目的 建立二维高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法，检测赖氨酸维B₁₂颗粒中3种成分的含量。

方法 一维色谱以0.005 mol/L磷酸二氢钾溶液（用氢氧化钾调节pH至5.5）-乙腈（92∶8）为流动相；将待测组分分离及捕集，二维色谱以0.1%甲酸溶液为流动相A，以0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B，进行梯度洗脱；采用电喷雾离子源，以正离子多反应监测模式对目标化合物进行定性定量分析。

结果 盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇分别在80.06~ 8.006×10⁶ μg/L、10.12~1.012×10³ μg/L、80.16~8.016×10⁶ μg/L范围内线性关系良好，r均为0.999 9；平均回收率分别为98.71%、97.96%、98.55%，RSD分别为1.4%、1.3%、0.9%（n=9）。

结论 该方法前处理简便，可使用含盐流动相，专属性好，灵敏度高，可同时对赖氨酸维B₁₂颗粒中3种成分进行定量分析。

赖氨酸维B₁₂颗粒是由盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇等组成的复方制剂，临床上主要用于加速儿童生长发育、增进食欲等，现行标准WS-10001-(HD-1392)-2003收载于《国家药品标准化学药品标准地标升国标（第十五册）》^［1］。标准中仅对处方中的盐酸赖氨酸进行检测，维生素B₁₂和肌醇均未涉及，这给赖氨酸维B₁₂颗粒的质量问题带来了较大的风险。

通常检测维生素B₁₂主要采用HPLC法^［2-4］；检测肌醇的方法主要有高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法、GC法^［5-7］；检测盐酸赖氨酸需要在HPLC法基础上进行柱前衍生或柱切换^［8-10］，样品处理方法较为复杂，操作步骤较为繁琐。很少有方法能同时测定维生素B₁₂、盐酸赖氨酸和肌醇的含量。

HPLC-MS法以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，可同时实现对赖氨酸维B₁₂颗粒中3种成分进行定量分析。考虑到该处方中辅料的淀粉和糖类直接进入质谱仪容易造成离子源污染，本文采用二维HPLC-MS法^［11-15］，充分发挥多中心切割功能，将淀粉及糖类物质从一维色谱系统中切出，确保3种主药成分在二维色谱系统中精准定量，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

AB4500二维高效液相色谱-质谱联用仪（AB SCIEX公司）；MS105电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；60k型超声波清洗器（杭州宝珀超声波科技有限公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）。

1.2 主要药品与试剂

赖氨酸维B₁₂颗粒（湖南方盛制药股份有限公司，批号：230703、241215、250812）；对照品盐酸赖氨酸（批号：140673-202412，纯度99.9%）、维生素B₁₂（批号：100248-202407，纯度90.2%）、肌醇（批号：190077-202102，纯度100.0%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（德国默克公司）与甲酸（上海Aladdin 公司）均为色谱纯；磷酸二氢钾、氢氧化钾（国药集团化学试剂有限公司）均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件

一维色谱系统采用Waters XTerra MS C₁₈色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），以0.005 mol/L磷酸二氢钾溶液（氢氧化钾调节pH至5.5）-乙腈（92∶8）为流动相；二维色谱系统采用CAPCELL CORE C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 µm），以0.1%甲酸溶液为流动相A、0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B进行梯度洗脱（0～2.0 min，3% B；2.0～8.0 min，3%～90% B；8.0～10.0 min，90% B；10.0～13.0 min，90%～3% B；13.0～15.0 min，3% B）；柱温均为30 ℃，流速均为0.2 mL/min，进样量均为1 µL。其中，盐酸赖氨酸切割时间为0～2.0 min，淀粉和糖类切割时间为3.0～6.0 min，维生素B₁₂和肌醇切割时间为10.0～13.0 min。

系统流路连接见图1，其中接口采用2个6通阀实现流路完全对称，平衡流动相时，6通阀“A”中，“6”和“1”相通，一维色谱系统流动相直接进入一维检测器后进废液；未切割时，6通阀“A”中，“1”和“2”相通，6通阀“B”中，“5”和“6”相通，“1”和“2”相通，一维色谱系统流动相将待测组分带入捕集柱中，二维色谱系统流动相直接进入二维检测器后进废液；切割时，6通阀“B”中，“6”和“1”相通，“3”和“2”相通，二维色谱系统流动相进入捕集柱，将待测组分带入二维色谱柱，经检测器后进入质谱仪分析检测。

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  图1 多中心切割二维液相系统连接示意图

  Figure 1.Schematic diagram of multi-center cutting in a two-dimensional liquid phase system

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2.1.2 质谱条件

采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测；喷雾电压设为5.0 kV，离子源温度550 ℃，气帘气、喷雾气及辅助加热气的压力分别为35、50、50 psi；质谱采集采用多反应监测模式，其他质谱参数见表1。

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  表格1 3种成分质谱参数及母离子、子离子信息

  Table 1.Mass spectrometry parameters and parent ion and daughter ion information for three components

  注：*表示定量离子。

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2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

取盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇对照品适量，精密称定，加80%乙腈溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液，作为混合对照品储备溶液；精密量取混合对照品储备溶液适量，加80%乙腈溶液定量稀释制成每1 mL中分别含盐酸赖氨酸和肌醇80、8 000、8.0×10⁴、8.0×10⁵、8.0×10⁶ μg/L，含维生素B₁₂10、50、100、200、1 000 μg/L的溶液，作为系列混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取本品约1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加80%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，超声处理（功率：200 W，频率：30 kHz）30 min，经0.22 µm滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

按处方比例称取蔗糖、淀粉等适量，并按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

取阴性样品溶液、100 ng/mL混合对照品溶液及供试品溶液，分别按“2.1”项下分析条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果表明，阴性样品在目标成分出峰位置无干扰，对照品与供试品中待测成分色谱峰的理论塔板数及分离度均满足定量分析要求，表明该方法专属性良好。

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  图2 系统适用性试验色谱图

  Figure 2.Chromatograms of system suitability test

  注：A.阴性样品溶液； B.混合对照品溶液； C.供试品溶液； 1.盐酸赖氨酸； 2.维生素B12； 3.肌醇。

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2.3.2 线性范围、检出限与定量限

取“2.2.1”项下混合对照品溶液，以质量浓度为横坐标（X，μg/L）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到线性方程和回归系数r，根据信噪比为3和10分别计算检出限和定量限，结果见表2。

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  表格2 3种成分线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

  Table 2.Linear ranges, linear equations, correlation coefficients、detection limits and quantification limits for 3 components

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2.3.3 精密度试验

取批号为241215的供试品溶液，按“2.1”项下分析条件连续进样6次，结果盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇保留时间的RSD分别为0.2%、0.3%、0.2%（n=6），峰面积的RSD分别为0.5%、1.1%、0.9%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取批号为241215的供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、16、24、48 h时按“2.1”项下分析条件进样测定，结果盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇峰面积的RSD分别为0.9%、1.6%、2.2%（n=7），表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验

取批号为241215的样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下分析条件进样测定，结果盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇的平均含量分别为3 0620、0.140 2、4 853 µg/g，RSD分别为1.8%、1.2%、1.6%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验

取本品约0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，分别加入约含有3种组分80%、100%和120%的低中高3种浓度的混合对照品溶液，平行制备9份，进行加标回收率试验。结果表明，盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇的平均回收率分别为97.96%、98.71%、98.55%，RSD分别为1.3%、1.4%、0.9%（n=9），表明方法回收率良好。

2.4 样品测定

取3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下分析条件进样测定，盐酸赖氨酸、维生素B₁₂和肌醇的含量测定结果见表3。结果显示，赖氨酸维B₁₂颗粒的生产工艺和投料趋于稳定；但维生素B₁₂的测定结果均接近处方工艺要求的1.5 µg/g下限，提示该成分的投料量存在低于标称值的风险，生产过程中需重点监控。

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  表格3 3批市售样品中3种待测组分含量测定结果（µg/g，n=3）

  Table 3.Determination results of 3 components to be tested in 3 batches of commercially available samples (µg/g, n=3)

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3 讨论

一维色谱系统分别考察了水-甲醇/乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇/乙腈、10 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇/乙腈、0.005 mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇/乙腈等流动相体系；二维色谱系统分别考察了0.1%甲酸-甲醇/乙腈、10 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇/乙腈等流动相体系。结果表明一维色谱系统以0.005 mol/L磷酸二氢钾溶液（用氢氧化钾调节pH至5.5）-乙腈（92∶8）为流动相、二维色谱系统以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸甲醇溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱，所得到的3种成分峰型最好，响应值最高。

该处方的主药成分有盐酸赖氨酸、维生素B₁₂、肌醇，这3种成分在处方中的含量差异极大，如盐酸赖氨酸处方含量高达30 mg/g，而维生素B₁₂处方含量却低至1.5 µg/g。此外，盐酸赖氨酸几乎无紫外吸收，常规液相方法无法定量分析，且操作较为复杂，通常需要采用正向色谱柱检测。

二维液相色谱可将分离机制不同且相互独立的2根色谱柱串联起来，具有峰容量大、选择性高、分离能力强等突出优点，联用质谱仪后，可显著提高方法的灵敏度和特异性，有效解决复方制剂成分处方含量差异性较大且无法同时分析检测的技术难题。本文通过考察不同的流动相，将处方中占比例较高的淀粉和糖类经一维含盐流动相带入废液，使其对待测组分不造成干扰；再通过摸索二维流动相，分别在不同时间段切割待测组分，可将3种待测组成得到有效分离，并精准定量，该方法科学、准确、高效、便捷，可提升赖氨酸维B₁₂颗粒的质量标准。

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