目的  考察10种中药饮片微生物污染水平，并对其污染的真菌和耐热菌开展多样性研究。

方法  根据《中国药典（2020年版）》微生物限度检查方法，检测饮片的需氧菌总数（TAMC）、霉菌和酵母菌总数（TYMC）、耐热菌总数（THRC）和3种控制菌，基于内转录间隔区（ITS）和16S核糖体DNA（16SrDNA）高通量测序技术研究饮片污染真菌和耐热菌的群落特征。

结果  28%（14/50）TAMC大于10⁶ cfu/g，20%（10/50）TYMC大于10⁴ cfu/g，68%（34/50）THRC大于10 cfu/g，40%（20/50）检出耐胆盐革兰阴性菌，2批广藿香检出大肠埃希菌，所有饮片均未检出沙门氏菌。高通量测序结果显示饮片污染真菌分布于12门、777属、1 467种，耐热菌分布于5门、57属、74种；饮片中含有黄曲霉菌以及解淀粉芽孢杆菌、缓慢葡萄球菌和沃氏葡萄球菌等耐热性致病菌。

结论  这10种中药饮片普遍受微生物污染，部分饮片含有产毒真菌和致病性耐热菌，患者用药具有潜在的微生物致病风险。

中药饮片的原料主要来源于动物、植物和矿物，除自身携带大量微生物难以通过简单炮制完全清除外，在采收、加工、运输和贮藏等过程中还可能再次被微生物侵染[1]。目前，国家尚未制定煎煮类饮片的微生物限度标准，因此该类饮片的质量监管存在薄弱环节，极易使生产企业忽视微生物污染的控制。杨美琴等[2]研究发现，相比可直接服用也可煎煮、直接服用和外用3类饮片，煎煮类饮片的微生物负载最高，研究发现一些煎煮类饮片含有致病性耐热菌[3-11]。有学者采用高通量测序技术，发现龟甲饮片表面真菌主要是曲霉属和青霉属，柴胡、黄芪、枸杞子、铁皮枫斗、桔梗和土鳖虫污染细菌主要为变形菌门和厚壁菌门，白术、麦冬、金银花等9种中药饮片污染细菌优势菌属包括肠杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等[12-14]。

中药饮片尤其是果实种子类饮片富含油脂和淀粉等成分，为微生物生长繁殖提供了营养条件 [15]。饮片中细菌和霉菌一旦发生增殖，不仅降低饮片的药效[16]，更为严重的是可能导致真菌毒素累积[17]及耐热菌增多[18]，增加患者微生物感染和中毒风险。清肺排毒汤、寒湿疫方及化湿败毒方等中药汤剂在治疗新型冠状病毒感染具有一定功效 [19]，受到老年患者青睐，而老年人因免疫力较低，若服用微生物污染严重饮片，易加重病情。为探究其中的微生物污染情况，本研究采用《中国药典》方法和高通量测序技术对上述方剂中的广藿香、苦杏仁、连翘等10种煎煮类饮片开展微生物群落特征分析，以期为新型冠状病毒乃至流感病毒患者安全用药提供一定的指导，也为开展煎煮类饮片的微生物控制提供数据支持。

1 材料

1.1 主要仪器

BSA2201型电子天平（德国Sartorius）；HVA110型高压蒸汽灭菌器（日本HIRAYAMA）；BSC1600-II-A2型生物安全柜（山东新华医疗器械股份有限公司）；PURA22型恒温水浴锅（德国JULABO）；IPP410型恒温培养箱（德国MEMMERT）；Ci-S型显微镜（日本Nikon）；VITEK2 Compact 30型全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃）；Pico-21型台式离心机（美国Thermo Fisher ）；ETC811型PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；DYCZ-21型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）；FR-1000型凝胶成像系统（上海复日科技有限公司）；Illumina Miseq核酸测序平台和生工云分析平台。

1.2 主要药品与试剂

pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（批号：210922）、胰酪大豆胨琼脂（trypticase soy agar，TSA）培养基（批号：220⁵17）、胰酪大豆胨液体（tryptic soy broth，TSB）培养基（批号：220914）、孟加拉红琼脂（rose bengal agar，RBA）培养基（批号：211216）、肠道菌增菌（enterobacteriaceae enrichment，EE）肉汤（批号：210927）、紫红胆盐葡萄糖琼脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）培养基（批号：210624）、麦康凯液体（MacConkey broth，MacB）培养基（批号： 2210²1）、麦康凯琼脂（MacConkey agar，MacA）培养基（批号：220³21）、沙门氏菌增菌肉汤（rappaport vassiliadis salmonella enrichment broth，RVSEB，RV）培养基（批 号：211123）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（xylose lysine desoxycholate，XLD）琼脂培养基（批号：220927）、三糖铁（triple sugar iron，TSI）琼脂培养基（批号：151117）均购于北京三药科技开发有限公司。E.Z.N.A.^® Mag-Bind® DNA提取试剂盒（美国Omega，批号：M5635-0²）；Qubit^® dsDNA HS定量试剂盒（美国Thermo Fisher，批号：Q32854）；2×Hieff^® Robust PCR预混合溶液（批号：1010⁵ES0³）和Hieff NGS^® DNA Selection Beads（批号：12601ES56）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

五味子、紫苏子、连翘等10种50批饮片分别购自福建省内零售药店，经福建省食品药品质量检验研究院中药与天然药物检验所刘岩庭主管药师鉴定，结果符合《中国药典（20²0年版）》一部及四部规定。具体见表1。

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  表格1 饮片信息

  Table 1.Information of decoction pieces

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1.3 标准菌株

大肠埃希菌[Escherichia coli，菌号：CMCC (B)4410²]、乙型副伤寒沙门氏菌[Salmonella paratyphi B，菌号：CMCC(B) 50094]、铜绿假单孢菌[Pseudomonas aeruginosa，菌号：CMCC(B) 1010⁴]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，菌号：CMCC(B) 63501]、金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，菌号：CMCC(B) 2600³]、白色念珠菌[Candida albicans，菌号：CMCC(F) 98001]、黑曲霉[Aspergillus niger，菌号：CMCC(F) 9800³]均购自中国食品药品检定研究院医学微生物菌种保藏中心。

2 方法与结果

2.1 微生物限度检测方法的建立

2.1.1 菌液的制备

按照《中国药典（20²0年版）》四部“110⁵ 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”和“1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”[20]的要求，将方法适用性试验用菌株制成浓度≤100 cfu/mL的菌悬液。

2.1.2 供试液的制备

称取饮片25 g至无菌有隔均质袋中，加入225 mL的pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，拍击混匀1 min，制成1 ∶ 10供试液。取适量1 ∶ 10供试液转移至无菌试管中，置沸水浴30 min后快速冷却，作为耐热菌总数（total heat-resistant microbial count，THRC）计数用供试液。

2.1.3 方法适用性试验

取“2.1.2”项下THRC计数用供试液，按常规法进行微生物计数和控制菌检查方法适用性试验。结果表明需氧菌总数（total aerobic microbial count，TAMC）、霉菌和酵母菌总数（total yeast and mould count，TYMC）、THRC可采取10^-1 ~10^-6的梯度稀释液按倾注法进行检测；耐胆盐革兰阴性菌（bile-tolerant gram-negative bacteria，BGB）的含量检测可采取10^-1~10^-5的梯度稀释液1 mL，然后接种10 mL EE，再根据VRBGA平板上的菌落生长情况，结合MPN（most probable number）表确定；大肠埃希菌检测所需TSB培养基的用量均为100 mL；检测沙门氏菌时，除五味子的TSB培养基用量为500 mL外，其余均为200  mL。

2.2 数据处理

饮片污染微生物的定量检测结果以lg值表示，TAMC、THRC及TYMC的lg值为0.5，表示计数结果＜10 cfu/g；BGB可能菌数（N）的lg值为0.5表示N＜10 cfu/g、1.5表示10 cfu/g＜N＜10²  cfu/ g、2.5表示10² cfu/g＜N＜10³ cfu/g、3.5表示10³ cfu/g＜N＜10⁴ cfu/g，以此类推。

2.3 微生物限度检测

2.3.1 微生物计数

按“2.1.3”项下方法对饮片污染微生物的载量进行分析，所有的饮片lgTAMC＞1.0，28%（14/50）的饮片lgTAMC＞6.0，lgTAMC均值5.0，最大值7.9，果实种子类饮片lgTAMC均值4.5，在4类饮片中最低。74%（37/50）的饮片lgTYMC＞1.0，20%（10/50）的饮片lgTYMC＞4.0，lgTYMC均值2.5，最大值5.6，果实种子类饮片lgTYMC均值2.4，低于全草类但高于发酵类和根茎类。沸水浴30 min后，68%（34/50）的饮片lgTHRC＞1.0，20%（10/50）的饮片lgTHRC＞3.0，lgTHRC均值1.9，最大值7.7。热处理使样品中的TAMC平均下降63.2%，其中淡豆豉的TAMC仅下降19.9%，表明该饮片具有较大的耐热菌负载（表2）。

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  表格2 中药饮片微生物计数结果分布表

  Table 2.Distribution of microbial counting results in Chinese herbal pieces

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2.3.2 控制菌

按“2.1.3”项下方法对饮片进行控制菌检查，40%（20/50）的饮片检出BGB，24%（12/50）的饮片lgBGB＞3.5。广藿香lgBGB为0.5~4.5，中位数为3.5，BGB污染水平高于其他9种饮片。经VITEK生化系统鉴定，广藿香污染BGB主要包括以下6类：泛菌属菌种、气味沙雷菌、阪崎克罗诺杆菌、肺炎克雷伯菌、成团泛菌和致伤埃希菌。广藿香（Pog-9）在沸水浴15 min后仍可检出BGB，鉴定为泛菌属菌种。2批广藿香检出大肠埃希菌，所有样品均未检出沙门氏菌。

2.4 沸水浴时间对耐热菌活性的影响

对lgTHRC较大的苍耳子（Sib-3）、广藿香（Pog-9）和淡豆豉（Fer1~5），按0、15、30、45、60、90、120 min沸水浴处理后，测定TAMC。由表3可知，即使增加沸水浴时间至120  min，饮片污染的耐热菌也可能保持活性，如淡豆豉（Fer-5），其lg值高达7.6。

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  表格3 不同沸水浴时间的TAMC测定结果

  Table 3.Results of the TAMC in different boiling bath time

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2.5 饮片污染真菌的高通量测序

2.5.1 内转录间隔区扩增子测序与分析

选择10种共24批受霉菌污染较严重（lgTYMC＞2.0）的饮片，按“2.1.2”项下方法制备成1 ∶ 10供试液，采用E.Z.N.A.^® Mag-Bind^®真菌DNA提取试剂盒提取上述供试液中的真菌DNA作为测序模板。采用引物内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）1 F5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'对ITS的ITS1~ITS2区进行PCR扩增。经2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测后，回收样本条带清晰的样品，基于Illumina MiSeq系统进行测序。使用USEARCH软件将有效序列聚类为相似度≥97%的操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），选择丰度最高的序列作为每个OTU的代表序列与数据库比对，进行物种注释，并在各个分类水平上分析物种组成、丰度信息和多样性。Shannon值越大，群落多样性越高；Simpson值越小，群落多样性越低。

2.5.2 OTU聚类

测序结果显示，有效序列数量范围10⁴~10⁵，序列长度主要分布在200~300 bp，平均长度为232 bp。苦杏仁获得最多有效序列（109 334条），板蓝根获得最少有效序列（76 717条）。所有样品共产生4 822个OTUs，其中广藿香的OTUs最多（874个），其次是苦杏仁（805个），百合的OTUs最少（136个）。具体见表4。

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  表格4 10种中药饮片高通量测序数据分析

  Table 4.High-throughput sequencing data analysis in ten Chinese herbal pieces

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2.5.3 真菌群落组成

24批饮片污染真菌分布于12门、45纲、126目、344科、777属和1 467种，以子囊菌门和担子菌门为主（表5）。相对丰度超过1%的真菌属有53个，苦杏仁（18个）、淡豆豉（12个）、五味子（11个）、苍耳子（11个）、紫苏子（10个）、广藿香（8个）、板蓝根（6个）、蔓荆子（5个）、连翘（3个）、百合（3个）。由图1可知，这10种饮片污染真菌的种类多样，不同品种间具有很大差异。同一品种的不同批次之间，仅百合、蔓荆子、苍耳子和广藿香这4种饮片污染真菌的种类较为相似，其中：百合以交链孢霉属和镰刀菌属为主，苍耳子和广藿香以曲霉菌属和节担菌属为主，蔓荆子以曲霉属为主。91.6%（22/24）的样品检测到黄曲霉，其中以蔓荆子污染黄曲霉的相对丰度最大，Fru-1和Fru-2分别高达22.12%和40.29%。

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  表格5 样品中真菌的相对丰度情况

  Table 5.Relative abundance of fungi in the samples

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  图1 真菌属水平相对丰度的统计分析

  Figure 1.Statistical analysis of relative abundance at genus level in fungi

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2.6 饮片污染耐热菌的高通量测序

2.6.1 16S核糖体DNA扩增子测序与分析

取“2.1.2”项下制备的1 ∶ 10供试液10 mL，置沸水浴30 min，然后吸取1 mL接种100 mL的TSB培养基，30~35 ℃培养48 h，收集培养液。采用E.Z.N.A.^® Mag-Bind®细菌DNA提取试剂盒，提取培养液中耐热菌的DNA作为测序模板。采用引物515 F5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'和909R 5'-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3'对16S  rDNA的V4~V5区进行PCR扩增，其余方法同“2.5.1”项。

2.6.2 OTU聚类

除五味子外，其余9种共43批饮片均获得有效序列，有效序列数量范围10⁴~10⁵，序列长度为350~500 bp。苦杏仁获得最多有效序列（80  897条），所有饮片的OTUs在45~60之间。具体见表6。

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  表格6 9种中药饮片高通量测序数据分析

  Table 6.High-throughput sequencing data analysis in nine Chinese herbal pieces

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2.6.3 耐热菌群落组成

43批饮片污染耐热菌分布于5门、9纲、24目、34科、57属和74种。在门水平，耐热菌由厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、蓝藻门和拟杆菌门组成，其中厚壁菌门占99%以上；在科水平，优势菌为芽孢杆菌科和硫胺素芽孢杆菌科；在属水平，优势菌为芽孢杆菌属和硫胺素芽孢杆菌属。具体见表7。

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  表格7 样品中耐热菌相对丰度情况

  Table 7.Relative abundance of heat-resistant microbial in the samples

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2.7 耐热菌鉴定

从样品的THRC测定平板中分离到32个耐热菌典型菌落，生化鉴定结果见表8，约91%（29/32）为芽孢杆菌，约9%（3/32）为葡萄球菌。

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  表格8 中药饮片污染耐热菌菌种鉴定结果

  Table 8.Identification results of heat resistant bacteria in Chinese herbal pieces

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3 讨论

研究结果表明：除五味子外，其余9种饮片普遍具有较高的微生物负载，对比国外标准发现，受试样品有44%（22/50）不符合USP[21]规定，8%（8/50）不符合EP[22]和JP[23]规定，其中广藿香（全草类）和淡豆豉（发酵类）不符合规定的占比高于其他饮片。五味子TAMC和TYMC低于总体平均值近2个数量级，这可能与五味子呈弱酸性（溶液PH值为3.15）有关。通过模拟饮片的煎煮过程，检测汤汁中的TAMC，除五味子外，其余9种饮片均检测到耐热菌，尤其是淡豆豉的耐热菌含量明显高于其他饮片，且不易通过煎煮杀灭。高通量测序和平板分离鉴定结果均显示饮片污染耐热菌[24]主要为芽孢杆菌属细菌，除解淀粉芽孢杆菌有报道为条件致病菌外，其余均为非致病菌。此外从THRC检测平板中分离到少量的沃氏葡萄球菌[25]和缓慢葡萄球菌[26]等条件致病菌。3种控制菌（BGB、大肠埃希菌和沙门氏菌），BGB的检出率最高。广藿香煎煮15  min后，仍能检测到BGB，说明该类菌虽然不耐热，但也可能存活于后下类饮片的汤汁中。这10种饮片污染真菌的种类各异，但在多数样品中可检测到黄曲霉，且黄曲霉是蔓荆子中的优势菌。综上，广藿香和淡豆豉的微生物污染最为严重，蔓荆子可能容易污染黄曲霉毒素，老年患者尽量选择不含上述3种饮片的方剂，以降低用药风险。

3.1 对煎煮类饮片微生物质量控制的建议

虽然煎煮类饮片污染微生物，经煎煮后多数被杀灭，但污染的耐热菌不易通过煎煮过程杀灭。目前，USP[21]、EP[22]和JP[23]根据饮片用途分直接服用和煎煮两大类，并制订了相应的微生物限度标准。我国煎煮类饮片微生物标准的缺失，意味着管理体系的不完善。在当前国家大力推进中医药传承创新的背景下，中药材规模化、规范化种植有加速形成趋势，国家有必要适时出台煎煮类饮片的微生物标准，特别是对饮片中的耐热菌总量和BGB含量进行控制，以引导饮片生产企业逐步形成生产全过程卫生质量控制意识，从而整体提升我国饮片的质量水平。

3.2 对耐热菌检测方法的建议

在THRC的检测方法上，由于后下类饮片如广藿香的煎煮时间较短（一般15 min），若按《中国药典》规定的沸水浴30 min后测定其THRC，不能真实反应该类饮片的耐热菌污染风险。因此，在检测后下类饮片的THRC时，建议将供试液置水浴（98~100 ℃）处理的时间参照饮片的实际煎煮时间。

3.3 对饮片生产企业的建议

芽孢杆菌是中药饮片污染耐热菌的主要微生物，耐干旱和高温，不仅在饮片中可以长期存活，而且还可在冷藏条件下的饮片汤汁中及人体内重新转变成营养细胞并迅速繁殖，威胁患者的用药安全。特别是炭疽芽孢杆菌[27-28]和蜡样芽孢杆菌 [29-30]能引起人类或动物严重致病，虽然这10种饮片未检测到上述2种致病菌，但有研究在通草[31]和海螵蛸[32]中发现蜡样芽孢杆菌，加上一些非致病的芽孢杆菌也可能成为条件致病菌，因此饮片中的芽孢杆菌污染需引起重视。据报道，⁶⁰Co-γ射线具有较强的穿透力，是一种经济、高效的灭菌方式，已证实其对芽孢杆菌具有较好的杀灭能力，且对多数中药饮片的成分和含量影响较小[33]。因此，生产企业除适度加强饮片的净制处理外，对于全草类等不易通过净制手段降低微生物负载的饮片，可以尝试采用⁶⁰Co辐照灭菌。此外，要特别重视饮片储存条件的管控，预防饮片在储藏环节发生微生物繁殖和毒素累积。

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