目的  探讨中药红景天鞣质（RHTs）对APP/PS1转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠认知障碍的保护作用及分子机制。

方法  将48只APP/PS1小鼠随机分为模型组、RHTs高[150 mg/（kg·d）]、中[100 mg/（kg·d）]和低[50 mg/（kg·d）]剂量组，另设12只同月龄野生型小鼠作为正常对照组；RHTs各剂量组每天给予相应剂量的RHTs进行灌胃干预，正常对照组与模型组则每天给予等量生理盐水，持续干预4周。干预结束后，通过Morris水迷宫实验评估AD小鼠的空间学习记忆能力，采用HE染色观察海马组织病理变化，利用免疫荧光染色检测海马区Aβ_1-42和p-Tau416蛋白的表达，并运用Western blot技术检测磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p62、Beclin 1及微管相关蛋白轻链3（LC3）等蛋白的表达水平。

结果  与正常对照组相比，模型组小鼠的平台潜伏期和游泳路程显著增加（P＜0.05），穿越平台次数和目标象限停留时间显著减少（P＜0.05）；海马CA1区神经细胞排列疏松，胞核缩小且数量减少；海马中Aβ_1-42和p-Tau416的荧光表达水平明显升高（P＜0.05）；同时，海马组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及p62蛋白表达显著上调，而Beclin 1和LC3的表达水平明显下降（P＜0.05）。经不同剂量RHTs干预后，上述各项指标均出现显著回调。

结论  RHTs可改善APP/PS1转基因AD小鼠的认知障碍与神经元病理损伤，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路、增强细胞自噬，从而促进Aβ和磷酸化Tau蛋白清除有关。本研究为AD防治靶点筛选及中药RHTs的临床开发应用提供了实验依据与理论基础。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以记忆衰退和认知功能障碍为主要症状的神经退行性疾病[1]。目前针对AD发病机制存在多种学说，主流观点认为是β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）的过度积聚和脑内Tau蛋白的异常磷酸化导致神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）进而损伤神经细胞所致[2]。AD在中医学属呆病和健忘等范畴，中医学多认为其病位在脑，肝肾亏虚，髓虚脑空为主要病机，故中医临床辨证论治一般以补肾填精为主[3]。然而，AD发病机制十分复杂，目前尚未见有效治疗药物问世，因此，继续开发和寻找安全有效的AD防治策略迫在眉睫。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种主要参与细胞存活、生长和代谢调控的胞内信号传导经典通路 [4]。研究表明，该信号通路激活后可抑制细胞自噬，在调控神经细胞自噬过程中扮演重要角色[5]。近年来，自噬功能障碍与AD发病关系已被阐释确切，众多研究证据显示，在AD临床患者和疾病动物模型脑内均发现伴随自噬失调[6]。一般认为，促进或激活自噬可抑制Aβ的聚集和阻遏Tau蛋白的磷酸化，而自噬功能受损则会加剧AD发病。此外研究表明，AD发病进程中伴随PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化及其介导的自噬异常[5]，因此，从靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路视角出发进而调控细胞自噬不失为一种临床AD防治重要策略。

中药红景天，又名“天赐草”，为景天科植物大花红景天（Rhodiola rosea L.）的干燥根和根茎，主产于西藏、 四川、吉林等地[7]。红景天始载于藏医经典著作《四部医典》，为常用藏药，其气味芳香，味微苦涩后甜；入心、脾、肺、肝经，具有补脾益气、益精养血之效[8]。现代药理学研究表明，红景天具有强大的抗氧化特性，具有抗凋亡、改善认知等重要作用[9]。进一步研究表明，红景天主要的药理活性物质基础为苷类和鞣质类成分，且红景天鞣质（Rhodiola rosea tannin，RHTs）还可下调PI3K/Akt/mTOR信号通路[10]。然而，目前关于RHTs是否可以通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬进而以缓解AD认知障碍，尚未见详细报道。因此，本研究拟以APP/PS1转基因小鼠为研究对象，探讨RHTs调控PI3K/Akt/mTOR信号通路改善AD小鼠认知障碍的分子机制，为AD防治提供更多新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

JE1002电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；SMV-3500涡旋混匀仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Neofuge 15R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）；SWE-C7研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；ZF-630组织切片机（上海嘉鹏科技有限公司）；嘉鹏BETS-M1脱色微型圆周摇床（上海嘉鹏工业科技有限公司）；MEDVWM Morris水迷宫（上海赞德医疗器械有限公司）；BX53M奥林巴斯荧光显微镜（Olympus）；MV-10CBS电泳及转模装置（江苏米立特科学仪器有限公司）；JS-6000全自动凝胶成像分析系统（上海培清科技有限公司）。

1.2 主要药物与试剂

红景天饮片（浙江省中药材有限公司饮片厂，产地：浙江金华，批号：202412137）经武汉大学药学院汤俊教授鉴定为景天科大花红景天Rhodiola L.的干燥根和根茎；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（武汉百仟度生物科技有限公司，批号：BH0001）；荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamdino-2-phenylindole，DAPI，批号：BB363ES50）、ECL超敏发光液AB液（批号：KR0003）和蛋白裂解液（批号：BB-2301）购自武汉科瑞生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：S0051）；Aβ_1-42（批号：25312-1-AP）和p-Tau416（批号：24954-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；PI3K（批号：A4453）、p-PI3K（批号：A15664）、Akt（批号：A2466）、p-Akt（批号：A15622）、mTOR（批号：A21242）、p-mTOR（批号：A5459）、p62、Beclin 1（批号：A17622）、LC3（批号：A11120）和β-actin（批号：AP1452）抗体均购自美国Affinity公司。

1.3 动物

48只SPF级6月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠（体质量25~28 g）与12只同月龄、同性别C57/6J小鼠（体质量25~28 g）均购自于武汉鼠来宝生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0010。动物饲养于武汉大学同仁医院SPF级动物房，饲养过程中温度维持在21~25℃之间，湿度控制在50%~70%，期间所有小鼠均可自由饮水、进食。本实验经武汉大学同仁医院动物伦理委员会批准（伦理批件号：SY2023-024）。

1.4 方法

1.4.1 RHTs的制备

精密称取红景天饮片10 g，粉碎，加入20 L 70%丙酮溶液作为溶剂，室温浸泡过夜；随后将药材转移至蒸馏烧瓶中，于55℃下回流提取两次，每次0.5 h，合并滤液并趁热过滤，减压浓缩除去丙酮后，过HPD-400大孔吸附树脂柱，先用水清洗柱子，再用70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液并于50℃下减压浓缩，最后经冷冻干燥制得RHTs精制提取物，冻干分装后于4℃密闭保存备用[11]。

参照《中国药典（2025年版）》[12]采用磷钼钨酸-干酪素比色法测定精制提取物中RHTs的含量，测得结果为64.63%，所得样品保存于干燥密闭容器中备用。

1.4.2 动物分组及给药

待各组小鼠经1周适应性饲养后，将48只APP/PS1转基因AD小鼠按数字随机法分为4组：模型组、RHTs高剂量组（H-RHTs）、中剂量组（M-RHTs）和低剂量组（L-RHTs），每组12只；另设12只野生型小鼠作为正常对照组（Ctrl）。实验期间，Ctrl组与模型组每日灌胃适量生理盐水，H-RHTs、M-RHTs和L-RHTs组则分别灌胃150、100、50 mg/（kg·d）的RHTs药物[7]。实验持续4周，期间详细记录各组小鼠的毛发状况、活动行为、饮水及摄食情况。

1.4.3 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验包括定位航行和空间探索两个模块。实验装置采用直径120 cm的标准圆形水池（水深约40 cm），池内第三象限水面下1.5 cm处设置一个直径10 cm的隐藏平台。①定位航行试验持续5 d，每天分为上午和下午两个时段进行。每次将小鼠随机从4个象限之一的起始点面朝池壁放入水中。系统自动记录其逃避潜伏期，即从入水至首次登上隐藏平台（位于水面下1 cm处）所需时间。若小鼠在120 s内未能找到平台，则由实验人员引导其至平台并让动物停留30 s，以强化空间记忆。②空间探索试验于第6天进行：撤除平台后，将小鼠随机从某一象限放入池中，记录其在60 s内的游泳轨迹。通过分析小鼠在目标象限的停留时间、穿越原平台位置的次数以及运动轨迹特征，评估其空间记忆保持能力。整个实验过程使用EthoVision软件进行视频跟踪与数据分析。

1.4.4 海马组织HE染色

采用轮转式切片机制备5 μm连续切片，经石蜡包埋后于60℃恒温烘箱中烤片，随后依次进行二甲苯脱蜡和梯度酒精水化处理，并用蒸馏水洗净。接着使用苏木精染色细胞核15 min，自来水冲洗后以1%盐酸酒精镜检分化，并迅速转入1%氨水酒精中返蓝判断染色效果。再以伊红染色3 min，70%酒精冲洗后，依次经梯度酒精和二甲苯脱水透明至切片呈无色透明状。最后将切片取出，经梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，并进行镜检。

1.4.5 免疫荧光检测

取小鼠石蜡切片，经二甲苯常规脱蜡、梯度酒精水化及抗原修复后，置于PBS缓冲液中清洗3次（每次5 min），弃去组织周围PBS，加入组织封闭液室温封闭1~2 h。随后加入一抗（稀释比例1 ∶ 500），于4℃冰箱中孵育过夜后回收一抗，再用PBS缓冲液清洗3次（每次5 min）。接着加入二抗（稀释比例1 ∶ 10 000），室温孵育1 h，PBS清洗3次后滴加DAPI染色稀释液对细胞核进行染色。以滤纸吸干切片残留液体，滴加抗褪色剂封片，最后通过荧光显微镜采集图像，并采用Image-Pro Plus 6.0软件对阳性信号进行分析。

1.4.6 蛋白免疫印迹检测

将小鼠脑组织称重后，按比例加入RIPA蛋白裂解液，充分研磨并离心，取上清液进行BCA法定量蛋白含量。取适量蛋白样品，加入5%溴酚蓝，煮沸10 min，分装后于-80℃保存备用。将凝胶固定于电泳装置并浸入电泳缓冲液，每孔加样20 μL，在160 V、200 mA条件下电泳45 min。电泳结束后进行转膜，参数设置为190 V、400 mA，持续60 min。转膜完成后用5%脱脂牛奶在室温下慢摇封闭1 h，TBST漂洗3次。加入一抗（稀释比例1 ∶ 500）并于4℃孵育过夜，次日回收一抗，TBST再次洗涤3次（每次15 min）。随后加入二抗（稀释比例1 ∶  5 000），常温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次（每次15 min），再与HRP标记二抗室温孵育2 h。最后滴加ECL工作液进行曝光拍照，使用Image J软件测定目标条带灰度值，并计算指标灰度值与内参灰度值的比值。

1.5 统计学分析

使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行数据分析，结果以表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），成对比较使用LSD检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠生理状况比较

与Ctrl组相比，模型组小鼠表现出性情暴躁、易怒和较强的攻击性，毛发黯淡、干枯粗糙且易脱落；而与模型组相比，经RHTs干预后的小鼠狂躁和易怒状态有所改善，攻击性呈减弱趋势，毛发色泽更为光鲜。此外，在整个饲养期间，各组小鼠的饮水和进食均无显著变化，且未出现死亡现象。

2.2 各组小鼠Morris水迷宫实验结果

在定位航行实验中，与Ctrl组相比，模型组小鼠寻找逃生平台的潜伏期显著延长（P＜0.05），整体游泳路程也明显增加（P＜0.05）；而与模型组相比，RHTs干预组小鼠的平台潜伏期和游泳总路程均显著缩短（P＜0.05）。在空间探索试验中，与Ctrl组相比，模型组小鼠的穿越平台次数和在目标象限停留时间均显著减少（P＜0.05）；而与模型组相比，各剂量RHTs给药组小鼠的穿越平台次数和目标象限停留时间均显著增加（P＜0.05）。具体见表1和图1。

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  表格1 各组小鼠Morris水迷宫定位巡航和空间探索能力比较（x ± s，n=12）

  Table 1.Comparison of the ability of place navigation and spatial exploration in the Morris water maze among mice in each group (x ± s, n=12)

  注：与Ctrl组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

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  图1 各组小鼠Morris水迷宫定位航行、空间探索实验运动轨迹图

  Figure 1.Movement trajectory diagrams of each group of mice in the Morris water maze place navigation and spatial exploration experiments

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2.3 各组小鼠海马组织CA1区HE染色结果

通过对小鼠脑组织HE染色结果的分析可见，Ctrl组海马CA1区细胞结构完整、排列整齐且核染色清晰；而模型组小鼠海马CA1区神经元数量显著减少，并伴有神经元排列紊乱及核固缩等病理改变，表明疾病模型小鼠海马神经元损伤严重。进一步观察发现，经连续4周RHTs干预后，各组小鼠海马CA1区病理损伤均有所改善，具体表现为细胞结构更清晰、排列趋于紧密，核固缩现象减少。以上结果提示，RHTs能够减轻APP/PS1小鼠海马组织的病理损伤。具体见图2。

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  图2 各组小鼠海马组织HE染色结果（100×）

  Figure 2.HE staining results of hippocampal tissue in mice from each group（100×）

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_{2.4 各组小鼠海马CA1区Aβ1-42、p-Tau416表达结果}

免疫荧光结果显示，Aβ_1-42与p-Tau416在正常小鼠脑内表达较低；与Ctrl组相比，Aβ_1-42和p-Tau416在模型组小鼠海马CA1区中表达明显增加（P＜0.05）；而与模型组相比，RHTs组中组Aβ_1-42、p-Tau416阳性表达细胞明显降低（P ＜0.05）。具体见图3和图4。

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  图3 各组小鼠海马组织Aβ1-42免疫荧光染色结果（100×）

  Figure 3.Immunofluorescence staining results of Aβ1-42 in the hippocampus of mice in each groupc (100×)

  注：与Ctrl组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

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  图4 各组小鼠海马组织p-Tau416免疫荧光染色结果（100×）

  Figure 4.Immunofluorescence staining results of p-Tau416 in the hippocampus of mice in each group (100×)

  注：与Ctrl组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

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2.5 小鼠海马PI3K/Akt/mTOR及自噬相关通路蛋白表达水平结果

与Ctrl组相比，模型组小鼠海马区中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著升高，而Beclin 1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低（P ＜0.05）；与模型组相比，RHTs干预组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达均出现不同程度下降，同时Beclin 1蛋白表达水平及LC3- Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调，差异均具有统计学意义（P ＜0.05）。具体见图5。

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  图5 各组小鼠海马组织PI3K、Akt、mTOR及自噬相关通路蛋白表达结果

  Figure 5.Expression results of PI3K, Akt, mTOR, and autophagy-related pathway proteins in the hippocampus of mice in each group

  注：与Ctrl对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05。

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3 讨论

随着老龄化和少子化进程的加剧，我国AD发病率正在不断上升。最新资料显示，我国65岁及以上人群中痴呆发病率已达5.14%，其中AD发病率为3.21%，是继心血管疾病、肿瘤和卒中之后引起老年人致死的第四大原因[2]。与此同时，尽管规范化的药物治疗如胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂以及新近获批上市的抗淀粉样蛋白抗体阿杜那单抗等，可一定程度改善AD临床症状，但其作用仍显不足，且存在较多毒副作用，临床应用十分受限[5-6]。而中医药具有辨证施治之优势，针对AD其疗效确切持久，不良反应较少，已成为近年来AD防治研究热点。故本研究探讨了中药红景天鞣质对AD的防治作用和分子机制。

Morris水迷宫是一种常用于评估啮齿类动物空间学习与记忆能力的经典行为学测试方法；本研究通过该实验对AD小鼠的学习记忆水平进行了考察[13]。结果显示，与正常小鼠相比，APP/PS1模型小鼠经RHTs连续灌胃治疗4周后，其逃避潜伏期和运动总距离均显著缩短，而目标区域停留时间和穿越次数均明显增加，表明RHTs可能有助于改善AD小鼠的空间探索与记忆能力。

AD的主要病理特征通常表现为Aβ沉积形成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的NFTs[4]。本研究采用HE染色评估APP/PS1小鼠海马组织神经退行性病变程度，结果显示RHTs处理组中海马锥体细胞排列更紧密，神经细胞形态趋于正常，核固缩现象明显减少。进一步的Aβ_1-42和p-Tau416组织免疫荧光实验表明，经连续4周RHTs治疗后，AD小鼠海马CA1区内Aβ_1-42及p-Tau416蛋白表达均显著下降，说明APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积和Tau蛋白过度磷酸化等病理变化得到有效改善。

PI3K/Akt信号通路是细胞信号传导过程发挥重要作用的一种分子传递途径，广泛存在于以神经元为主的神经细胞之中，在细胞生存、转移、代谢及炎症因子募集等方面具有重要的调控功能 [14]。在神经退行性疾病发病进程中，PI3K/Akt主要参与神经细胞的增殖、分化、自噬及突触可塑性调节等生理活动[15]。研究表明，在AD脑内，PI3K/Akt通路的活化可促进错误折叠蛋白质的生成以及减缓Tau蛋白磷酸化过度聚集[16]。现有证据表明，许多中药复方或中药单体均可通过干扰PI3K/Akt信号通路的组成与调控以修复神经细胞损伤，并改善AD学习记忆障碍[14-17]。mTOR是PI3K/Akt通路下游关键效应分子，可直接参与调控细胞自噬。因此，本研究使用蛋白印迹方法检测了RHTs对小鼠PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化形式的蛋白表达水平变化，结果表明经RHTs治疗后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的蛋白表达水平均显著下降，提示RHTs可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路。

激活细胞自噬可以加快受损神经细胞的功能恢复，为进一步探讨RHTs在自噬调控和保护AD过程中的具体作用，本研究运用蛋白印迹检测了自噬相关蛋白p62、Beclin 1和LC3。研究结果显示，RHTs可以明显降低APP/PS1小鼠脑内p62的表达水平，并显著提高Beclin 1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。文献[18-19]表明，p62作为经典的细胞自噬底物，具有高度特异性，自身表达含量与自噬水平通常呈负相关；Beclin 1是自噬正向核心调控因子之一，主要参与自噬活动的启动，其表达水平通常与自噬强度呈正相关[20]。而LC3则为公认的自噬发生关键标志物，当自噬启动和发生增强时，LC3-Ⅰ经酶解掉小段肽段被修饰成膜型自噬体LC3-Ⅱ，随着自噬小体的不断增多，LC3-Ⅱ的表达含量也会随之增加，一般以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值评估自噬活动强弱。因此，上述结果表明，RHTs可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路并介导自噬激活，进而发挥AD防治作用。

此外，本研究也存在一些不足之处，比如缺乏细胞药理实验验证，同时也尚未开展针对PI3K/Akt/mTOR信号通路的干预处理实验。因此，后续实验条件允许情况下，可通过转录组测序及结合KEGG富集分析等实验进一步对本研究中的PI3K/Akt/mTOR信号通路与自噬等靶分子进行验证。

综上所述，RHTs可以修复AD小鼠的认知受损，其作用机制可能与下调PI3K/Akt/mTOR信号通路，诱导神经细胞自噬，进而延缓Aβ及磷酸化Tau的聚集有关。本研究有望明确RHTs抗AD的分子作用机制，为中药红景天的进一步开发利用提供更多新思路，具有临床指导意义。同时，为促进RHTs作为AD候选治疗药物的开发，还需加强对其药代动力学和安全性等更为全面的研究和探索。

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