目的  探讨微管抑制剂VERU-111通过调控转化生长因子β（TGF-β）通路抑制上皮-间质转化（EMT），从而降低卵巢癌细胞的增殖及转移能力的作用机制。

方法   以卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3为研究对象，将细胞分为对照组、VERU-111低剂量组、VERU-111高剂量组及TGF-β激活剂组。通过MTT法测定细胞增殖能力、克隆形成实验评估细胞克隆能力及迁移实验分析细胞迁移特性。Western blotting实验检测TGF-β信号通路相关蛋白及EMT标志蛋白的表达水平。

结果  与对照组相比，VERU-111处理组的OVCAR3和SKOV3卵巢癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力显著下降（P＜0.05）。此外，VERU-111显著抑制了TGF-β及其下游通路中关键蛋白（如Smad2/3）的磷酸化水平，同时减少了EMT间质标志蛋白（如N-钙黏蛋白和波形蛋白）的表达，并增加了上皮标志蛋白E-钙黏蛋白的表达（P ＜0.05）。

结论  微管抑制剂VERU-111通过调控TGF-β通路抑制EMT过程，显著减弱卵巢癌细胞OVCAR3和SKOV3的增殖及迁移能力，具有潜在的治疗应用价值。

卵巢癌是一种起源于卵巢组织的恶性肿瘤，常晚期发现，具有高复发率和致死率[1]。当前的标准治疗方法包括肿瘤细胞减灭手术以及紫杉醇联合铂类药物的化疗[2]。微管在细胞内具有重要功能，其动态变化与肿瘤发生和发展密切相关[3]。VERU-111是一种新型微管靶向药物，通过影响微管的稳定性和肿瘤细胞生物学行为来发挥作用[4]。该药物在多种癌细胞系中已显示出抗肿瘤活性，包括黑色素瘤[5]、肺癌[6]、乳腺癌[7- 8]、胰腺癌[9]等。并且VERU-111已在前列腺癌患者中进行了I期/II期临床试验[10]。本课题组前期研究结果表明，VERU-111显著抑制了SKOV3和OVCAR3细胞的增殖和转移，并减少了肿瘤重量和转移[11]。然而，其具体的作用机制仍不明确。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是卵巢癌的重要特征之一，表现为细胞表面标志物的改变，并受多个信号通路的调控[12]。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路在EMT过程中起着关键作用，通过激活下游的Smad蛋白，促进EMT相关基因的表达，从而增强肿瘤细胞的转移能力 [13]。本研究旨在深入探究VERU-111对卵巢癌的抑制作用及其分子机制，通过细胞实验验证其治疗潜力。这一研究有望为卵巢癌的治疗提供新的策略和药物选择，并为临床转化提供有力支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

MCO-18AICCO₂培养箱（日本Sanyo公司）；1658004电泳设备（美国伯乐公司）；PB0002 Western blotting转膜设备（美国Thermo Fisher公司）；ECLIPSE Ts2R显微拍照系统（日本尼康公司）。

1.1.2 主要药品与试剂

链霉素/青霉素（批号：15140122）和MTT 检测试剂（批号：M6494）购自美国Thermo Fisher公司；1640培养基（美国Corning公司，批 号：10-040-CV）；二甲基亚砜（德国Sigma公司，批号：Bp231）；结晶紫染色液（美国Fisher Scientific公司，批号：C581-25）；Protein Assay Dye Reagent Concentrate试剂（美国伯乐公司，批号：500-0006）；Transwell小室（美国BD公司，批 号：353097）；胎牛血清（HyClone公司，批 号：10-040-CV）；抗体波型蛋白（vimentin，批号：5741S）、N-钙黏蛋白（N-cadherin，批 号： 13116S）、E-钙黏蛋白（E-cadherin，批 号：3195S）、p-Smad2（批号：3108S）和Smad2/3（批 号：8685S）购自Cell Signaling公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号：sc-47724）、兔二抗抗体（批 号：sc-2040）及鼠二抗抗体（批号：sc-3752）购自Santa Cruz公司；VERU-111的合成基于先前发表的研究[14]，由美国田纳西大学药学研究室LI Wei教授团队提供。

1.1.3 细胞株

SKOV3和OVCAR3卵巢癌细胞株（美国模式培养物集存库）。

1.2 方法

前期研究[11]表明，VERU-111在OVCAR3中半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）为10.5 nmol/L，VERU-111在SKOV3中的IC₅₀为1.8 nmol/L。设置对照组，并用10、20、40 nmol/L的VERU-111分别处理卵巢癌细胞。10 nmol/L的VERU-111以便更好地观察接近IC₅₀的生物学效应，20 nmol/L的VERU-111可观察其对卵巢癌细胞更显著的抑制作用，40 nmol/L的VERU- 111确保能诱导明显的表型变化，以便更好地展示VERU-111的作用及其机制。

1.2.1 细胞培养

细胞培养基为含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素/青霉素的1640培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。

1.2.2 Western blotting实验

将细胞分为4组，分别为对照组、10 nmol/ L VERU-111处理组、20 nmol/L VERU-111处理组及40 nmol/L VERU-111处理组，细胞密度达90%时，用射频免疫沉淀测定裂解液提取蛋白，将1 μL蛋白加至1 mL Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate试剂中，采用Bradford法调整浓度后加入上样缓冲液，加热变性。每孔上样60~160 μg，电泳80 V，转膜20  V。封闭后，4℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1 h，洗膜后曝光检测EMT相关蛋白的表达。检测 TGF-β通路相关蛋白表达：将细胞分为对照组和6 ng/mL TGF-β处理组，分别在0、10、20 min采集细胞并提取蛋白。随后，按照上述方法进行蛋白定量，并调整浓度。蛋白样本加入上样缓冲液后加热变性，每孔上样60~160 μg，以80  V进行电泳，20 V转膜。封闭后，4℃孵育一抗（稀释比例1 ∶ 1 000）过夜，室温孵育二抗（稀释比例1 ∶ 1 000）1 h，洗膜后进行曝光检测TGF-β信号通路相关蛋白的表达。

1.2.3 MTT实验

胰酶消化细胞，制备细胞悬液，调整密度至2×10³个/孔，接种于4块96孔板。分别在24、48、72、96 h加入10 μL MTT试剂，避光孵育4  h后弃培养液，加入100 μL二甲基亚砜，避光摇匀10 min。在570 nm波长下测定吸光度（OD）值并进行统计分析。

1.2.4 细胞迁移实验

用磷酸盐缓冲液清洗卵巢癌细胞，消化后重悬于无血清培养基，离心后制备3×10⁴个/300  μL的悬液。加入Transwell小室培养。20  h后，用甲醇固定、结晶紫染色，并磷酸盐缓冲液洗涤2次，显微镜观察并拍照，使用Image J计数后分析。

1.2.5 细胞克隆实验

将SKOV3或OVCAR3细胞（300个/孔）接种于12孔板中，48 h后使用载体（二甲基亚砜）及VERU-111处理，每4 d更换1次培养基和药物；经过2周的处理后，使用甲醇固定细胞，并用0.5%结晶紫染色剂染色。通过显微镜观察克隆形态，并使用Image J计数后进行统计分析。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。符合正态或近似正态分布的数据以表示，并进行单因素方差分析。对于不符合正态分布的数据，采用中位数（M）表示，使用Kruskal-Wallis非参数检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VERU-111抑制了EMT相关蛋白的表达

与对照组相比，VERU-111低、中、高浓度处理组中EMT相关蛋白的表达均发生了变化：上皮标志蛋白E-cadherin表达上调，而间质标志蛋白N-cadherin和Vimentin表达下调（P＜0.05）。具体见图1。

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  图1 Western blotting检测OVCAR3及SKOV3细胞中EMT相关蛋白的表达

  Figure 1.Western blotting detection of EMT related proteins in OVCAR3 and SKOV3 cells

  注：A. OVCAR3细胞株； B. SKOV3细胞株；aP<0.05。

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2.2 VERU-111抑制卵巢癌细胞的增殖

MTT实验结果显示（图2），VERU-111处理组细胞的增殖能力明显低于对照组（P＜0.05）。

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  图2 MTT 检测OVCAR3和SKOV3细胞的增殖能力

  Figure 2.The proliferative capacity of OVCAR3 and SKOV3 cells determined by MTT

  注：A. OVCAR3细胞株；B. SKOV3细胞株；与对照组比较，aP<0.05。

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2.3 VERU-111处理后卵巢癌细胞克隆形成能力减弱

克隆形成实验结果显示（图3），与对照组相比，VERU-111处理组OVCAR3细胞及SKOV3细胞的克隆形成率明显降低、克隆团直径减小，且细胞排列松散（P＜0.05）。

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  图3 克隆形成实验检测OVCAR3和SKOV3细胞的克隆增殖情况

  Figure 3.Clonal proliferation of OVCAR3 and SKOV3 cells determined by clone formation assay

  注：A. OVCAR3细胞株；B. SKOV3细胞株；aP<0.05。

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2.4 VERU-111处理后卵巢癌细胞迁移能力降低

Transwell实验结果显示（图4），与对照组相比，VERU-111有效降低了OVCAR3细胞的迁移能力，且随着药物浓度的增加，其抑制作用成梯度依赖性增强（P＜0.05）。

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  图4 细胞迁移实验检测OVCAR3细胞的迁移能力的变化

  Figure 4.Changes in migration capacity of OVCAR3 cells detected by cell migration assay

  注：aP<0.05。

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2.5 VERU-111抑制Smad介导的TGF-β通路

Western blotting实验结果显示，与对照组相比，VERU-111处理组细胞p-Smad2表达显著下降（P ＜0.05），而total-Smad2/3表达无明显变化（P ＞ 0.05）。提示VERU-111可能通过调控Smad 蛋白的磷酸化过程抑制TGF-β通路，从而抑制卵巢癌细胞EMT过程（图5）。

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  图5 经VERU-111处理后OVCAR3及SKOV3细胞中p-Smad2及total-Smad2/3的蛋白表达变化

  Figure 5.Changes in expression of p-Smad2 and total-Smad2/3 in OVCAR3 and SKOV3 cells after treatment with VERU-111

  注：A. OVCAR3细胞株；B. SKOV3细胞株；aP<0.05。

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3 讨论

卵巢癌因起病隐匿，超过75%的女性患者确诊时已为晚期阶段，治疗难度大且预后较差[15]。研究表明，VERU-111在多种癌症中发挥不同的生物学作用[5-11, 16]，包括抗增殖和诱导凋亡[16]、抗血管生成[17]、克服化疗耐药性[6]和良好的生物利用度[18]的特点。这些特性使其成为潜在的抗肿瘤药物，并为卵巢癌治疗研究提供了新的思路。本团队前期研究表明，VERU-111在卵巢癌变中具有抑制作用，对卵巢癌细胞的增殖和转移有明显抑制作用，表明其潜在的卵巢癌治疗应用前景[11]。然而，VERU-111的具体抗癌机制尚不清楚，仍需进一步研究。

EMT是癌细胞失去上皮表型（如细胞间连接和机制）并获得间质表型（如增强的迁移和能力）的一个过程，该过程是卵巢癌侵袭、转移及耐药的重要生物学过程[19]。通过赋予细胞间质特性和增强迁移能力，EMT加速了肿瘤的进展与恶化。深入研究EMT的分子机制，不仅能够揭示卵巢癌的核心驱动因素，还能为靶向治疗提供新策略。EMT涉及多条信号通路，如TGF-β、蛋白激酶B、Notch、细胞外调节蛋白激酶和Wnt/连环蛋白等[20]。其中，TGF-β信号通路通过诱导G1期细胞周期停滞和EMT发挥重要作用[21]。通过抑制EMT或逆转已发生的EMT，可有效降低肿瘤细胞的生长，提高化疗强度[22]。因此，研究EMT对卵巢癌的影响具有重要意义，其不仅是揭示卵巢癌转移机制的关键环节，还为探索抗转移策略和开发潜在治疗靶点提供了重要方向。

实验结果表明，与对照组相比，VERU-111显著影响了卵巢癌细胞中EMT相关蛋白的表达。具体来看，上皮标志物E-cadherin的表达显著上调，而间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达明显下调。E-cadherin[23]是维持上皮细胞间粘附力的重要分子，其表达的上调表明细胞间粘附力增强；而N-cadherin[24]和Vimentin[25]与细胞的迁移性和侵袭性密切相关，二者表达的下调反映了这些能力的显著削弱。VERU-111能够有效逆转EMT过程，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。Western blotting实验分析显示，VERU-111 显著降低了细胞中p-Smad2的表达水平，而total-Smad2/3的蛋白表达未发生显著变化。上述结果提示VERU-111 主要通过抑制Smad2的磷酸化，阻断TGF-β信号通路的活化，进而抑制EMT的发生与发展。TGF-β信号通路是 EMT 诱导的重要机制，其活性的降低有效阻断了肿瘤细胞迁移和侵袭的关键分子通路。细胞功能实验进一步验证了这些分子变化的生物学效应。MTT实验结果显示，VERU-111显著抑制了卵巢癌细胞的增殖；迁移实验结果表明，VERU-111显著降低了卵巢癌细胞的迁移能力；克隆形成实验则表明，VERU-111能有效减少细胞克隆的数量和大小，进一步确认了其对细胞增殖的抑制作用。

尽管本研究揭示了VERU-111通过调控 TGF-β信号通路抑制EMT的机制，但仍存在一定局限性。例如，本研究未涉及VERU-111在耐药卵巢癌细胞中的作用，其对耐药性的影响尚不明确。未来研究可进一步探索VERU-111在耐药细胞中的作用机制，评估其是否具有克服耐药性的潜力，为卵巢癌的精准治疗提供新的研究方向。此外，进一步的研究将有助于评估 VERU-111在不同卵巢癌亚型中的应用价值，为其临床转化奠定更坚实的实验基础，从而改善患者预后。

综上所述，VERU-111通过调控TGF-β/Smad信号通路，逆转EMT相关分子表达变化，具体表现为增强E-cadherin 表达和降低 N-cadherin、Vimentin的表达，从分子和功能两个层面抑制卵巢癌细胞的迁移和增殖。这一发现为卵巢癌的诊疗提供了新的潜在靶点，并为基于 TGF-β/Smad通路和EMT 调控的治疗策略的开发提供了重要理论依据，具有显著的临床转化意义。

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