目的  在以乙醇体积分数、料液比、提取温度为影响因素的单因素试验基础上，优化核桃青皮萘醌的提取工艺，并考察核桃青皮萘醌提取物体外抗氧化活性。

方法  采用醇提取法，应用Box-Behnken设计-响应面法和反向传播神经网络模拟优化提取工艺。测定核桃青皮萘醌提取物对羟自由基（HO·）、超氧阴离子自由基（O2- ·）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除能力。

结果  最佳提取条件为乙醇体积分数为40%、料液比为1 ∶ 30（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间2 h，得到萘醌提取量（20.182±1.851）mg/g。质量浓度0.1 g/L的核桃青皮萘醌提取物溶液对HO·、O2-·和DPPH·的清除率分别为16.09%、67.28%和73.00%。

结论  优化后的核桃青皮萘醌提取工艺稳定、可行。核桃青皮萘醌提取物表现出较好的抗氧化活性。

核桃属植物已经具有两千多年的栽培历史，也是现在世界上最广泛的果树栽培作物之一，核桃树体及其枝叶、雄花序、青皮、核仁、核壳等均具有开发利用价值，但目前开发力度不够，资源利用率较低[1]。

核桃青皮是核桃壳外一层厚厚的绿色果皮，约占整个果实的60%[2]，具有抗氧化、强去自由基性能，还表现出抗癌、抗病毒、治疗皮肤病、抑菌、抗凝血、杀虫、镇痛等多种临床效应[3-5]。在中医验方中，核桃青皮又叫“青龙衣”[6]。核桃青皮提取物含多种活性化学成分，包括萘醌类、多酚类、萜类、多糖类等，还检测出多种矿物质、维生素等[7-9]。其中萘醌类化合物是从中分离得到的主要化学成分，具有一定的过氧化氢清除能力 [10]。然而，提取时常混杂有糖类、氨基酸类等物质，导致提取难度大、萘醌类成分纯度低。Box-Behnken设计-响应面法用于研究多变量系统中变量之间的相互作用，利用Box-Behnken设计并通过试验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，该方法精密度高、试验次数少、模型预测性能好，因此在多因素优化试验中得到了广泛应用[11-14]。反向传播（back-propagation，BP）神经网络是一种按误差逆传播算法训练的多层前馈网络，广泛应用于提取工艺研究中[15-17]。遗传算法模拟物竞天择的生物进化过程，对已构建的神经网络进行全局搜索与优化，进而获得最优解[18]。

核桃既是珍贵的用材树种，又是重要的药源植物[19]。新疆盛产核桃，主要分布在和田、阿克苏等地，故核桃青皮产量可观。大部分的核桃青皮被弃之不用，既污染了环境，又浪费了资源。本研究以单因素试验为基础，采用Plackett-Burman试验筛选关键因素，结合Box-Behnken设计-响应面法和BP神经网络模拟，优化核桃青皮萘醌的提取工艺，并应用自由基清除试验考察核桃青皮萘醌体外抗氧化能力[20-21]，为核桃青皮药用价值的开发提供参考，使其附加值进一步提高。

1 材料

1.1 主要仪器

L5S型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；KDM型调温电热套（山东省鄄城永兴仪器厂）；FW-80型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗器械厂）；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗器械厂）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；WP-UPT-10型超纯水机（四川沃特浦水处理有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

核桃青皮于2020年9月收自新疆维吾尔自治区和田地区墨玉县扎瓦乡依格孜艾日克村；1,8-二羟基蒽醌对照品（深圳市普健生物科技有限公司，批号：M21GB49395，纯度98%）；超氧阴离子自由基（O2-·，批号：JR240079）、羟自由基（HO·，批号：BC1325）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·，批号：S04IS224966）检测试剂盒均购自Solarbio公司；L-抗坏血酸（成都市科龙化工试剂厂，批号：20220406，纯度98%）；其余试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 1,8-二羟基蒽醌标准曲线考察

将1,8-二羟基蒽醌对照品在105 ℃条件下进行干燥处理，精密称量5.37 mg，置于50 mL量瓶中，用60%乙醇溶解至刻度，摇匀，制成对照品储备液。准确移取对照品储备液2、3、4、5、6  mL至25 mL量瓶中，加入1 mL 5%氢氧化钾溶液，用60%乙醇定容至25 mL，摇匀，制成5个不同质量浓度的系列标准溶液；移取1 mL 5%氢氧化钾溶液，用60%乙醇定容至25 mL，摇匀，作为空白对照溶液。采用紫外分光光度法，200~600 nm全波长扫描，显示在515 nm处1,8-二羟基蒽醌有最大吸收峰。在515 nm波长处，测定上述标准溶液的吸光度值 [22-23]。以溶液质量浓度为横坐标（X，μg/ mL）、吸光度为纵坐标（Y）进行线性回归，得到1,8-二羟基蒽醌的线性回归方程为Y=0.030 5X-0.025 1，r=0.999 5。1,8-二羟基蒽醌在8.592~25.776 μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 核桃青皮萘醌的提取

核桃青皮自然干燥，粉碎成粉末，过80目筛。称取核桃青皮粉约10 g，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下提取一定时间[5]。按“2.1”项下方法测定核桃青皮提取液的吸光度，将吸光度值代入标准曲线计算出提取液中核桃青皮萘醌浓度，并计算核桃青皮萘醌提取量（R），公式如下：

式中R为核桃青皮萘醌提取量[mg（萘醌） / g（核桃青皮粉）]，c为提取液中核桃青皮萘醌浓度（μg/mL），V为提取液体积（mL），D为稀释倍数，m为核桃青皮粉质量（g）。

2.3 单因素试验

考察乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间对核桃青皮萘醌提取量的影响。各可变因素的参数分别为：乙醇体积分数20%、40%、60%、80%、100% ，料液比1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40（g/mL），提取温度40、50、60、70、80 ℃，提取时间1、2、3、4、5 h [20, 24]。固定因素设定为乙醇体积分数60%、料液比

1 ∶ 20（g/ mL）、提取温度60 ℃、提取时间3 h。

2.3.1 乙醇体积分数对萘醌提取量的影响

由图1可见，料液比为1 ∶ 20（g/mL）、提取温度为60 ℃、提取时间为3 h时，随着乙醇体积分数增大，萘醌提取量呈先增加后降低的趋势。当乙醇体积分数为40%时，萘醌提取量最高，为16.020 mg/g。原因可能是随着提取溶剂中乙醇浓度增加，溶剂极性与核桃青皮中萘醌的极性逐渐接近，使得萘醌溶出增加；当乙醇浓度较高时，核桃青皮中萘醌的溶解减少，以及其他成分溶解增加，使得萘醌提取量降低。故选择20%~60%乙醇进行下一步工艺优化试验。

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  图1 乙醇体积分数对萘醌提取量的影响（n=3）

  Figure 1.The influence of ethanol volume fraction on the extraction amount of naphthoquinone (n=3)

  

2.3.2 料液比对萘醌提取量的影响

由图2可见，乙醇体积分数为60%、提取温度为60 ℃、提取时间为3 h时，随着提取溶剂用量增加，萘醌提取量呈先增加后降低的趋势。当料液比为1 ∶ 30（g/mL）时，萘醌提取量最高，为13.110 mg/g。原因可能是随着提取溶剂用量增加，溶剂与核桃青皮的接触面积增加，使得核桃青皮中萘醌的溶出增加；当继续增加提取溶剂用量时，核桃青皮中其他成分溶解增加，影响了萘醌提取量。故选择料液比为1 ∶ 20~1 ∶ 40（g/mL）进行下一步工艺优化试验。

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  图2 料液比对萘醌提取量的影响（n=3）

  Figure 2.The influence of solid-liquid ratio on the extraction amount of naphthoquinone (n=3)

  

2.3.3 提取温度对萘醌提取量的影响

由图3可见，乙醇体积分数为60%、料液比为1 ∶ 20（g/mL）、提取时间为3 h时，随着提取温度升高，萘醌提取量越高。原因可能是温度升高会使萘醌分子扩散速率加快、溶出增加，使得萘醌提取量增加。故选择60~80 ℃进行下一步工艺优化试验。

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  图3 提取温度比对萘醌提取量的影响（n=3）

  Figure 3.The influence of temperature on the extraction amount of naphthoquinone (n=3)

  

2.3.4 提取时间对萘醌提取量的影响

由图4可见，乙醇体积分数为60%、料液比为1 ∶ 20（g/mL）、提取温度为60 ℃时，随着提取时间延长，萘醌提取量呈先增加后降低的趋势。当提取时间2 h时，萘醌提取量最高，为10.920  mg/g。原因可能是随着提取时间增加，溶解越充分，使得萘醌提取量增加；当继续延长提取时间时，核桃青皮中其他成分溶解增加，影响了萘醌提取量。故选择提取时间1~3 h进行下一步工艺优化试验。

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  图4 提取时间比对萘醌提取量的影响（n=3）

  Figure 4.The influence of extraction time on the extraction amount of naphthoquinone (n=3)

  

2.4 Plackett-Burman试验筛选关键因素

在单因素试验考察基础上，采用Plackett-Burman试验设计，对乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、提取温度（X3）、提取时间（X4）进行关键因素的筛选，以核桃青皮萘醌提取量为响应值（Y），以克服单因素太多造成的试验组数较多的问题。每个因素有高低两个水平，Plackett-Burman试验设计因素及水平见表1。

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  表格1 Plackett-Burman试验因素水平

  Table 1.Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

  

Plackett-Burman试验设计方案及结果见表 2。采用Design-Expert13软件对表2试验数据进行统计及结果分析，得出桃青皮萘醌提取量（Y）与乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、提取温度（X3）、提取时间（X4）之间的关系：

Y=-17.178-0.104X1+0.06X2+0.528X3+0.438X4。

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  表格2 Plackett-Burman试验设计方案及结果

  Table 2.Plackett-Burman experiment design and results

  

由表3可知，模型P＜0.05，具有统计学意义。各因素对桃青皮萘醌提取量的影响程度大小为：X3＞X1＞X2＞X4，其中X3为极显著因素（P ＜0.01），X4影响不显著（P＞0.05）。故选取提取时间2 h，乙醇体积分数、料液比、提取温度为Box-Behnken响应面试验中的考察因素。

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  表格3 Plackett-Burman试验方差分析

  Table 3.Analysis of variance of Plackett-Burman experiment

  

2.5 Box-Behnken响应面试验优化提取工艺

在Plackett-Burman试验基础上，采用 Box-Behnken 试验组合原理，设计响应面试验，优化提取工艺。以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）为自变量，核桃青皮萘醌提取量（Y）为响应值，设计3因素3水平的优化试验。响应面试验因素与水平见表4。

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  表格4 响应面试验因素水平

  Table 4.Factors and levels of response surface method

  

响应面试验设计方案及结果见表5。采用Design-Expert 13软件对核桃青皮萘醌提取工艺各因素进行回归拟合，得回归方程Y=49.624+0.318A-0.659B-1.035C-0.003 2AB+0.009 8AC+0.014BC-0.012A2-0.002 6B2+0.004C2。方差分析结果显示模型P＜0.05，失拟项P＞0.05，有统计学意义。模型R2=0.869 4，r=0.932 4，模型拟合度较好，试验误差小，可用此模型对核桃青皮萘醌的提取工艺进行预测分析。

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  表格5 响应面试验设计方案及结果

  Table 5.Response surface design test scheme and results

  

由表6可见，因素 C、A2对核桃萘醌提取量有显著影响（P＜0.05），因素A、B 影响不显著，F值显示，各因素影响顺序为C＞A ＞B。在各因素交互作用中，交互项 AB、AC、BC 影响不显著，AC的P最小，两者交互作用最显著。响应曲面越陡，等高线为椭圆形，说明两个因素交互作用显著。由图5可见，提取温度与乙醇体积分数对提取量影响显著，该结果与方差分析一致。

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  表格6 响应面试验方差分析

  Table 6.Analysis of variance of response surface design test

  

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  图5 各因素交互作用响应面曲线图和等高线图

  Figure 5.Response surface curve and contour map of the interaction of each factors

  

通过Design-Expert 13软件分析得到核桃青皮萘醌最优提取工艺条件为乙醇体积分数46.42  %、料液比1 ∶ 23.91（g/mL）、提取温度71.3 ℃，在此条件下，核桃青皮萘醌提取量为19.772 mg/g。

2.6 BP神经网络优化

在Box-Behnken响应面试验基础上，应用表 5数据作为神经网络的训练及验证样本，设计3层BP神经网络，分别为输入层、隐藏层和输出层；输入节点数为3，即乙醇体积分数、料液比、提取温度；输出的节点数为1，即核桃青皮萘醌提取量。将响应面试验分析结果与BP神经网络的分析结果进行对比，以探寻较佳提取条件。

应用SPSS 26.0软件进行神经网络模型训练发现隐含层的个数为10时，预测值与实测值非常相近，神经网络结构见图6。实测值与BP神经网络预测值回归分析相关系数R2=0.913，见图7。

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  图6 神经网络结构

  Figure 6.Neural network structure

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  图7 核桃青皮萘醌提取量实测值与BP神经网络预测值回归分析

  Figure 7.Regression analysis of the measured extraction value and BP neural network prediction value of naphthoquinone

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将响应面试验预测值和BP神经网络预测值分别与实测值进行比较，结果见表7，神经网络预测值与实测值的差值明显小于响应面试验预测值与实测值的差值。

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  表格7 响应面试验和BP神经网络分析误差比较

  Table 7.Comparison of errors between response surface design test and BP neural network simulation

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在SPSSPRO（Scientific Platform Serving for Statistics Professional）软件中运用遗传算法预测出核桃青皮萘醌最大提取量为20.259 mg/g，相应的提取工艺条件为乙醇体积分数39.20 %、料液比1 ∶ 28.89（g/mL）、提取温度71.3 ℃。

2.7 最优工艺验证

综合响应面试验和BP神经网络模拟分析结果，以及考虑工业化控制，确定核桃青皮萘醌最优提取工艺条件为乙醇体积分数40%、料液比1 ∶ 30（g/mL）、提取温度70 ℃。在上述提取条件下平行试验3次，测得核桃青皮萘醌提取量为（20.182±1.851）mg/g，即核桃青皮中萘醌含量为2.02%。预测值与实测值相近，表明模型具有良好的预测性，可用于核桃青皮萘醌提取工艺研究。

2.8 核桃青皮萘醌提取物体外抗氧化试验

在经响应面试验优化得到的核桃青皮萘醌类成分提取条件下，制备核桃青皮萘醌提取液，减压浓缩至干。

分别精密称取核桃青皮粉12.5 mg、核桃青皮萘醌提取物2.5 mg、阳性对照L-抗坏血酸2.5  mg，置于25 mL量瓶中，乙醇定容后得质量浓度为0.5 g/L核桃青皮粉溶液、0.1 g/L核桃青皮萘醌提取物溶液和0.1 g/L L-抗坏血酸溶液。测定其对HO·、O2-·和DPPH·的清除能力[25]，平行测定3次。自由基清除率计算公式如下：

式中A1为加样后的吸光度，A0为用乙醇代替样品的空白对照的吸光度，A2为样品本身的吸光度。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示，多组间比较采用方差分析，两两比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

由图8可见，核桃青皮萘醌提取物对HO·、O2-·和DPPH·有一定的清除能力，虽然低于同质量浓度的L-抗坏血酸溶液（P ＜0.01），但高于5倍质量浓度的核桃青皮粉溶液（P ＜0.01），表明核桃青皮中萘醌经响应面试验优化提取后其清除各自由基的能力有显著性提高，表现出一定的体外抗氧化能力。

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  图8 不同样品对各自由基清除率（n=3）

  Figure 8.Radical scavenging rates of different samples (n=3)

  

3 讨论

本研究以核桃青皮为原材料，将药材粉碎，采用醇提取法，考察乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间对核桃青皮萘醌提取量的影响。Plackett-Burman试验结果显示提取时间对桃青皮萘醌提取量无显著影响，故选取了乙醇体积分数、料液比和提取温度这3个因素开展进一步响应面考察。Box-Behnken设计-响应面法建立的数学模型具有预测性好、可对多因素多水平分析的特点。应用Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺，并对方差结果进行分析，结果显示各因素影响顺序为提取温度 ＞乙醇体积分数＞料液比。BP神经网络分析结果显示其预测值与实测值的差值明显小于响应面试验预测值与实测值的差值。综合响应面试验和BP神经网络模拟分析结果，以及考虑工业化控制，确定核桃青皮萘醌最优提取工艺条件为乙醇体积分数40%、料液比1 ∶ 30（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间2 h，在此条件下核桃青皮萘醌提取量为20.182 mg/g，即核桃青皮中萘醌含量为2.02%。预测值与实测值相近，表明模型具有良好的预测性，可用于核桃青皮萘醌提取工艺研究。

自由基具有强氧化性，当机体自由基过量或失衡，便可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。核桃青皮萘醌体外抗氧化试验结果表明，其具有一定的清除自由基能力。质量浓度为0.1 g/L的核桃青皮萘醌提取物溶液对 HO·、O2-·和DPPH·的清除率分别为16.09%、67.28%、73.00%，虽然低于同质量浓度的L-抗坏血酸溶液，但高于5倍质量浓度的核桃青皮粉溶液，表现出较好的抗氧化活性。

核桃青皮的开发利用已开始受到关注，但核桃青皮萘醌提取物的抗氧化性、对于炎症因子影响的研究较少，进一步研究其药用活性成分和作用机理，对于更好地开发和利用核桃青皮药用价值具有非常重要的意义。

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