目的  建立10批平纳蜜膏双波长指纹图谱，并结合化学模式识别方法，为其质量控制及标准制定提供依据。

方法  采用HPLC法，色谱柱为Shim Nex CS C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱，柱温为30 ℃，流速为1.0  mL/ min，检测波长为330 nm和245 nm，进样量为10 μL。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）对10批平纳蜜膏的HPLC色谱图进行分析，建立双波长指纹图谱。然后针对330 nm波长下的指纹图谱，进一步进行了聚类分析、主成分分析以及正交偏最小二乘法-判别分析。

结果  建立10批平纳蜜膏的HPLC双波长（330 nm与245 nm）指纹图谱，分别在两波长下标定13个与7个共有峰。通过与对照品对比，指认出咖啡酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、一枝蒿酮酸共5种成分，所有样品相似度均大于0.9。化学模式识别分析结果表明，10批样品可划分为3类，并筛选出峰2（咖啡酸）、峰10、峰1、峰3、峰6（蒙花苷）共5个差异性成分。

结论  本研究建立的双波长指纹图谱以及化学模式识别方法准确可靠，可为平纳蜜膏的质量标准研究提供重要的数据支持。

平纳蜜膏来源于维吾尔名老中医的临床经验方，由平纳、孜然、干姜、石榴子、一枝蒿、海螵蛸等10味药材制成，具有温胃散寒、清脑安神、制酸止痛、收敛散肿的功效，可用于治疗反流性食管炎患者的烧心、反酸、胸痛及胃胀、嗳气、恶心等症状[1]。现有质量标准涵盖了性状、装量、薄层鉴别、含量测定（酸碱滴定法）、微生物等项目，并未建立HPLC鉴别方法及含量测定方法。

指纹图谱是表征中药化学成分及特性的物质基础，因其具有全面性、高效性和稳定性的特点，所包含的化学信息更加全面，能更准确地反映中药的内在质量，故在中药鉴别、含量测定及质量控制等方面应用广泛[2-6]。为全面评价并控制平纳蜜膏质量，进一步完善其质量标准，本研究采用HPLC法构建了平纳蜜膏的双波长指纹图谱，以期为该制剂的后续成果转化奠定基础。本研究通过优化检测条件，在245 nm和330 nm两个波长下进行同步检测，并利用相似度评价系统结合化学模式识别方法，对双波长下主要色谱峰进行系统分析，筛选关键化学成分，从而建立了可靠的双波长指纹图谱检测方法，为平纳蜜膏的质量控制及相关标准研究提供了参考。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；Vanquish Core高效液相色谱仪（美国赛默飞）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世）；ME204T万分之一及ME55十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；XMTD-7000型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品咖啡酸（批号：110885-201703，纯度99.7%）、蒙花苷（批号：111528-202414，纯度94.6%）、木犀草素（批号111520-202107，纯度96.3%）、芹菜素（批号：111901-202205，纯度98.4%）、一枝蒿酮酸（批号：DST241025，纯度98%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸等为分析纯，水为纯化水。10批平纳蜜膏（编号：S1~S10）的批号分别为20240506、20240515、20220114、20211219、20220109、20240312、20240506-2、20240312- 2、20240515-2、20220328，均由新奇康药业股份有限公司生产，规格：18 g/袋。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱为岛津Shim Nex CS C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱（洗脱程序见表1），柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为330 nm和245 nm，进样量为10 μL。

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  表格1 梯度洗脱程序

  Table 1.Gradient elution procedure

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2.2 对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为90.73、100.28、181.24、133.04 µg/mL的混合对照品溶液。另精密称取一枝蒿酮酸对照品适量，同法制成质量浓度为190.13 µg/mL的单标对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取平纳蜜膏约4.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40 mL，称定重量后超声（功率：250 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀后经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一份供试品溶液（编号：S1），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，分别在330 nm与245 nm波长下检测，并以木犀草素（330 nm）与一枝蒿酮酸（245 nm）作为参照（S）峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示：330 nm波长下，相对保留时间RSD为0.01%~0.24%（n=6），相对峰面积RSD为0.18%~2.59%（n=6）；245 nm波长下，相对保留时间RSD为0.00%~0.10%（n=6），相对峰面积RSD为0.17%~1.39%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批样品（编号：S1），平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以木犀草素（330 nm）与一枝蒿酮酸（245  nm）作为S峰，计算得330 nm波长下，相对保留时间RSD为0.02%~0.30%（n=6），相对峰面积RSD为0.63%~2.71%（n=6）；245 nm波长下，相对保留时间RSD为0.01%~0.16%（n=6），相对峰面积RSD为0.76%~2.80%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液（编号：S1），于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以木犀草素（330 nm）与一枝蒿酮酸（245 nm）作为S峰，计算得330 nm波长下，相对保留时间RSD为0.03%~0.58%（n=6），相对峰面积RSD为0.53%~2.90%（n=6）；245 nm波长下，相对保留时间RSD为0.00%~0.30%（n=6），相对峰面积RSD为0.02%~2.00%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 双波长指纹图谱的建立、共有峰的指认以及相似度评价

取10批平纳蜜膏，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别记录330 nm和245 nm波长下的色谱图。将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）[6]，以S1样品色谱图为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1，进行色谱峰匹配。

在330 nm波长下，共确定13个共有峰。结合对照品色谱图，指认出峰2（咖啡酸）、峰6（蒙花苷）、峰7（木犀草素）和峰8（芹菜素）4个成分，见图1。10批平纳蜜膏的HPLC图谱叠加图及对照指纹图谱（330 nm）见图2。10批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.904、0.902、0.905、0.922、0.904、0.900、0.902、0.910、0.913、0.915。

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  图1 平纳蜜膏混合对照品和样品色谱图（330 nm）

  Figure 1.Chromatogram of mixed reference substance and sample of Pingna honey paste (330 nm )

  注：a. 混合对照品；b. 供试品；2. 咖啡酸；6. 蒙花苷；7. 木犀草素；8. 芹菜素。

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  图2 10批平纳蜜膏指纹图谱叠加图和对照指纹图谱（330 nm）

  Figure 2.Overlap of fingerprint spectra for 10 batches of Pingna honey paste and reference fingerprint spectra (330 nm)

  注：A. 指纹图谱叠加图；B. 对照指纹图谱。

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在245 nm波长下，确定7个共有峰。结合对照品色谱图，指认峰6为一枝蒿酮酸，见图3。10批样品的HPLC图谱叠加图及对照指纹图谱（245 nm）见图4。相似度评价结果显示，10批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.993、0.999、0.999、0.991、0.988、0.991、0.993、0.995、0.985、0.975。

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  图3 平纳蜜膏对照品和样品色谱图（245 nm）

  Figure 3.Chromatogram of reference substance and sample of Pingna honey paste (245 nm)

  注：a. 对照品；b. 供试品；6. 一枝蒿酮酸。

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  图4 10批平纳蜜膏指纹图谱叠加图和对照指纹图谱（245 nm）

  Figure 4.Overlap of fingerprint spectra for 10 batches of Pingna honey paste and reference fingerprint spectra (245 nm )

  注：A. 指纹图谱叠加图；B. 对照指纹图谱。

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2.6 化学计量学分析

化学计量学是运用数学与统计学方法，建立化学测量值与体系状态之间关联的交叉学科，在中药鉴别、质量控制及组效关系研究中应用广泛[7]。化学模式识别作为其常用技术，主要包括聚类分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等方法[8]。在245 nm波长下，仅指认出特征成分一枝蒿酮酸，多数化合物仍属未知，导致可用于分析的变量较少，因此该波长下的数据未用于化学计量分析。故本研究采用330 nm波长下指纹图谱对平纳蜜膏进行质量评价，以探究不同批次平纳蜜膏之间的差异。

2.6.1 CA

CA又称群分析，是一种在无预设分类依据的情况下，根据样本在多维特征上的相似性，对样本进行客观分组的多元统计方法。本研究将10批平纳蜜膏样品在330 nm波长下所得的13个共有峰峰面积作为变量，导入Origin 2024分析软件进行CA，结果见图5。聚类结果将10批样品聚为3类：S1、S2、S4、S7、S9为第一类；S3、S5、S10为第二类；S6、S8为第三类。分析发现，除S4外，第一类样品均为同年同月份生产，第二类样品为同年但月份相近，第三类为同一天的不同批次。结合实际情况，同一类制剂生产所用的药材基本为相同批次，因此推测不同类别样品之间的差异主要源于所用中药材的质量波动。

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  图5 10批平纳蜜膏CA

  Figure 5.CA of 10 batches of Pingna honey paste

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2.6.2 PCA

将10个批次的样品共有峰的峰面积导入Origin 2024软件进行PCA，以特征值＞1为提取标准[9]，共获得3个主成分，其累计方差贡献率达93.05%，表明能够较好地代表样品中共有峰的主要信息，分析结果见表2。

成分载荷矩阵反映各主成分与13个共有峰（即原始变量）之间的相关系数，载荷绝对值越大，说明其对主成分的贡献越大[10]。由表3可知，主成分1主要反映峰2、7、8、9、12的信息，主成分2主要反映峰3、5、6、10、11的信息，主成分3主要反映峰1、4、13的信息。分析结果表明，10批样品可分3大类，第一类为S1、S2、S4、S7、S9；第二类为S3、S5、S10；第三类为S6、S8；分析结果与CA基本一致。具体见图6。

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  表格2 平纳蜜膏PCA特征值及方差贡献率

  Table 2.PCA characteristic value and variance contribution rate of Pingna honey paste

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  表格3 平纳蜜膏主成分因子载荷矩阵

  Table 3.Principal component factor loading matrix of Pingna honey paste

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根据PCA结果，10批样品可分为2大类：第一类包括S1、S2、S4、S7、S9；第二类包括S3、S5、S10；第三类为S6、S8。该分类结果与CA基本一致，具体见图6。

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  图6 PCA散点图

  Figure 6.PCA scatter plot

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2.6.3 OPLS-DA

OPLS-DA是一种多变量统计分析方法，主要用于分类识别和特征变量筛选，其通过计算变量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）来辅助质量差异标志物的筛选[11]。为探究不同批次样品间的质量差异情况，本研究采用SIMCA14.1软件进行OPLS-DA分析，得分图见图7。模型参数结果显示：R2X（X变量的解释率）为0.943，R2Y（Y变量的解释率）为0.874，Q2（模型的预测能力）为0.823，充分说明建立的OPLS-DA模型具有较好的解释能力和预测可靠性，具有统计学意义。

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  图7 10批平纳蜜膏OPLS-DA得分图

  Figure 7.OPLS-DA score chart of 10 batches of Pingna honey paste

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为进一步验证模型的有效性，进行了200次置换检验，结果见图8。检验显示R2在Y轴的截距为0.0691，Q2在Y轴的截距为-0.753，符合R2＞Q2的判别标准，且Q2为负值，证实建立模型无过度拟合现象，适用于10批样品组间差异的判别分析。

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  图8 平纳蜜膏OPLS-DA置换检验（200次）

  Figure 8.OPLS-DA displacement test of Pingna honey paste (200 times)

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根据VIP值筛选差异标志物，VIP值越大表示该成分对分组变量的解释贡献越大。依据VIP ＞1的筛选标准，共鉴定出5个关键差异成分，分别为峰2、10、1、3、6（图9）。VIP值依次为2.018 62、1.481 34、1.269 71、1.143 58、1.011  26。按VIP值降序排列为：峰2（咖啡酸）＞峰10＞峰1＞峰3＞峰6（蒙花苷）。这些成分对样品分组判别具有显著贡献，可作为区分不同批次平纳蜜膏质量差异的特征标志物。

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  图9 平纳蜜膏共有峰VIP

  Figure 9.Pingna honey paste shared peak VIP

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3 讨论

3.1 检测波长的选择

本研究前期对色谱条件进行优化，采用二极管阵列检测器在210~400 nm波长范围内进行全波长扫描。结果显示，咖啡酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素以及一枝蒿酮酸的最大吸收波长分别为320、330、350、335、245 nm[12]，通过比较不同波长下的色谱图，发现330 nm检测波长下各成分色谱峰形良好、分离度理想，故确定咖啡酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素4种成分的最佳检测波长为330 nm。此外，一枝蒿酮酸为一枝蒿药材的主要指标成分，确定其检测波长为245 nm。最终，本方法确立245 nm和330 nm作为指纹图谱的检测波长。

3.2 色谱条件优化

本研究系统考察了不同条件对色谱行为的影响。首先，对提取条件进行优化，包括提取溶剂（无水甲醇、50%甲醇、无水乙醇、50%乙醇、水）、提取方式（回流、超声）、提取时间（30、45、60、75 min）以及料液比（4 ∶ 30、4 ∶ 40、4 ∶  50）。结果显示，采用甲醇为提取溶剂时，色谱图中共有峰数量较多、峰型良好、峰面积较大；提取方式、提取时间以及料液比对色谱图无明显影响。最终确定的提取方法为加入40 mL甲醇，超声处理30 min。

为验证方法的可靠性，进一步考察了不同试验条件的影响，包括流速（0.8、1.0、1.2  mL/ min）、柱温（25、28、32 ℃）及仪器品牌（岛津、赛默飞、沃特世）。分别在330 nm和245  nm波长下依次进样测定，并记录各成分的相对保留时间。结果表明，在330 nm波长下，流速、柱温及不同仪器的相对保留时间RSD范围分别为0.18%~4.95%、0.93%~3.30%及0.09%~3.10%；在245 nm波长下，其RSD范围分别为0.20%~3.05%、0.85%~2.80%及0.08%~3.20%。所有RSD均小于5.0%，各色谱峰分离效果良好，说明所建立的HPLC指纹图谱方法具有较好的耐用性。

3.3 指纹图谱及化学计量分析

本研究建立了10批平纳蜜膏在330 nm和245 nm波长下的的指纹图谱。结果显示，在245  nm波长下共有7个共有峰，并指认出化学成分一枝蒿酮酸；在330 nm波长下共有13个共有峰，识别出咖啡酸、蒙花苷、木犀草素及芹菜素4个化学成分，表明在该波长下能够获取更为丰富的化学信息。两个波长下样品间的相似度均大于0.90，说明各批次质量具有较好的稳定性和均一性。

通过OPLS-DA分析，筛选出咖啡酸、共有峰10、共有峰1、共有峰3及蒙花苷5个质量差异标志物，这些成分能够有效表征不同批次平纳蜜膏之间的质量差异。从化学与药理角度分析，咖啡酸可清除炎症反应中中性粒细胞和巨噬细胞释放的氧自由基，显著改善白细胞减少症、氧化应激和炎症状态，并能通过抑制炎症介质的生成和释放发挥止痛作用[13-14]；此外，咖啡酸还具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性[15-16]。蒙花苷则具有抗炎、抗氧化、解热镇痛及神经保护等多种活性[17-20]。这两类成分（酚酸类与黄酮类）在药理上具有协同作用，与平纳蜜膏“温胃散寒、清脑安神、制酸止痛、收敛散肿”的传统功效相契合，说明将其作为整体质量控制的标志物具有合理性和科学依据。

3.4 小结

本研究建立了快速、稳定的双波长HPLC指纹图谱方法。在不同波长下，样品相似度较高，该方法能够较好地反映制剂的化学特征。结合化学模式识别分析，成功筛选出质量差异标志物，表明所建立的双波长指纹图谱方法可在一定程度上用于制剂质量的控制与提升。

该方法指纹峰信息丰富，精密度高、稳定性和重复性好，且准确度高，能够有效保证平纳蜜膏的整体质量稳定，为其质量控制提供了可靠依据。后续研究将重点关注以下方向：未鉴定色谱峰的结构确认；主要活性成分的含量测定，并建立更全面的定量分析方法，从而进一步完善平纳蜜膏的质量标准体系。

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