO分析白鲜皮致肝损伤主要涉及凋亡过程的负向调控、凋亡过程的正向调控及蛋白质结合等生物过程。KEGG通路富集主要涉及PI3K-AKT、TNF、IL-17等信号通路。其中PI3K-AKT信号通路存在于多种组织和细胞内，参与调控细胞自噬、迁移、增殖、生长、凋亡、炎症等多种生物学过程，激活PI3K-AKT信号通路后，会激活下游的核转录因子（NF-κB），进而激活NF-κB信号通路，会释放TNF-α、IL-6、IL-1β等大量的促炎症因子和促纤维化因子[23]，从而加重炎症反应，造成肝细胞损伤。TNF是一种重要的细胞炎症因子，TNF信号通路促进细胞生长和分化，诱导细胞发生凋亡或程序性细胞坏死，石伟[24]通过给予大鼠脂多糖建立免疫特异质肝损伤模型，评价TNF信号通路可能在白鲜皮致免疫特异质肝损伤中起到了关键作用，这与本研究网络药理学预测结果一致。
为了白鲜皮临床安全用药，本研究采用网络药理学预测白鲜皮致急性肝损伤的物质基础及相关靶点，利用分子对接从理论上进行验证，并富集得到白鲜皮致急性肝损伤的相关通路，动物实验进一步验证了上述预测结果，提示白鲜皮致急性肝损伤的机制涉及多成分、多靶点和多途径的共同作用。但本研究仍存在一定的局限性，网络药理学预测出的白鲜碱、黄柏酮、梣酮、柠檬苦素等潜在毒性成分，同时又是主要有效成分，这提示白鲜皮致急性肝损伤可能存在量-效-毒关系，需要进一步通过补充细胞和动物实验来验证，以期为白鲜皮的临床应用提供理论基础。
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