目的  对凌霄花治疗小鼠心衰后心脏损伤的疗效及作用机制进行研究。

方 法   取30只小鼠随机分成假手术组、模型组、凌霄花组3组，对模型组和凌霄花组小鼠进行主动脉弓缩窄造成心衰模型。造模后凌霄花组灌胃10 mg/kg的凌霄花总黄酮提取物，假手术组及模型组灌胃等量生理盐水，持续灌胃1个月后对3组小鼠的心脏功能、蛋白相对表达量、病理切片、血生化指标、炎性因子、细胞凋亡等情况进行比较分析。

结果  与模型组相比，凌霄花组显著改善心衰小鼠心功能，表现为射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）、心输出量（CO）显著提升，左室前壁（LVAW）和左室后壁（LVPW）厚度及心脏重量/胫骨长度比（HW/TL）显著降低（P＜0.05）；凌霄花组蛋白激酶B（Akt）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白相对表达量较模型组显著升高，Smad、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达显著降低（P＜0.05）；凌霄花组心肌细胞排列趋于规整，炎症细胞减少，胶原纤维沉积显著减轻；凌霄花组Notch同源物1（NOTCH1）、Split多毛增强子1（HES1）、磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）、转化生长因子-β（TGF-β）表达水平均低于模型组（P＜0.05）；血生化检测显示，凌霄花组血清中丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）及促炎因子白细胞介素（IL）-6水平显著降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性及抗炎因子IL- 10、内皮标志物CD31表达显著升高（P＜0.05）。

结论  凌霄花通过激活PTEN/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路抑制心肌凋亡，阻断TGF-β/Smad信号减轻纤维化，具有心脏保护潜力，为中药抗心衰治疗提供实验依据。

心力衰竭作为心脏泵血功能失代偿的终末阶段，其病理机制涉及多重代偿与失代偿的动态演变过程。长期压力负荷过载可引发心肌适应性肥厚，表现为心肌细胞体积增大、纤维增粗及收缩力增强，这种代偿机制虽能暂时维持正常循环，但伴随心肌耗氧量增加和相对供血不足，最终导致心肌细胞凋亡、电生理紊乱及能量代谢障碍 [1-3]。值得注意的是，心室重构的核心病理改变—心肌纤维化，源于心脏成纤维细胞在转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等促纤维化因子刺激下过度活化，导致细胞外基质异常沉积和瘢痕组织增生[4-5]。这种病理性修复过程受多重信号通路调控，包括促进凋亡的B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相关X蛋白（associated X protein，Bax）与抗凋亡Bcl-2的平衡调控，以及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路对细胞生长、代谢的调节作用[6]。近年来研究发现，Notch同源物1/Split多毛增强子1（Notch homolog/hairy and enhancer of Split 1，NOTCH1/HES1）信号通路在心肌重构中发挥重要作用，其通过调控细胞增殖分化参与纤维化进程。同时，α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）作为肌成纤维细胞活化的标志物，其持续表达与纤维化进展密切相关[7]。在分子层面，TGF-β1/Smad信号级联反应通过激活Smad2/3等下游介质，促进胶原蛋白合成，而CD31作为内皮标志物的动态变化则反映血管新生与炎症清除的平衡状态[8-9]。这些发现为寻找干预靶点提供了新方向。

中医药在改善心功能方面展现独特优势，现有临床常用药物如附子、黄芪通过增强心肌收缩力发挥作用，芪苈强心胶囊等复方制剂则体现多靶点调控特点[10]。其中，凌霄花作为传统活血化瘀中药，其总黄酮成分被证实具有抗氧化应激、抑制炎症因子释放及调节细胞凋亡等作用。基础研究显示，凌霄花提取物可通过改善微循环障碍减轻心肌缺血，其黄酮类成分对肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6等炎症介质具有显著抑制作用[11-12]。特别值得注意的是，动物实验发现凌霄花能下调心肌组织TGF-β1表达水平，提示其可能干预心肌纤维化关键通路[13]。但现有研究多集中于血管扩张效应，对其在压力超负荷性心衰中的保护机制，特别是对心肌细胞凋亡与纤维化通路的调控作用尚未阐明。

基于此，本研究拟建立压力超负荷诱导的心衰小鼠模型，系统评价凌霄花提取物对心功能参数及心室重构的影响。通过检测心肌组织Bcl- 2/Bax比值、PI3K-Akt通路活化状态及TGF-β1/Smad信号转导变化，结合α-SMA、CD31等组织学标记物分析，旨在揭示凌霄花抗心肌纤维化的分子机制，为拓展中药在心衰治疗中的应用提供实验依据。该研究不仅有助于阐明传统中药的现代化作用机理，更为开发具有多靶点干预特性的抗心衰药物奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Vevo 3100LT小动物超声成像系统（加拿大VisualSonics公司）；DZKW-17-2酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；DXR3激光共聚焦仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；FL1000超灵敏多功能成像系统（杭州申花科技有限公司）；ABI Veriti 96荧光定量PCR仪（上海木森生物科技有限公司）；BX53显微镜（日本奥林巴斯）。

1.2 主要药品与试剂

凌霄花（产地：天津）购自亳州市三淞堂药业有限公司，经济宁医学院药学院刘玉凤副教授检验符合《中国药典（2020年版）》相关规定；戊巴比妥钠（上海依赫生物科技有限公司，批 号：20221011）；多聚甲醛（天津奥普升化工有限公司，批号：20230124）；二甲苯（北京高纯科技有限公司，批号：20220914）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术股份有限公司，批 号：R0010-20230601）；苯甲基磺酰氟（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20230306）；磷酸酶抑制剂（上海源叶生物科技有限公司，批号：20220701）；高效切片石蜡（上海华永石蠟有限公司，批号：20230102）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司，批号：20211214）；MASSON染色试剂盒（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20221005）；天狼猩红染色试剂盒（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：20221121）；脱蜡液（无锡市江原实业技贸总公司，批号：20230425）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，批 号：20221125）、丙二醛（malondialdehyde，MDA批号：20230230）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH，批 号：20230215）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST，批 号：20230426）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：20221230）；反转录试剂盒（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：20230119）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 动物

昆明小鼠30只，清洁级，体重20~26 g，鼠龄2~3个月，雌雄均可，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20190003。动物饲养于济宁医学院SPF级动物房，采用饲养环境明暗12 h循环，温度22~25℃，相对湿度50%~70%。本实验经济宁医学院动物伦理委员会批准[伦理审批号：JNMC-2022-DW-081]。

1.4 方法

1.4.1 凌霄花总黄酮提取

凌霄花中总黄酮类物质的提取采用水提醇沉法[14]。取凌霄花干燥花朵1 000 g，用粉碎机粉碎成细粉，将粉碎后的药材置于容器中，加入10倍量（10 L）的蒸馏水，室温浸泡6 h，将浸泡后的药材连同浸泡液一并转移至提取罐中，进行2次热回流提取。第1次加热回流提取1.5 h，提取温度控制在85~90℃，提取结束后，趁热用4层纱布过滤，收集滤液；第2次向滤渣中加入8倍量的蒸馏水，加热回流提取1.5 h，提取温度同上；过滤，合并2次滤液。将预处理后的洗脱液进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/5左右，浓缩液中缓慢加入95%乙醇，边加边搅拌，使溶液中乙醇浓度最终达到80%以上。将混合液置于4℃冰箱中静置24 h促进杂质沉淀；静置完成后，用抽滤装置过滤，收集滤液，弃去沉淀，将滤液进行减压浓缩，回收乙醇，即得凌霄花总黄酮提取物200 mL（总黄酮的含量为1.28 mg/mL）。

1.4.2 小鼠心衰模型建立及给药方法

30只小鼠随机均分为3组，即假手术组、模型组、凌霄花组。所有小鼠于手术前1天禁食，配制0.3%戊巴比妥钠（现配现用），按0.2 mL/10 g腹腔注射麻醉；待小鼠呼吸平稳，肌肉松弛，钳夹后肢无反应，角膜反射消失后即麻醉成功；将其仰卧于小鼠手术台上并固定好四肢和上颚。小鼠心衰模型的建立采用主动脉弓缩窄方法[15]。将小鼠仰卧于手术台上并固定好四肢和上颚。模型组和凌霄花组小鼠剪开小鼠颈、胸部皮肤，在左上胸骨边缘第二肋间隙处建立切口；插入胸部牵开器以扩宽创口，便于后续操作；分离胸腺与暴露主动脉弓：在扩宽的创口内，小心分离胸腺，以暴露主动脉弓及其分支；主动脉弓穿线与结扎：使用6-0线对主动脉弓部进行穿线，并在穿线后打结；将26G垫针放置于主动脉旁，并扎紧线结；快速并轻柔地取出针头，以获得直径约为0.4 mm的狭窄，使主动脉保持65%~70%的收缩。术后，鼠笼内垫保温毯，观察呼吸和活动情况。造模完成第2天行心脏彩超检测，射血分数（ejection fraction，EF）＜50%表示心衰造模成功。假手术组小鼠接受与模型组、凌霄花组完全相同的外科手术流程，包括麻醉、开胸、主动脉弓暴露与分离等操作，未进行缩窄，最终缝合伤口。造模成功后凌霄花组灌胃凌霄花总黄酮提取物（10 mg/ kg，0.3 mL），假手术组和模型组灌胃等量的生理盐水（0.3 mL），1次/d，持续1月。有6只建模小鼠意外死亡，因此将建模成功且存活的14只小鼠随机分为模型组和凌霄花组，且考虑到3组样本的均衡性，故每组最终纳入分析的小鼠数量各为7只。

1.4.3 样本收集与处理

小鼠称重后，经眼球取血用于血生化检测。随后采用颈椎脱臼法处死小鼠，立即沿胸骨正中线快速剪开胸腔（约30 s内完成），暴露心脏；迅速剪断连接的大血管，完整摘取心脏；将取出的心脏立即浸入预冷的PBS缓冲液中，轻柔挤压冲洗以去除残留血液；用滤纸吸干心脏表面液体后，精确称量全心脏湿重；随后分离胫骨，清除附着肌肉组织后，精确测量其长度。心脏称重与胫骨长度测量旨在计算心脏重量/胫骨长度比（heart weight/tibia length，HW/TL），作为评估心脏肥大的客观形态学指标。

心脏样本处理：将心脏沿矢状面纵向剖开。取一半（通常包含左心室等关键区域）立即置于4%多聚甲醛或10%中性福尔马林缓冲液中固定24~48 h，用于后续石蜡包埋、组织切片制备（HE染色、Masson染色、天狼猩红染色等病理学分析）。将另一半心脏组织或剩余部分迅速置于液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱长期保存，用于后续分子生物学检测（如Western blotting、实时荧光定量反转录PCR等）或生化指标测定。

1.4.4 心脏彩超检测

小鼠禁食24 h后胸口脱毛，进行异氟烷吸入麻醉后，仰卧固定，B超和M超探头垂直接触小鼠心脏，观察心脏跳动情况，检测EF、左室短轴缩短率（fractional shortening、FS）、心输出量（cardiac output，CO）、舒张期左室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness，LVAW）、收缩期LVAW、舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPW）、收缩末期LVPW。

1.4.5 Western blotting检测

将适量的RIPA裂解液预冷至4℃，并根据需要添加PMSF和磷酸酶抑制剂。取20 mg心脏组织，用生理盐水和PBS冲洗干净，吸干表面液体，放入离心管；按照1 ∶ 10的比例添加RIPA裂解液进行匀浆，观察无明显组织块后，在冰上孵育30 min；10 000×g离心10 min，收集上清液作为蛋白提取物；然后在96孔板中加入标准蛋白和待测蛋白（每种蛋白设置2个副孔），摇匀后在37℃孵育30 min；采用酶标仪在562 nm测定吸光度（OD）值，计算样品蛋白浓度；然后清洗并准备玻璃板，灌胶后进行电泳；使用湿转法进行蛋白转膜，用特定孔径的PVDF膜；膜用5%脱脂奶粉的缓冲液封闭2 h，随后在4℃孵育一抗（稀释比例1 ∶ 3 000）过夜，用TBS-T洗涤后孵育二抗（稀释比例1 ∶ 800）1.5  h，再次洗涤，最后加入ECL混合液，利用化学发光仪进行显影。

1.4.6 病理组织观察

HE染色：取心脏组织，组织立即投入到固定液中固定24 h（固定液用量大于组织10倍），洗涤、脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋后切片，切片脱蜡及水化，最后进行染色、切片脱水、透明和封片。MASSON染色：将心脏石蜡切片放置在60℃烘箱中120 min脱蜡，浸染，分化，经95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，二甲苯透明后用中性树胶封片。天狼猩红染色：将心脏石蜡切片用天狼猩红染色液滴染1 h后用自来水冲洗，在无水乙醇中脱水，用二甲苯透明，中性树胶封片。所有染色后的切片均使用显微镜进行图像采集，对采集的数字图像使用Image J软件进行定量分析。

1.4.7 实时荧光定量反转录PCR检测

将冰冻的心脏组织解冻，用眼科剪剪取少于0.1 g的组织，加入1 mol/L Trizol匀浆；将匀浆转入新的EP管，加入200 μL氯仿，剧烈震荡后静置10 min，15 984×g、4℃离心15 min，取上清；加入等量异丙醇，轻轻混匀，静置20 min，再离心，弃上清；加入700 μL 75%乙醇洗涤，15  984  ×g、4℃离心5 min，弃去上清，风干至沉淀边缘略透明，加入去离子水溶解RNA。定量后使用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，并进行荧光定量PCR，具体样品量按5 μL Mix+2  μL引物+1 μL cDNA。采用2-∆∆CT公式计算，引物序列见表1。

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  表格1 引物序列

  Table 1.The primer sequences

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1.4.8 血清中MDA、SOD测定

按照试剂盒说明书，测定MDA时，设空白管和标准管以消除标准品无水乙醇的影响。将空白管、标准管、测定管和对照管加入血清样品后混匀，95℃水浴80 min，冷却至室温后在2  000×g、5℃条件下离心10 min；取上清，用酶标仪在532 nm波长下检测OD值。根据公式计算血清中MDA含量：MDA含量=（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）×标准浓度（10  nmol/ mL）×稀释倍数。

测定SOD时，取20 μL待测小鼠血清，用蒸馏水稀释5倍至100 μL后混匀，加入样品，室温放置10 min；然后将混合液在96孔板中点样，每孔20 μL，于550 nm波长下测定OD值，计算小鼠SOD活性。

1.4.9 免疫荧光检测

石蜡切片后复温，用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）充分浸泡样本，微波炉中低火加热修复，保持微沸状态5 min，用0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min；封闭液蛋白的选择原则与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，从而保证后续荧光染色的特异性。用抗体稀释液将一抗（稀释比例1 ∶ 100）孵育后洗脱，用抗体稀释液稀释荧光二抗（稀释比例1 ∶ 200）后洗脱，然后进行封片，置于显微镜下观察获取荧光图像。

1.5 统计学分析

采用Gradpad Prism 9.5.0软件分析作图，用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料先进行齐性检验，经正态性检验符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠HW/TL检测

HW/TL是评估心脏肥大程度的重要指标。本研究通过测定该比值，探究凌霄花对心脏损伤的影响。与假手术组相比，模型组小鼠HW显著增加，HW/TL显著升高（P＜0.05），符合心衰模型的标准，表明心衰模型构建成功。相较于模型组，凌霄花组的HW低于模型组，凌霄花组小鼠HW/ TL显著降低（P＜0.05），提示凌霄花干预可有效减轻心脏肥大程度。具体见图1和图2。

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  图1 小鼠HW与TL检测结果（n=7）

  Figure 1.The detection result of HW and TL in mice (n=7)

  注：aP<0.05。

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  图2 小鼠HW/TL检测结果（n=7）

  Figure 2.The detection result of HW/TL in mice (n=7)

  注：aP<0.01。

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2.2 小鼠心脏彩超分析

图3的M超检查结果显示，EF＜50%，表明心衰造模成功。与假手术组小鼠相比，模型组其EF、FS、CO显著降低，LVAW、LVPW显著升高（P ＜0.05）；与模型组小鼠比较，凌霄花组其EF、FS、CO显著降低升高，LVAW、LVPW显著降低（P＜0.05）（图4）。说明凌霄花可以增加心肌收缩力，提高心功能，对心力衰竭的治疗有一定的疗效，为凌霄花治疗心血管疾病提供新思路。

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  图3 小鼠的M超图

  Figure 3.The M-ultrasound images of mice

  注：A. 假手术组；B. 模型组；C. 凌霄花组。

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  图4 小鼠心脏彩超心功能统计结果（n=7）

  Figure 4.The statistical results of cardiac function in three groups of mice (n=7)

  注：aP＜0.05，bP＜0.01。

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2.3 心脏组织相关蛋白水平表达情况

Western blotting结果表明，与假手术组相比，模型组Akt、Bcl-2蛋白表达显著降低，Smad、Bax显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，凌霄花组Akt、Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低（P＜0.05），Smad蛋白表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。具体见图5。

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  图5 小鼠蛋白表达结果（n=7）

  Figure 5.The protein expression results of mice (n=7)

  注：aP＜0.05，bP＜0.01。

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2.4 病理切片结果

HE染色后，假手术组小鼠细胞饱满，细胞核呈椭圆形且完整，排列紧密整齐；模型组可见细胞数量较假手术组减少，具有细胞凋亡现象，产生炎性细胞，排列不规则；凌霄花组细胞分布较模型组致密，可见炎性细胞减少，与模型组对比分布紧凑且清晰，伴有少量细胞浸润（图6）。

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  图6 HE染色图（100×）

  Figure 6.The HE staining diagram (100×)

  注：A. 假手术组；B. 模型组；C. 凌霄花组。

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MASSON染色后，假手术组血管壁周围可见少量胶原纤维（呈现蓝色），但属于正常范围；模型组心脏组织内有大量蓝色胶原纤维沉积，表明胶原纤维较多，梗死面积很大，纤维化较严重；凌霄花组仍能见少量蓝色纤维胶原沉积，但较模型组有所改善（图7）。

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  图7 MASSON染色图（100×）

  Figure 7.The MASSON staining diagram (100×)

  注：A. 假手术组；B. 模型组；C. 凌霄花组。

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天狼猩红染色后，假手术组少见红色的胶原纤维，细胞核完整。模型组心脏组织内有较多红色胶原纤维沉积且着色较深，纤维化严重；凌霄花组见少量红色纤维胶原沉积，与模型组比较，假手术组与凌霄花组小鼠心肌胶原容积比均显著降低（P＜0.05）。具体见图8和图9。

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  图8 天狼猩红染色图（100×）

  Figure 8.The sirius crimson staining of cardiac tissue (100×)

  注：A. 假手术组；B. 模型组；C. 凌霄花组。

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  图9 小鼠心脏染色胶原容积比（n=7）

  Figure 9.The stained collagen volume ratio in mouse heart (n=7)

  注：aP＜0.05。

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2.5 PCR结果

模型组NOTCH、HES1、PTEN、TGF-β的mRNA表达水平与假手术组相比显著升高（P ＜0.05）；凌霄花组NOTCH、HES1、PTEN、TGF-β的mRNA表达水平均较模型组显著降低（P ＜0.05）。具体见图10。

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  图10 小鼠mRNA表达结果（n=7）

  Figure 10.The mRNA expression results of mice (n=7)

  注：aP＜0.05。

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2.6 小鼠血清中LDH、AST、MDA、SOD水平比较

当发生心肌损伤时，心肌细胞会破裂，其中LDH和AST会释放到血液中。检测血浆中两者的水平，反映心肌损伤的程度[16]。与假手术组相比，模型组小鼠血清内LDH、AST水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，凌霄花组血清中LDH、AST水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比，凌霄花组小鼠MDA水平显著降低（P ＜0.05），SOD活力水平明显显著升高（P ＜0.05）。具体见图11。

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  图11 小鼠血清中LDH、AST、MDA、SOD水平检测结果（n=7）

  Figure 11.The detection results of LDH, AST, MDA, and SOD levels in mouse serum (n=7)

  注：*P<0.05。

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2.7 免疫荧光检测结果

免疫荧光染色发现，与假手术组相比，模型组小鼠CD31、IL-10表达水平显著降低（P＜0.05），α-SMA、IL-6表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，凌霄花组小鼠CD31、IL-10表达显著升高（P＜0.05），α-SMA、IL-6表达水平显著降低（P＜0.05）。具体见图12。

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  图12 小鼠心脏组织中CD31、α-SMA、IL-10、IL-6水平检测结果（n=7）

  Figure 12.The detection results of CD31, α-SMA, IL-10, and IL-6 in mouse heart tissue (n=7)

  注：aP＜0.05，bP＜0.01。

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3 讨论

心衰是许多心脏疾病的最终归宿，当心脏前负荷增大时，进一步演化成心肌肥厚、心室重构、心肌纤维化等生理病理改变，最终造成心衰[17]。心脏损伤的发展过程与氧化应激、炎性反应、细胞凋亡、纤维化、线粒体损伤等多种分子机制有关。针对心衰方面的心脏疾病治疗中，传统中医药具有疗效确切、不良反应少的应用优势一直广受关注，临床上用于治疗心脏疾病的中药不断丰富，所以找到一种疗效好、易得的抗心脏损伤的药物具有重大的临床意义[18]。中药凌霄花中总黄酮成分具有抗炎、抗氧化、防治心血管系统疾病、抑菌、抗肿瘤等多种作用，但关于治疗心衰的作用未见报道，本研究针对凌霄花黄酮类提取物对心衰小鼠的治疗作用进行研究，为临床治疗提供依据。

发生心衰时伴随着抗凋亡分子Bcl-2在心肌细胞中的表达下降，促凋亡分子Bax分子表达上升，导致心室重构。研究表明PTEN/PI3K/Akt通路调控细胞凋亡，影响细胞的增殖，激活Bax或Bcl-2。Western blotting结果显示，模型组Bcl-2蛋白相对表达量低于假手术组，其Bax蛋白相对表达量高于假手术组；凌霄花组Bcl-2蛋白相对表达量高于模型组，其Bax蛋白相对表达量低于模型组。组织中Akt蛋白是促进细胞存活的蛋白，经检测发现，模型组Akt蛋白相对表达量低于假手术组，凌霄花组Akt相对表达量高于模型组。PCR结果表明，模型组PTEN mRNA表达水平高于假手术组，凌霄花组PTEN mRNA表达水平低于模型组。故凌霄花可以通过PTEN/PI3K/Akt信号通路，抑制PTEN对PI3K的作用，同时促进PI3K磷酸化，激活下游信号Akt高表达，启动保护机制，使细胞存活。

细胞纤维化的发生也同样促进心衰[19]。CD31反映内皮细胞组织的存在，在血管的生成中起重要作用。α-SMA是肌纤维母细胞标志蛋白，可用于评估心间质纤维化损伤程度[20]。在纤维化进展过程中，间质成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，表现为α-SMA呈高水平表达[21]。通过免疫荧光发现，模型组CD31荧光强度低于假手术组，其α-SMA荧光强度高于假手术组；凌霄花组CD31荧光强度高于模型组，其α-SMA荧光强度低于模型组。通过Western blotting检测发现，模型组Smad蛋白相对表达量高于假手术组，凌霄花组Smad蛋白相对表达量低于模型组。PCR检测发现，模型组TGF-β mRNA表达水平高于假手术组，凌霄花组TGF-β mRNA表达水平低于模型组。当心衰发生后，激活TGF-β/Smad信号通路，诱导肌成纤维细胞合成、分泌，激活下游Smad蛋白并使其发生核移位，诱导上皮细胞间质转化，导致上皮细胞丧失附着力并向肌成纤维细胞转化，在此过程中α-SMA水平特异性提高[22]。高水平表达能分泌大量胶原，加快系膜细胞产生细胞外基质，同时对细胞外基质降解有抑制作用，表现为间质纤维化及不可逆转的心功能损害[23-24]。通过天狼猩红染色发现，模型组细胞之间胶原纤维沉积明显多于假手术组，且心肌纤维化较明显。与模型组比较，凌霄花组小鼠心肌细胞排列规整，胶原纤维分布明显比模型组减少，心肌纤维化有所减轻。HE染色发现，假手术组小鼠心肌细胞排列整齐致密，细胞结构完整，心肌纤维排列整齐，边界清晰，未见坏死、炎性细胞浸润；模型组心肌细胞紊乱，细胞坏死和炎症细胞浸润程度增大；凌霄花组上述现象则有所减轻。

综上，凌霄花治疗心衰的作用机制主要通过多通路调控实现：通过PTEN/PI3K/Akt信号通路发挥抗心肌细胞凋亡作用，下调PTEN表达以解除其对PI3K的抑制，激活PI3K磷酸化并上调下游促存活蛋白Akt，进而增加抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达、减少促凋亡蛋白Bax表达，抑制心肌细胞凋亡，改善心室重构；靶向TGF-β/Smad信号通路抑制心肌纤维化，下调TGF-β及其下游Smad 蛋白表达，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，减少α-SMA 阳性细胞及胶原纤维沉积，减轻间质纤维化；同时可能通过NOTCH/HES1通路或其他抗炎途径调控氧化应激与炎症反应，提升机体抗氧化酶活性，降低促炎因子水平，减轻心肌细胞氧化损伤与炎症浸润。其中，PTEN/PI3K/Akt 通路在心肌缺血-再灌注损伤等模型中已被证实与细胞存活调控密切相关，TGF-β/Smad 通路过度激活是心肌纤维化的核心机制之一，阻断该通路可显著改善心衰患者的心功能，NOTCH 信号通路在心血管疾病中参与调控炎症细胞活化，其抑制剂已被证实可改善心肌肥厚。通过上述多靶点协同作用，凌霄花黄酮类提取物可综合改善心肌损伤，为心衰治疗提供新的药物选择。

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