目的  基于转化生长因子β1（TGF-β1）/SMAD家族成员3（Smad3）信号通路探讨黄芪多糖对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的影响。

方法  将AC16心肌细胞随机分为空白组、模型组、黄芪多糖组、阳性对照组。除空白组，其余各组用阿霉素（1 μmol/L）刺激构建心肌细胞损伤模型，黄芪多糖组（50 μmol/L黄芪多糖）和阳性对照组（10 μmol/L厄贝沙坦）处理细胞24 h，用CCK-8法检测细胞活力；Western Blot法检测各组AC16细胞中TGF-β1受体1（TGF-βR1）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白Ⅰ（collagen-Ⅰ）蛋白的表达；流式细胞仪检测AC16心肌细胞凋亡。

结果  与空白组相比，模型组细胞的增殖能力降低，TGF-βR1、p-Smad3、α-SMA、collagen-Ⅰ蛋白表达水平以及细胞凋亡水平显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，黄芪多糖组和阳性对照组细胞增殖能力升高，TGF-βR1、p-Smad3、α-SMA、collagen-Ⅰ蛋白表达水平以及细胞凋亡水平下降（P＜0.01）。各组间Smad3蛋白表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。

结论  黄芪多糖能够降低TGF-βR1、p-Smad3蛋白表达水平，减少细胞凋亡，改善阿霉素所致的心肌损伤，减轻心脏毒性。

心力衰竭（heart failure，HF）是由心脏结构或功能异常引起的一种复杂临床综合征。作为各种心血管疾病的终末阶段，HF患病率高、存活率低，且对患者生活质量有深远影响，给社会带来了沉重的医疗负担[1]。HF的临床综合征可由多种病理生理变化引发，包括心肌缺血和梗死、压力或容量超负荷、代谢失调、肌节蛋白功能的遗传扰动以及对病毒感染的反应[2]。研究发现心肌细胞纤维化是HF发生的主要因素，会引起心肌细胞肥大和细胞凋亡，最终导致HF[3-4]。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种促纤维化细胞因子，SMAD家族成员3（Smad3）为TGF-β1在心肌纤维化发病机制中的关键介质，是TGF-β1的主要下游信号转导[5-6]。近年来，研究发现TGF-β1/Smad3信号通路在心脏纤维化中起着重要作用[7-8]。

一项动物研究表明，TGF-β1和磷酸化的Smad3（p-Smad3）在心肌梗死大鼠中升高，阻断TGF-β1/Smad3轴可以恢复心脏功能并减轻心肌纤维化[9]。多项研究表明，TGF-β1/Smad3信号通路参与HF的发生发展[10-11]。因此，靶向TGF-β1/Smad3信号通路已成为HF的潜在治疗策略。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，研究发现黄芪多糖能够通过抗心肌细胞凋亡、抗氧化应激、抗心肌纤维化等药理作用来保护心肌损害[12]。另一研究发现黄芪多糖可以通过调控TGF-β1/Smad信号通路来改善纤维化[13]。本研究通过建立心肌细胞损伤模型，探究黄芪多糖能否可以通过调控TGF-β1/Smad3信号通路对心肌细胞发挥保护作用，以期为明确黄芪多糖治疗HF提供有效性证据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

HeracellTM Vios 160i二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技）；Infinite® 200 PRO酶标仪（帝肯）；Experion电泳仪（伯乐）；FACSAria Fusion流式细胞仪（碧迪）。

1.2 主要药品与试剂

黄芪多糖（上海源叶生物科技有限公司，货 号：B20562，纯度：98%）；阿霉素（doxorubicin，DOX，上海麦克林生化科技股份有限公司，货号：D796842，纯度：98%）；厄贝沙坦片（赛诺菲制药有限公司，规格：0.15 g，批号：DA312）；胎牛血清（货号：A5256701）和达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM，货号：11966025）购自美国Gibco公司；抗体：TGF-β受体1（TGF-β receptor 1，TGF- βR1，货号：EpR20923-13）、Smad3（货号：RLM3123）、p-Smad3（货号：RLP0585）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，货号：60004-1-Ig）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，货号：14395-1-AP）、胶原蛋白Ⅰ（collagen-Ⅰ，货号：67288-1-Ig）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（货号：A0208）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（货 号：A0216）、细胞凋亡检测试剂盒（货 号：CC1052）均购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS，货号：G4202-100ML）、RIPA裂解液（货 号：G2002-30ML）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货 号：G2026-200T）、含EDTA的胰蛋白酶（货号：G4001-100ML）、Binding Buffer（1×）（货号：G3005-1L）均购自赛维尔生物公司。

1.3 细胞

人心肌细胞AC16细胞系（中国科学院上海生科院细胞资源中心，货号：TCH-C119）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养、分组及处理

使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养AC16心肌细胞，将其置于温度恒定为37℃、CO2浓度维持在5%且湿度饱和的恒温密闭式细胞培养箱内，开展常规的细胞培养操作以及传代流程，待细胞密度长至80%~90%左右，取对数生长期细胞用于后续实验。为筛选出适用于后续实验的DOX给药浓度，将细胞分别暴露于不同浓度（0、0.1、0.5、1、1.5、2 μmol/L）的DOX中，作用时长设置为24 h与48 h，将0 μmol/L作为空白组。采用CCK-8法对细胞增殖情况进行检测，从而确定最佳的DOX损伤浓度及作用时间。将AC16细胞随机分为4组：空白组、模型组、黄芪多糖组和阳性对照组。除空白组外，其余各组细胞采用1 μmol/L DOX刺激以构建心肌细胞损伤模型。心肌细胞损伤模型建立后，使用不同浓度的黄芪多糖（0、12.5、25、50、100 μmol/L）作用于AC16细胞24 h及48 h，CCK-8检测细胞活力并筛选黄芪多糖最佳干预浓度，阳性对照组在DOX刺激的同时给予10 μmol/L厄贝沙坦进行干预[14]，处理时间均为24 h。

1.4.2 CCK-8法检测细胞活力

采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，将处于对数生长期的AC16细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔100  μL，24 h后按照组别给与相应处理，每组10个复孔，重复3次，待药物干预完成后向每孔加入10 μL的CCK8试剂，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育1.5 h，放置于酶标仪中，读取450 nm波长下的光密度（OD）值，并计算出各组的细胞活力，相对细胞活力计算公式为：（实验组平均OD值-空白组平均OD值） /（对照组平均OD值-空白组平均OD值），式中实验组为接受不同药物处理的各组细胞；对照组为未经药物处理的正常细胞组；空白组为不含细胞、但含有等体积培养基和CCK-8试剂的孔。

1.4.3 Western Blot法检测各组AC16细胞TGF-βR1、Smad3、p-Smad3、α-SMA及collagen-Ⅰ 蛋白的表达水平

采用Western Blot法检测相关蛋白表达，收集处理后的细胞，用预冷的PBS洗涤1~2次。吸弃PBS，每孔加入100 μL RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min。随后在4 ℃条件下3 000×g离心15 min，收集上清液并分装于1.5 m流式细胞仪LEP管中，置于-80℃保存。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对样品蛋白浓度进行测定，经SDS-PAGE电泳技术对样品蛋白进行分离操作。分离结束后将蛋白转印至PVDF膜上，用封闭液于室温条件下封闭处理2 h。随后，加入一抗（TGF-βR1、Smad3、p-Smad3、GAPDH、α-SMA、collagen-Ⅰ），稀释比例均为1 ∶ 2 000，在4℃环境中孵育过夜。次日，加入二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，稀释比例为1 ∶ 4 000），于室温下孵育60 min。再次洗膜后，使用ECL化学发光法显影曝光目的条带，使用Image J软件分析目的条带的灰度值，计算TGF-βR1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、collagen-Ⅰ蛋白的相对表达水平。

1.4.4 流式细胞术检测AC16心肌细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，模型建立成功后，将孔板中的培养液吸取至15 mL离心管，同时做好标记。用预冷的PBS轻柔洗涤细胞2次，加入1 mL含EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化。待细胞消化充分，通过吹打使细胞分散均匀，将所得细胞悬液连同之前的冲洗液，一同收集至对应的离心管，900×g离心3 min后弃上清液，重复操作2次。每组样本加入300 μL Binding Buffer（1×），使用移液枪充分重悬细胞并将其吸取至另一1.5 mL EP管。在EP管中加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后将EP管置于室温避光环境下孵育15 min。15 min孵育结束后，向EP管内加入5 μL PI染液，避光孵育5 min。最后，再检测前5 min添加200 μL Binding Buffer（1×）补足体系，轻轻混匀后，立即置于流式细胞仪中检测各组细胞凋亡率。采用流式细胞仪和FlowJo软件分析细胞凋亡。

1.5 统计学分析

所有数据使用GraphPad Prism 9.0.2统计软件进行分析，计量数据用表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用非配对单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度DOX对AC16心肌细胞增殖率的影响

使用不同浓度的DOX作用于AC16细胞24 h及48 h后均降低了AC16细胞的增殖，与空白组比较，1、1.5、2 μmol/L组下降更明显（P＜0.05），并且随着DOX给药浓度的升高，细胞增殖率逐渐降低，呈现出明显的浓度依赖性。研究结果表明在1 μmol/L DOX干预24 h后细胞存活率在60%左右效果最佳，因此选择1 μmol/L DOX干预24 h进行后续实验。具体见图1。

• 图1 不同浓度DOX分别作用24 h及48 h后AC16细胞的存活率（n=3）

  Figure 1.Survival rates of AC16 cells after 24 hours and 48 hours of treatment with different concentrations of DOX （n=3）

  注：与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01。

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2.2 黄芪多糖最佳干预浓度筛选

使用不同浓度的黄芪多糖作用于AC16细胞24 h及48 h后，25、50 μmol/L浓度组的细胞活力较空白组显著提升（P＜0.05），且呈浓度依赖性；100 μmol/L组活力回落。其中 50 μmol/L干预24 h后细胞活力提升最显著（保护效果最佳），故选择该浓度与干预时长开展后续实验。具体见图2。

• 图2 不同浓度黄芪多糖分别作用24 h及48 h后AC16细胞的增殖（n=3）

  Figure 2.Proliferation rate of AC16 cells after 24 hours and 48 hours of treatment with different concentrations of Astragalus polysaccharide (n=3)

  注：与空白组相比，aP<0.05，bP<0.01。

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2.3 各组AC16心肌细胞中α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-βR1、collagen-Ⅰ蛋白表达情况

用1 μmol/L DOX干预AC16细胞24 h后，使用黄芪多糖（50 μmol/L）和厄贝沙坦（10  μmol/ L）分别干预24 h后进行蛋白提取，Western Blot实验结果显示：相比于空白组，模型组中TGF- βR1、p-Smad3、α-SMA、collagen-Ⅰ蛋白表达水平均显著上调（P＜0.01）；与模型组比较，黄芪多糖组和阳性对照组中TGF-βR1、p-Smad3、α-SMA、collagen-Ⅰ蛋白表达水平均显著下调（P ＜0.01）；各组间Smad3蛋白表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。具体见图3。

• 图3 各组AC16心肌细胞α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-βR1、collagen-Ⅰ蛋白表达情况及蛋白相对表达量（n=3）

  Figure 3.Expression and relative expression levels of α-SMA, Smad3, p-Smad3, TGF-βR1, and collagen-I proteins in AC16 cardiomyocytes of each group (n=3)

  注：A. α-SMA、TGF-βR1、Smad3、p-Smad3、collagen-Ⅰ蛋白条带图；B~F. α-SMA、Smad3、p-Smad3、TGF-βR1及collagen-Ⅰ蛋白相对表达量；与空白组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01。

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2.4 各组AC16心肌细胞凋亡情况

用1 μmol/L DOX干预AC16细胞24 h后，使用黄芪多糖（50 μmol/L）和厄贝沙坦（10 μmol/L）分别干预AC16心肌细胞24 h，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。与空白组比较，模型组中细胞凋亡水平均显著上调（P ＜0.01）；与模型组比较，黄芪多糖组和阳性对照组中细胞凋亡水平均显著下调（P ＜0.01）。结果见图4。

• 图4 各组AC16心肌细胞凋亡水平（n=3）

  Figure 4.Apoptosis levels of AC16 cardiomyocytes in each group (n=3)

  注：A. AC16流式细胞图；B. AC16细胞的凋亡率；与空白组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

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3 讨论

HF是多种心血管疾病的终期阶段，死亡率高[15]。其发生通常源于心肌损伤和心肌结构和功能改变，最终导致心室充盈功能低下或泵血，其中纤维化成为组织僵硬和功能障碍的关键因素 [16]。目前HF的常规治疗方法包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、β阻滞剂等[17]。然而，由于即使按照官方指南的推荐进行治疗，心肌纤维化仍然持续存在，无法有效降低再住院率和死亡率[18]。因此，需要探索心肌纤维化的潜在病理机制，开发新的治疗药物，以提高HF患者的生存率和生活质量。近年来，大量研究证实中药和植物化学物质具有毒性小、治疗效果明显、生物相容性高、多靶点等优点，已被证明能够改善HF患者的症状和增强心脏功能，减少药物的不良反应，并在患者的预后中发挥积极作用[19]。尤其值得注意的是，在心肌纤维化进程中，α-SMA作为肌成纤维细胞活化的关键标志物，其表达上调直接促进细胞外基质过度沉积；而collagen-Ⅰ则是细胞外基质中最主要的纤维性胶原，其过度积累直接导致心肌僵硬度增加与舒张功能障碍[20]。因此，干预α-SMA与collagen-Ⅰ的表达已成为抗纤维化治疗的重要作用靶点。

TGF-β是HF发生发展的关键影响因子，作为一种多功能生长因子，参与调节发育、疾病和组织修复等多个关键过程。其作为TGF-β超家族的核心成员，TGF-β1被认为是纤维化发生的核心介质，在纤维化疾病中被激活和升高[21]。TGF-β1可与其受体TGF-βR1和TGF-βR2结合，调节细胞内信号转导并发挥多种生物学效应 [22]。TGF-βR1是TGF-β1不可替代的下游分子，参与细胞的整个生命周期，包括细胞运动、分化、吸附、裂变和死亡，缺乏TGF-βR1的突变细胞无法对TGF-β1作出反应，这会进一步影响TGF-β1信号转导通路的转导[23]。Smad3是心肌纤维化中TGF-β1信号通路的关键下游介质，其可被TGF-β1激活的TGF-βR1磷酸化并进入细胞核，从而介导靶基因的转录[24]。多项研究表明，TGF-β1/Smad3信号通路参与心衰的发生发展，且通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路可减轻心肌纤维化，减少细胞凋亡，从而阻止心衰的进展[25]。例如Li等[26]的研究中发现，吡非尼酮可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路来减轻压力超负荷诱导的心脏纤维化。在另外一项研究中，发现槲皮素可通过减弱TGF-β1/Smad3信号通路来预防大鼠心肌梗死后不良重构[27]。因此，本研究选择TGF-β1/Smad3通路上的TGF-βR1、Smad3、p-Smad3蛋白作为研究对象，旨在探讨黄芪多糖治疗HF的作用机制。本研究结果表明，DOX处理后AC16心肌细胞中TGF-βR1和p-Smad3蛋白表达水平均显著上调，提示DOX诱导的心肌细胞损伤与TGF-βR1和p-Smad3通路的异常激活密切相关；而黄芪多糖干预后，TGF- βR1和p-Smad3的表达水平明显降低，证实黄芪多糖可通过抑制该通路的过度激活，减少心肌细胞凋亡，进而减轻DOX所致的心肌毒性。

从中医理论角度分析，HF的病机演变与黄芪多糖的功效应用高度契合。中医认为心主身之血脉，因年老久衰、过劳少逸、内伤情志、外感病邪等病因可导致心体亏虚，心气不足难以推动心血运行，久而瘀血内生，日久血病累气，心气亏虚，最终导致气虚血瘀相互胶结而发为HF [28]。中医学从整体观念出发，立足于HF本虚标实的病机，根据不同临床症状给予益气活血、益气温阳、益气养阴等治疗方法，该法在改善患者症状及临床预后方面疗效确切且不良反应少[29]。作为甘温滋补药的代表，黄芪具有补气活血之效，常用于气血不足、正虚不固之证，契合HF“气虚血瘀”的病机核心。临床研究已表明，黄芪复方、加减方、中药制剂及联合西药可显著改善HF [30]，例如研究证实黄芪注射液联合西医治疗在改善心脏泵血功能、调节心肌损伤标志物及提升运动耐量等方面具有协同增效作用[31]，因此，深入研究黄芪的有效成分在心血管疾病防治领域具有显著的临床应用价值。黄芪多糖作为黄芪的主要活性成分，目前，黄芪多糖对心血管疾病的保护作用已有多项报道，表明黄芪多糖能够通过影响转录因子、黏附因子的表达，信号通路的激活抑制等方面，达到对心血管疾病的治疗作用[32]。例如Cao等[33]的研究表明，黄芪多糖可通过调节腺苷酸激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径，以缓解DOX诱导的大鼠心肌细胞损伤模型和HF模型小鼠的细胞过度凋亡，进而延缓HF的发生发展。在朱晓雨[34]的研究中发现，黄芪多糖可通过调控TGF-β1/Smads 信号通路缓解异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。本研究进一步证明，黄芪多糖对TGF-β1/Smad3 通路的调控作用，本质上是其“补气活血”功效在分子层面的具象化体现，即通过抑制通路异常激活减轻心肌纤维化，对应中医“活血” 以散瘀阻、改善心肌微循环；通过减少心肌细胞凋亡保护心脏功能，对应中医 “补气”以扶正气、修复受损心体，实现了中医理论与现代分子机制的有机结合。

综上所述，本研究提示黄芪多糖能够明显改善DOX所导致的心脏毒性，其机制可能与调控TGF-β1/Smad3信号通路来抑制心肌细胞凋亡有关，该研究为治疗HF提供了新的思路与参考。然而本研究仍存在局限性，黄芪多糖对HF的保护作用可能还涉及其他途径，且未探讨其对 TGF-β1/Smad3通路上下游其他分子的影响。后续研究需进一步开展动物体内实验及临床研究，明确黄芪多糖的最佳给药剂量和给药时机，并深入挖掘其多靶点协同作用机制。

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