目的  通过酯键将透明质酸与瑞巴派特进行偶联，制备透明质酸-瑞巴派特偶联物，改善瑞巴派特的溶解性，将透明质酸的保湿作用与瑞巴派特的促黏蛋白分泌作用相结合，以期实现对干眼症的协同治疗。

方法  使用羰基二咪唑活化瑞巴派特，将活化后的瑞巴派特与透明质酸进行酯化反应得到透明质酸瑞巴派特偶联物。通过核磁共振氢谱、红外光谱以及紫外光谱对偶联物的结构进行表征，将偶联物溶解在水中，并采用紫外分光光度法测定偶联物中瑞巴派特的含量与溶解度。

结果  不同的投料比可获得不同瑞巴派特含量的偶联物，当瑞巴派特含量为（5.73±0.10）%时，其粒径为（159.68±1.20）nm，Zeta电位为（-18.82±0.37）mV，当瑞巴派特含量为（6.02±0.05）%时，其粒径为（210.86±3.50）nm，Zeta电位为（-22.59±0.22）mV。随着瑞巴派特含量的增加，纳米颗粒的粒径也随之变大。形成偶联物后瑞巴派特在水中的溶解度最高为（0.60±0.07）mg/mL。

结论  本试验所制备的透明质酸瑞巴派特偶联物，可有效提高瑞巴派特在水中的溶解度，高取代度的偶联物能够形成粒径均一的纳米颗粒，进一步扩展瑞巴派特在眼用制剂中的应用。

瑞巴派特（rebamipide，Reb）是由日本大冢制药公司合成并开发的一种新型喹诺啉酮类衍生物[1]。1990年，大冢制药公司开发的Reb片（商品名：Mucosta®）在日本上市，用于治疗胃溃疡和急慢性胃炎[2]。在对Reb作用机制的进一步研究中发现，Reb还能促进角膜黏蛋白样糖蛋白的表达[3]。基于这些研究结果，大冢制药公司将Reb开发成混悬滴眼液（商品名：Mucosta®）于2012年1月在日本上市用于干眼症的治疗。但由于该制剂属于混悬型滴眼液，使用过程中会导致患者的视力模糊，此外高浓度的药物含量还会刺激眼表，导致泪液分泌过多，因此在使用过程中患者的用药依从性较低[4-5]。Reb的结构式见图1。

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  图1 Reb的结构式

  Figure 1.The structural formula of Reb

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透明质酸（hyaluronic acid，HA），是一种生物相容性优异的酸性黏多糖（结构式见图2）。由于其特殊的理化性质和生理功能，HA被广泛应用于眼科、骨科、化妆品等多个领域[6]。HA特有的流变学性质和极佳的生物相容性，使得HA在滴眼液中既可以延长药物的作用时间还能提高药物的生物利用度[7-10]。本试验所制备的HA-Reb偶联物（HA-Reb）创新性地结合了两种药物各自的特点。利用HA溶液所具有的假塑性，使得HA-Reb在眼表滴注时，患者可以通过其生理性的眨眼反应将药物均匀涂布在眼表，在停止眨眼时，HA的黏度又会恢复，进而延长药物在眼部的作用时间[11-12]。另外HA能够减少眼表水分的蒸发[13]。本试验所制备的HA-Reb通过酯键将Reb偶联在HA大分子上，提高了Reb的水溶性，同时结合HA对干眼症的治疗作用共同发挥两者在干眼症治疗中的作用，以期实现HA和Reb对干眼症的协同治疗。

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  图2 HA的结构式

  Figure 2.The structural formula of HA

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1 材料与方法

1.1 主要仪器

XA105DU型电子天平和MS204TS/02电子天平购自瑞士梅特勒-托利多公司；HBM CLASSIC单磁力加热搅拌器（上海小聪科技有限公司）；Agilent 8454紫外分光光度计（美国安捷伦公司）；AV500M核磁共振仪（德国布鲁克）；NicoletIS-50型傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；BeNano 90 Zeta 纳米粒度及Zeta电位分析仪（丹东百特）；JEM-1200EX 透射电子显微镜（日本电子公司）。

1.2 主要药品与试剂

Reb（批号：YWN5H-HH，纯度98.0%）、羰基二咪唑（批号：RVNYL-EM）和4-二甲氨基吡啶（批号：HTDCI-OX）均购自梯希爱上海化成工业发展有限公司；HA（山东焦点福瑞达生物股份有限公司，批号：24061802，纯度98.0%）；无水二甲基亚砜（北京百灵威科技有限公司，批号：LO60V66）；氢氧化钠（批号：20241125）、溴化钾（批号：20231117）和无水乙醇（批号：20241009）均购自国药集团化学试剂有限公司；磷钨酸染液（北京中镜科仪技术有限公司，批号：23012607）；水为纯化水。

1.3 方法

1.3.1 HA-Reb的合成

称取1 112.4 mg的Reb置于圆底烧瓶中，加入无水二甲基亚砜溶解，向其中加入437.8 mg羰基二咪唑，室温避光反应30 min。称取370.8 mg的HA溶于30 mL无水二甲基亚砜中，加入上述烧瓶中，最后加入36.35 mg的4-二甲氨基吡啶于40℃避光反应24 h。反应结束后，用乙醇沉淀，6 010×g离心10 min后收集沉淀，用纯化水溶解产物再次使用乙醇沉淀离心，将沉淀物进行真空干燥即得HA-Reb。取偶联物10 mg左右溶解于1 mL的纯化水中，观察偶联物的溶解状态，并使用粒度仪检测溶液中微粒的粒径。HA-Reb的合成路线见图3。

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  图3 HA-Reb的合成路线

  Figure 3.The synthetic route of HA-Reb

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1.3.2 Reb与HA-Reb最大紫外吸收波长的扫描

分别称取适量的Reb和HA-Reb，用1 mg/mL的NaOH溶液溶解后，进行最大吸收波长扫描，确定Reb与HA-Reb的最大吸收波长。

1.3.3 Reb标准曲线的制备

Reb易溶于NaOH溶液中，因此以1 mg/mL的NaOH溶液为介质，配制Reb标准曲线。精密称取约10.0 mg的Reb，置于200 mL量瓶中，加入1 mg/mL的NaOH溶液进行溶解、定容，即得对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用1 mg/mL的NaOH溶液稀释并定容。在330 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标（X，μg/mL）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

1.3.4 HA-Reb中Reb含量及溶解度的测定

精密称取约10.0 mg的HA-Reb，置于10  mL量瓶中，用1 mg/mL的NaOH溶液溶解并稀释至刻度，即为供试品溶液。将供试品溶液于328 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线计算供试品溶液中Reb的含量（W）及偶联物中Reb的含量（C）：

式中A为吸光度；M为HA-Reb的质量（mg）。

1.3.5 HA-Reb红外光谱的测定

取5.0 mg左右的HA-Reb，与15 mg左右的溴化钾置于玛瑙研钵中共同研磨，将研磨后的粉末干燥后压片并使用红外光谱仪采集样品的红外吸收光谱

1.3.6 HA-Reb核磁共振氢谱的测定

称取10.0 mg左右的HA-Reb溶解于400 L的氘代二甲基亚砜与200 μL氘代水混合溶剂中，于25℃采集HA-Reb的核磁共振氢谱。

1.3.7 HA-Reb的表征

称取100.0 mg左右的HA-Reb溶解于2 mL的纯化水中，取1 mL置于纳米粒度及Zeta电位分析仪中进行粒径以及Zeta电位的测定。将50  μL的HA-Reb溶液滴于电镜铜网上，静置20 min后滴50 μL磷钨酸染液进行负染，使用滤纸从铜网背面吸取液体，将铜网置于红外烤灯下干燥5 min，采用透射电镜观察HA-Reb的形态。

2 结果

2.1 HA-Reb的合成

Reb用羰基二咪唑活化后与HA反应，采用4-二甲氨基吡啶作为催化剂，使Reb与HA之间形成酯键，从而得到HA-Reb。通过改变Reb与HA之间的比例可以获得不同Reb含量的HA-Reb（表1），当Reb ∶ HA上升至2 ∶ 1时，偶联物中的Reb含量变化较小，且随着Reb比例增加，HA-Reb的水溶性变小，Reb ∶ HA为1 ∶ 1时，得到的偶联物溶于水后呈现乳光，检测粒度时发现形成了组装纳米颗粒，其粒径为（159.68±1.20）nm，PDI为0.197±0.012，Zeta电位为（-18.82±0.37）mV，粒径均匀，呈负电荷。随着Reb比例增加，偶联物纳米粒子的粒径也随之变大（图4），Zeta电位也随之升高（图5）。通过透射电镜图观察到偶联物形成规则的球形纳米颗粒，随着投料比的增加，偶联物纳米颗粒的粒径逐渐增大（图6）。

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  表格1 不同投料比制得HA-Reb的溶解性及粒度表征（n=3）

  Table 1.The characterization of solubility and particle size of HA-REB prepared with different feeding ratios (n=3)

  注：PDI为多分散系数（polydispersity index）；N/A表示未检测。

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  图4 HA-Reb的粒径分布

  Figure 4.The size distribution of HA-Reb

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  图5 HA-Reb的Zeta电位

  Figure 5.The Zeta potential of HA-Reb

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  图6 HA-Reb的透射电镜图

  Figure 6.The transmission electron microscopy image of HA-Reb

  注：A. 投料比1 ∶ 1；B. 投料比2 ∶ 1。

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2.2 HA-Reb的结构表征

从偶联物的核磁共振氢谱中可以看到Reb的特征吸收峰（图7），证明Reb成功地被偶联在了HA上，通过比较Reb特征峰b与HA的特征峰a之间的积分面积可知Reb的取代度，由于Reb的取代度在5%左右，其特征峰信号与基线噪音信号接近，无法准确计算出Reb的取代度，需使用紫外分光光度计对Reb的含量进行准确定量。HA与Reb结构中不存在酯键，通过对偶联物的红外光谱分析可以观察到偶联物在1 744.3  cm^-1处有强烈的酯键伸缩振动吸收峰（图8），也证明了Reb与HA以酯键的形式进行了偶联，且偶联物在328 nm处出现了Reb的紫外特征吸收峰（图9），进一步证明成功合成了偶联物。

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  图7 HA-Reb的核磁共振氢谱图

  Figure 7.The 1H NMR spectrum of HA-Reb

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  图8 HA-Reb、HA与Reb的红外吸收光谱图

  Figure 8.The FT-IR spectrum of HA-Reb, HA and Reb

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  图9 Reb与HA-Reb的紫外吸收图谱

  Figure 9.The UV absorption spectrum of Reb and HA-Reb

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2.3 HA-Reb的含量及溶解度的测定

Reb、HA-Reb在1 mg/mL的NaOH溶液中的紫外吸收扫描图谱见图7。结果表明，HA-Reb的紫外吸收峰位置并无变化，与Reb一致，均在229 nm和328 nm处有最大吸收峰，以328 nm处的最大吸收峰来计算Reb含量。Reb的线性回归方程为：Y=0.015 5X+0.01（r=1.000 0），Reb在10.0~50.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。不同投料比下偶联物中Reb的含量见表1，根据偶联物的溶解度及偶联物中Reb的含量计算出Reb的溶解度为（0.60±0.07）mg/mL。

3 讨论

使用羰基二咪唑为活化剂、以4-二甲氨基吡啶为催化剂，可以将Reb偶联在HA上得到HA-Reb。当Reb投料比较低时，Reb偶联的数量较少，偶联物大分子整体的疏水性较弱，因此Reb可以借助HA的高水溶性溶解在水中。随着Reb投料比的升高，偶联物中的疏水部分逐渐增加，当偶联物溶于水时，偶联物中的疏水部分通过疏水作用相互聚集，形成纳米颗粒。由于疏水的Reb通过酯键与亲水的HA相互偶联在一起，因此当疏水性的Reb相互聚集时，HA作为纳米颗粒的外壳能够以静电作用以及空间位阻作用阻碍疏水性Reb的进一步聚集，从而形成Zeta电位为负电荷的稳定纳米颗粒，透射电镜图中可以清晰地看到偶联物纳米颗粒呈现完整的球形。

Reb作为治疗干眼症的药物，其水溶性较差，上市制剂为混悬滴眼液，滴眼后易产生不适感。HA-Reb可以提高Reb的水溶性，并且HA本身也是玻璃体的组成成分，其生物相容性优异。此外HA还具有剪切变稀的流变特性，滴眼后不易产生因眨眼而导致的黏腻感。重要的是HA作为一种治疗干眼症的大分子保湿剂，可以在滴眼后快速缓解眼睛干涩的不适感，Reb从偶联物水解下来后可以在眼表发挥作用，促进黏蛋白分泌黏液，从而更加长久地缓解眼干眼涩症状。因此将两者以化学键结合在一起得到的HA-Reb在干眼症的治疗中具有良好的应用前景，有望做到协同治疗干眼症的效果。

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