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目的 运用网络药理学方法探讨养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛的作用机制。
方法 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索养心消痹汤组方各味中药成分及其靶点信息，利用DrugBank和Therapeutic Target Database（TTD）数据库收集冠心病稳定型心绞痛疾病靶点；使用STRING数据库构建上述靶点信息蛋白质-蛋白质互作网络并导入Cytoscape软件进行分析与可视化图形构建。
结果 获得养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛靶点信息共计126个，相互作用关系2 305种，度值排名靠前的化合物有槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇和丹参酮IIA等；GO与KEGG分析结果显示养心消痹汤可能通过影响细胞组分运动、脂质定位、氧化应激、DNA转录、凝血过程、三磷腺苷代谢、免疫与炎症反调控、钙离子转运等生物过程发挥治疗冠心病稳定型心绞痛作用，缺氧诱导因子-1、Toll样受体、C-型凝集素受体、流体剪切和动脉粥样硬化、辅助性T细胞17/白细胞介素-17、T细胞受体、肿瘤坏死因子、松弛素和晚期搪基化终产物及其受体信号通路可能参与该过程。
结论 养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛的物质基础与机制可能与上述化学成分及相关生物学过程与信号通路有关。
我国心血管疾病患病人数已高达2.9亿，其中包括约1 100万的冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称“冠心病”）患者[1]。稳定型心绞痛是冠心病的主要症状，主要表现为胸痛，其发生原因与心肌暂时性供血不足有关[2]。研究表明，冠状动脉粥样硬化是冠心病发生发展的病理学基础，脂质代谢紊乱、血栓形成、炎症反应、血管平滑肌细胞和内皮细胞功能受损、肥胖、饮食习惯、基础疾病、性别、年龄等因素与冠状动脉粥样硬化斑块形成过程密切相关[3]。
中医理论认为稳定型心绞痛属于“胸痹”范畴，治疗该症的关键在于活血化瘀兼益气[4]。养心消痹汤是一种由人参、三七、红花、薤白、丹参、川芎、水蛭、郁金、木香和桂枝10味药材组成，并根据患者证候略作调整的中药汤剂[5]。湖北医药学院附属太和医院武当山院区研究者曾在2012—2013年对养心消痹汤结合内关穴位埋线法治疗稳定型心绞痛的临床疗效进行了观察，结果发现该法疗效显著，总有效率优于对照组[6]。但受制于该方组分的复杂性和当前研究资料的局限性，养心消痹汤治疗稳定型心绞痛的药效学物质基础及其药理学作用机制尚不清楚。
网络药理学是一种基于系统生物学、基因组学和蛋白组学等理论、运用计算模拟和大数据分析技术揭示药物-靶点-疾病间互作关系的研究方法与技术，近年来在中药药效物质基础和药理学作用机制研究应用方面快速发展[7]。本研究主要内容为通过运用网络药理学方法，对养心消痹汤治疗稳定型心绞痛的药效学物质基础及其作用机制进行探讨，以期为其后续研究与应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 养心消痹汤有效成分及其靶点筛选
登陆中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php），分别检索养心消痹汤组方各味药材，得到各药材的化合物成分信息，设置“分子量（molecular weight，MW）＜500，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，类药性（drug like，DL）＞0.18”的筛选参数后[8]，下载符合条件的化合物及其靶点信息。查询《中国药典（2020版）》收载的关于养心消痹汤各味药材的质量控制指标性成分，并在TCMSP数据库中检索靶点信息。合并上述成分与靶点信息数据并去除重复值。利用Cytoscape 3.8.2中的“Analyze Network”功能对获得的化合物及其靶点信息进行可视化分析。
1.2 冠心病稳定型心绞痛靶点收集
登陆DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/），检索“Chronic Stable Angina Pectoris”项下治疗药物的靶点信息。登陆Therapeutic Target Database（TTD）数据库（http://db.idrblab.net/ttd/），以“BA40:Angina pectoris”检索疾病靶点信息，并将靶点信息在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中转换为UniProt编码信息。登陆GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），检索“Stable Angina”疾病靶点，下载数据后设定相关度分值＞3进行筛选，删除低分值靶点数据。合并上述靶点数据并去除重复值，得到稳定型心绞痛疾病靶点。
1.3 网络构建与分析
将养心消痹汤的成分-靶点和冠心病稳定型心绞痛治疗靶点信息分别导入STRING数据库（https://www.string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，然后进行蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction network，PPI）网络构建。下载上述PPI数据文件，导入Cytoscape软件进行分析与可视化网络图构建。利用Cytoscape软件中Merge功能对上述两个PPI网络交集数据进行提取，得到养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛的靶点信息。利用Cytoscape软件对上述交集数据进行分析与可视化呈现。韦恩图使用在线工具（https://app.diagrams.net/）制作。
1.4 GO功能及KEGG通路富集分析
利用Cytoscape软件中的ClueGO 2.5.7[9]插件和CluePedia 1.5.7[10]插件对养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛靶点分别进行GO功能及KEGG通路富集分析。
1.5 分子对接分析
本研究对养心消痹汤核心成分槲皮素（comp3）、山奈酚（comp8）、木犀草素（comp1）与靶点雄激素受体（androgen receptor，AR）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFB1）、前列腺素内过氧化物合成酶（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS）2进行了分子对接分析：从PubChem数据库获取成分SDF文件，从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）获取靶点蛋白结构，使用PyMol软件处理分子后用AutoDock Tools进行加氢与电荷处理，利用PyRx软件进行分子对接并输出结果，利用PyMol软件进行结果可视化处理。
2 结果
2.1 养心消痹汤的成分-靶点信息
在TCMSP数据库中，除水蛭未被收录外，其余各味药材均可检索，共计查询得到符合条件的化合物138个，从《中国药典》中查询得到的指标性成分为8个。其中，按OB值排名前20名的化合物见表1。OB值为重要的药动学参数，是评价药物能否发挥药效重要指标。以上述全部化合物为检索对象，在TCMSP数据库中进行检索，得到具有靶点信息的化合物共计105个，获得靶点共计257个，对具有靶点信息的化合物再次按OB值排名，前20名的化合物见表2。
将上述化合物及其靶点信息导入Cytoscape软件进行可视化网络图构建后发现，该网络包含362个网络节点，1 384种相互作用关系，特征路径长度为3.041，网络密度为0.021，网络中心度为0.374，平均相邻节点度为7.646。度（degree）值反映了化合物与靶点之间的连接度，按该值排名前5名的化合物依次是槲皮素（comp3）、山奈酚（comp8）、木犀草素（comp1）、丹参酮IIA（comp97）和黄芩苷（comp36），具体见图1。
2.2 冠心病稳定型心绞痛治疗靶点
将DrugBank、TTD和GeneCards数据库中得到的冠心病稳定型心绞痛靶点合并后，去掉重复值，得到1 035个蛋白靶点信息。
2.3 养心消痹汤成分靶点和冠心病稳定型心绞痛治疗靶点网络分析
将STRING数据库的检索结果导入Cytoscape软件中进行分析后发现，养心消痹汤成分靶点的PPI网络包含254个节点和4 879种相互作用关系。取该网络与上述养心消痹汤成分靶点PPI网络交集后可得该药物治疗冠心病稳定型心绞痛的靶点信息（图2和图3），该网络包含126个节点和2 305种相互作用关系。
进一步导入化学成分信息后可构建出养心消痹汤成分作用于稳定型心绞痛靶点的PPI网络图（图 4）。此网络包含个226节点和1 452种相互作用关系。按degree值排名前10的化合物依次是槲皮素（comp3）、山奈酚（comp8）、木犀草素（comp1）、β-谷甾醇（comp6）、丹参酮IIA（comp97）、丹参新醌D（comp72）、柚皮素（comp42）、二氢丹参内酯（comp75）、豆甾醇（comp10）和黄芩苷（comp36）。按degree值排名前20的治疗靶点信息依次是AR、TGF-β1、PTGS2、花生四烯酸5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、脂联蛋白的C1Q和胶原结构区域（adiponectin，C1Q and collagen domain containing，ADIPOQ）、乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、PTGS1、溶质载体家族6（神经递质转运蛋白，去甲肾上腺素），成员2 [solute carrier family 6（neurotransmitter transporter，noradrenalin），member 2，SLC6A2]、肾上腺素能受体β2（adrenergic receptor β2，ADRB2）、丝裂原激活的蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、caveolin 1（CAV1）、钠电压门控通道α亚基5（sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A）、溶质载体家族2（神经递质转运蛋白，去甲肾上腺素），成员4 [solute carrier family 2（neurotransmitter transporter, noradrenalin），member 4，SLC2A4]、胆碱能受体毒蕈碱（cholinergic receptor muscarinic，CHRM）3、CHRM1、视黄醇X受体α（retinoid X receptor alpha，RXRα）、基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase IV，DPP4）和内皮素1（endothelin 1，EDN1）。
2.4 GO功能与KEGG通路富集分析结果
GO功能富集分析结果显示，养心消痹汤治疗冠心病稳定型心绞痛靶点富集结果为43条，包含19个生物学过程，主要为细胞组分运动、脂质定位、氧化应激、DNA转录因子调控、凝血过程、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）代谢调控、免疫与炎症反应调控、胞内钙离子转运、细胞衰老等，具体见图5。进一步的分析得到KEGG通路28条，主要相关通路有晚期糖基化终产物及其受体（advanced glycation end products-receptorfor advanced glycation end products，AGE-RAGE）、流体剪切和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）-17、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1、松弛素、Toll样受体、辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞分化、C-型凝集素受体、T细胞受体等信号，具体见图6。
2.5 分子对接结果分析
分子对接结果显示养心消痹汤核心成分槲皮素、山奈酚、木犀草素与靶点AR、TGFB1、PTGS2间均存在结合关系，结合能最高为-6.7 kcal/ mol（quercetin-TGFB1），结合能最低的为-9.7 kcal/ mol（quercetin- PTGS2），一般认为结合能小于-5.0 kcal/mol代表对接分子间存在较好结合关系。具体结果见表3和图7。
3 讨论
本文结果表明，养心消痹汤中含有的槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇和丹参酮IIA等化合物可能构成了该汤剂治疗稳定型心绞痛的药效学物质基础。上述多种成分可能通过影响AGE-RAGE、流体剪切和动脉粥样硬化、TNF、IL-17、HIF-1、松弛素、Toll样受体、Th17细胞分化、C-型凝集素受体、T细胞受体等信号通路发挥治疗稳定型心绞痛作用，其中较为重要的靶点有AR、TGF-β1和PTGS2等。分子对接测试结果表明养心消痹汤核心成分与关键靶点间均存在较好结合关系。
槲皮素[11]和山奈酚[12]可通过缓解炎症反应发挥对冠心病的治疗作用，其中槲皮素的作用机制可能与抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF- κB）活性有关[11]；木犀草素则被认为可通过抑制NF-κB介导的炎症反应和激活核转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）介导的抗氧化反应过程发挥治疗糖尿病性心肌病的作用[13]。而丹参类中药制剂（如丹红注射液、丹参注射液、丹参酸盐注射液、复方丹参注射液、丹参酮磺酸钠注射液等）在国内临床实践中广泛用于冠心病所致的稳定型心绞痛的治疗，其主要活性成分为丹参酮IIA[14]。综合以上证据和本文分析结果可以推测，上述化合物可能在养心消痹汤发挥治疗稳定型心绞痛过程中发挥了重要作用。
稳定型心绞痛的发生机制可能与血管舒张性能下降、粥样斑块形成、异常重塑等结构性改变以及血管平滑肌与内皮功能紊乱等功能性改变有关 [15]。本文对养心消痹汤治疗稳定型心绞痛靶点进行富集后得到了其参与调控的具体生物学过程，如细胞组分运动、脂质定位、氧化应激、DNA转录因子调控、凝血过程、ATP代谢调控、免疫与炎症反应调控、胞内钙离子转运、细胞衰老等。这些过程与稳定型心绞痛的发生的病理学过程密切相关。此外，本文也明确了养心消痹汤干预上述过程的信号通路有HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、C-型凝集素受体信号通路、流体剪切和动脉粥样硬化相关通路、Th17/IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路、松弛素信号通路和AGE-RAGE信号通路等。针对这些信号通路进行干预是目前治疗心血管疾病的有效策略。例如，抑制TNF信号通路可有效减少载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）-/-小鼠胸主动脉粥样斑块的形成[16]，缓解血管内皮细胞氧化应激并改善其ATP代谢调控可显著改善血管内皮功能[17]。
在既往研究中，本课题组对养心消痹汤结合内关穴位埋线治疗稳定型心绞痛的临床疗效进行了观察。结果发现与对照组相比，该法疗效显著，总有效率优于对照组，使用养心消痹汤治疗可有效降低患者血脂[18]和血清IL-6水平[5]，并提高红细胞超氧化物歧化酶活性和减少丙二醛生成[19]。这些结果与本文分析得出的养心消痹汤可影响脂质代谢、免疫与炎症及氧化应激反应的结论是相符合的，但其具体分子机制有待进一步通过整体动物实验和离体细胞实验加以证实。总之，本文通过运用网络药理学方法对养心消痹汤治疗稳定型心绞痛的药效学物质基础与作用机制进行了初步剖析，分析结果将为该汤剂在制备工艺建立、质量标准确定和药理作用机制揭示等方面的研究提供参考。
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