目的  基于表面等离子共振（SPR）技术建立抗CD80生物技术药物结合活性方法，并进行方法学验证和样品测定。

方法  通过优化试验条件建立合适的结合活性方法，并选择合适的数据分析模型后对建立的方法进行方法学验证。

结果  通过对各种条件进行筛选及耐用性考察，确定了方法的试验参数：配体固定条件为pH 5.0的醋酸盐缓冲液，固定量为400~5 000 RU，结合和解离速率为10~50 µL·min^-1，芯片的再生条件为pH 4.0的枸橼酸缓冲液（10 mmol·L^-1枸橼酸钠，100 mmol·L^-1 NaCl），响应参数为稳态相对响应值（在进样结束后10 s范围内窗口的平均响应值），数据模型为四参数模型。根据以上参数建立了基于SPR技术抗CD80生物技术药物结合活性方法。验证结果如下：线性回归方程的决定系数为0.999 4；每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚平均值为-0.66%~0.64%，线性回归方程的斜率为0.986 7；每个效价水平6次独立测试结果的几何变异系数为0.7%~1.5%，范围为64%~156%。各项验证指标均满足相关验证要求，专属性结果也较好。将建立的结合活性方法应用于抗CD80生物技术药物，测得结合活性相对效价为100%。

结论  本研究通过优化试验条件建立了基于SPR技术的抗CD80生物技术药物结合活性方法，该方法专属性强、重复性好、准确度高。

近几年随着生物技术药物的迅猛发展，其质量控制越来越受到关注，结合活性测定反映了药物与靶点的结合能力，是生物技术药物质量评价的一项重要指标，目前测定结合活性的主要技术包括酶联免疫测定法、流式细胞技术、放大化学发光亲和均相检测技术、表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）技术，其中SPR技术是20世纪90年代基于光学原理发展起来的一种实时检测配体与分析物相互作用的新技术，具有无需标记、耗时短、步骤简单、高分辨高灵敏和实时监控分子的结合和解离过程等优点[1-3]。目前中国药典2020版四部3429[4]、美国药典（USP）<1105>[5]和日本药典（JP）17[6]均已收录SPR测定免疫化学活性。

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA4）-Fc融合蛋白由CTLA4的胞外段和修饰的IgG1抗体Fc组成[7-8]。该融合蛋白通过CTLA4与抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APC）上的白细胞分化抗原（CD）80或CD86结合竞争T细胞上的CD28，从而阻断T细胞的活化，进而抑制免疫级联反应，导致白细胞介素和肿瘤坏死因子ɑ等细胞因子释放减少，最终达到治疗类风湿关节炎等疾病的作用[9-10]。本文通过监测CTLA4-Fc融合蛋白流过固定CD80芯片表面时的质量变化，分析CTLA4-Fc融合蛋白与CD80的相互作用，建立基于SPR技术的抗CD80生物技术药物的结合活性检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Biacore T200生物分子相互作用分析系统（Cytiva）。

CM5芯片（批号：10313498）、HBS-EP+pH 7.4缓冲液（批号：32415，规格：1 L/瓶）、10 mmol·L^-1甘氨酸 pH 2.0再生液（批号：30001，规格：50 mL/瓶）、10 mmol·L^-1甘氨酸 pH 3.0再生液（批号：30036，规格：50 mL/瓶）、pH 4.0醋酸盐缓冲液（批号：30013，规格：50 mL/瓶）、pH 4.5醋酸盐缓冲液（批号：29792，规格：50 mL/瓶）、pH 5.0醋酸盐缓冲液（批号：30862，规格：50 mL/瓶）、pH 5.5醋酸盐缓冲液（批号：30348，规格：50 mL/瓶）均购自Cytiva；pH 4.0的枸橼酸钠再生溶液（自制，称取枸橼酸钠1.5 g，NaCl 2.9 g，加超纯水400 mL溶解，用1 mol·L^-1 HCl溶液调整pH至4.0，加水至500 mL， 0.22 μm滤膜滤过）；96孔U型板（Greiner，批号：650101）；CTLA4融合蛋白参比品，规格：123 mg·mL^-1，批号：1F67347，纯度＞90%，来源于企业；CTLA4融合蛋白样品，规格：125 mg·mL^-1，批号：AAW2380，纯度＞90%，来源于企业；CD80蛋白，规格：3.9 mg·mL^-1，批号：CY03MAY06-1，纯度＞90%，来源于企业；抗CTLA4单抗注射液，规格：5 mg·mL^-1，批号：ABD3419，纯度＞90%，来源于企业。

1.2 结合活性方法

以CD80作为配体，用pH 5.0的醋酸盐缓冲液稀释100倍进行固定，固定后用HBS-EP+pH 7.4缓冲液稀释CTLA4融合蛋白至最终浓度为500 000，50 000，25 000，12 500，6 250，3 125，1 563，781，391，195，98，10 ng·mL^-1，稀释的12个梯度浓度作为分析物。设置Biacore 运行程序：流速为30 μL·min^-1捕获参比品/样品120 s，再采用流速为30 μL·min^-1进样pH 4.0的枸橼酸钠溶液30 s再生芯片。采用单一流路，进样次序均按从低到高浓度排列，按参比品-样品交叉排序。结果选取进样时间130 s的稳态相对响应值（在进样结束后10 s范围内窗口的平均响应值）为信号，采用SoftMax软件以参比品的浓度对数和分析物结合信号拟合四参数曲线，计算参比品和样品的拟合曲线参数：曲线的相关系数（R²）、曲线下渐进性估值（Bottom）、曲线斜率（Hillslope）、半数有效浓度（EC₅₀）、曲线上渐进性估值（Top）及样品的结合活性。参考中国药典2020第四部9401[4]进行方法学验证和统计分析。

1.3 方法优化

1.3.1 固定条件的筛选

CD80作为配体，分别用pH 4.0，4.5，5.0，5.5的醋酸盐缓冲液稀释100倍后进行固定，固定的流速为20 μL·min^-1，选择固定筛选程序进样。

1.3.2 再生条件的筛选

重复5次进样12 500 ng·mL^-1的CTLA4融合蛋白，分别选择pH 4.0的枸橼酸钠溶液（10 mmol·L^-1枸橼酸钠，100 mmol·L^-1 NaCl），以及pH为3.0和2.0甘氨酸缓冲液进行再生，方法同“1.2”项。

1.3.3 不同时间响应值的筛选

用HBS-EP+pH 7.4缓冲液稀释CTLA4融合蛋白，制备起始工作浓度为500 000 ng·mL^-1的80%，100%，125%效价水平的样品，按“1.2”项下方法检测，选取进样后30，120，150 s和稳态相对响应值进行准确度的分析。

1.3.4 数据模型的筛选

对“1.3.3”项下的数据分别用量反应平行线模型和四参数模型进行分析，比较两种模型计算所得效价结果的准确度，并按照中国药典2020第四部1431[4]对结果进行可靠性分析，包括线性、平行性和失拟。其中参比品和样品剂量反应曲线回归项应非常显著（P＜0.05），偏离平行、偏离线性应不显著（P＞0.05）。

1.4 方法验证

1.4.1 线性范围、相对准确度和精密度

用HBS-EP+pH 7.4缓冲液稀释CTLA4融合蛋白参比品，制备起始工作浓度为500 000 ng·mL^-1的64%，80%，100%，125%，156%效价水平的样品，与系列参比品溶液按“1.2”项下的方法检测，重复检测6次，按照中国药典2020年版通则9401[4]的验证要求，对建立的结合活性测定方法进行线性范围、相对准确度和精密度的方法学验证。

1.4.2 专属性

取CTLA4融合蛋白参比品、经95℃加热破坏5 min的CTLA4融合蛋白参比品、抗CTLA4单抗注射液、HBS-EP+ pH 7.4缓冲液按“1.2”项下方法同时进行试验。

1.4.3 耐用性

1.4.3.1 配体固定量耐用性考察

将CD80的量分别设置为400，1 000，5 000 RU进行固定，用HBS-EP+ pH 7.4缓冲液稀释CTLA4融合蛋白参比品，制备起始工作浓度为500 000 ng·mL^-1的100%效价水平的样品和参比品按“1.2”项下方法同时进行试验。

1.4.3.2 流速耐用性考察

用HBS-EP+ pH 7.4缓冲液稀释CTLA4融合蛋白参比品，制备起始工作浓度为500 000 ng·mL^-1的80%，100%，125%效价水平，与参比品按“1.2”项下方法同时进行试验，其中结合速率和解离速率分别设置为10，30，50 μL·min^-1。

1.5 方法应用

取CTLA4融合蛋白参比品和供试品按“1.2”项下方法进行试验，测供试品的相对结合活性。

2 结果

2.1 方法的建立与优化

2.1.1 固定条件的筛选

用pH 5.5的醋酸盐缓冲液稀释CD80后无法通过静电吸附到芯片表面，响应信号很低；用pH为4.0，4.5，5.0的醋酸盐缓冲液稀释CD80均能通过静电吸附到芯片表面，均有较高的响应，故选择条件更为温和的pH 5.0的醋酸盐缓冲液稀释CD80进行固定。结果见图1。

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  图1 不同pH醋酸盐缓冲液稀释CD80后芯片对吸附CD80的响应

  Figure 1.Adsorption of CD80 on chip after diluting CD80 with acetate buffer of different pH

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2.1.2 再生条件的筛选

pH为4.0的枸橼酸钠溶液、pH为3.0和2.0甘氨酸缓冲液再生后基线均平稳，说明3种再生条件均能很好地洗脱掉结合在配体上的分析物；其中pH为4.0的枸橼酸钠溶液和pH为3.0甘氨酸缓冲液再生后稳态下降在20%以内，说明固定在芯片上的配体损失较少，均可作为合适的再生溶液，pH为2.0甘氨酸缓冲液再生后稳态下降超过20%，配体损失较大，不适合作为再生溶液，故选择pH为4.0的枸橼酸钠溶液进行再生。结果见图2。

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  图2 不同再生条件的基线漂移和最大响应值的变化

  Figure 2.Changes of baseline drift and maximum response after different regeneration conditions

  注：A. pH 2.0甘氨酸缓冲液 B. pH 3.0甘氨酸缓冲液和pH 4.0枸橼酸钠溶液

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2.1.3 不同时间响应值的筛选

不同响应时间分别用两种数学模型计算得到的效价结果见表1，响应时间在稳态和150 s测得的效价结果更接近于理论值，由于稳态仪器可直接给出，其他还需手动设置，故选择稳态相对响应值进行数据分析，以参比品或样品的浓度为横坐标，以响应的相对响应值为纵坐标，绘制量反应平行线模型的响应曲线或者四参数模型的响应曲线，按照中国药典2020第四部1431[4]计算两种模型不同响应时间的相对效价结果。结果见表1。

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  表格1 两种分析模型用不同时间的响应值计算得到的相对效价结果

  Table 1.The relative activity results of the two analytical models calculated with the response values of different times

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2.1.4 数据模型的筛选

量反应平行线和四参数模型得到的效价结果基本一致，对数据进行可靠性分析时，量反应平行线模型可靠性测验结果偏离线性不显著（P＜0.05），偏离线性不能满足可靠性检验要求，四参数模型可靠性测验结果均满足回归项非常显著（P＜0.05），偏离平行、偏离线性均不显著（P＞0.05）。故选择四参数模型作为方法的数据分析模型。

2.2 方法学验证

按照建立好的方法进行6次64%，80%，100%，125%，156%效价水平测试后的效价结果见表2。

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  表格2 不同效价水平结合活性测定结果（%）

  Table 2.Determination results at individual levels of binding activity (%)

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2.2.1 线性回归方程

以6次独立测试中每个效价水平测定值的对数（Y）对相应效价理论值的对数（X）作线性回归，得回归方程为Y =0.986 7X-0.000 6，线性回归方程的决定系数为0.999 4。同效价水平测定值对数与理论值对数的直线回归图见图3。

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  图3 不同效价水平测定值对数与理论值对数的直线回归图

  Figure 3.Linear regression diagram of measured value logarithm and theoretical value logarithm at different titer levels

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2.2.2 相对准确度

每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚平均值为-0.66%~0.64%，其90%置信区间在-1.24%~1.66%范围内，具体数值见表3，线性回归方程的斜率为0.986 7。

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  表格3 不同效价水平测定值的相对偏倚及90%置信区间（n=6）

  Table 3.Relative bias and 90% confidence intervals at individual levels (n=6)

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2.2.3 精密度

每个效价水平6次独立测试结果的几何变异系数为0.7%~1.5%，具体数值见表4。

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  表格4 不同效价水平测定值的几何标准偏差、几何变异系数及95%置信上限（n=6）

  Table 4.Geometric standard deviation, geometric coefficient of variation and 95% upper confidence limits at individual levels (n=6)

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2.2.4 线性范围

根据线性、相对准确度和精密度结果，本测定方法可检测的相对效价水平范围为64%~156%。

2.2.5 专属性

CTLA4融合蛋白参比品呈现显著的剂量反应关系，经95℃加热破坏5 min的CTLA4融合蛋白呈剂量反应关系但效价由100.7%下降至4.9%，而非CD80靶点单抗溶液和缓冲液均不呈现剂量反应关系。具体见图4。

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  图4 专属性验证结果

  Figure 4.The specificity results

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2.3 耐用性

2.3.1 配体固定量耐用性

将CD80的固定量分别设置为400，1 000，5 000 RU进行固定，测得100%效价供试品的效价分别为99.2%，100.6%，98.7%，3次测定的RSD为0.97%（n=3），说明本方法耐用性良好。

2.3.2 流速耐用性

结合速率和解离速率分别设置为10，30，50 μL·min^-1时，80%，100%，125%效价水平供试品测得的结果见表5，RSD均不高于0.07%（n=3）。说明流速变化对本方法的影响较小，耐用性良好。

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  表格5 不同流速时的测得的相对效价结果（%）

  Table 5.Relative activity results at different flow rates (%)

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2.4 方法应用

通过以上方法优化确定了该试验的条件，并对该方法的线性范围、相对准确度、精密度和专属性进行了验证，建立的方法适用于CTLA4融合蛋白结合活性的测定，选择1批CTLA4融合蛋白进行试验，测得CTLA4融合蛋白供试品的结合活性相对效价为100%。

3 讨论

SPR技术作为一个强大的技术手段应用于抗原抗体相互作用的研究已有20多年，已成功应用于蛋白质、寡聚核苷酸等分子相互作用的检测，以及微生物的定性定量分析。SPR技术能够实时、无标记实现分子相互作用分析，为生物技术药物的相互作用分析提供了一种新的、更加有效的方法[11-12]。但SPR技术在药物发现、早期开发和生产中的应用日益广泛，在质量控制方面的应用还比较少。本文通过建立基于SPR技术抗CD80生物技术药物结合活性方法，促进SPR技术在生物技术药物质量评价方面的发展。

本文通过抗CD80生物技术药物结合活性方法的建立，考察了试验过程中一些参数并进行优化，选择将CD80蛋白固定在CM5芯片上，对于固定条件本文考察了用不同pH的醋酸盐缓冲液稀释配体后进行固定后的响应，由于CM5芯片表面带有负电荷，在将蛋白进行氨基偶联固定时需将蛋白带上正电荷与芯片发生静电吸附，所以要选用pH低于固定蛋白等电点的醋酸盐缓冲液，固定蛋白带上正电荷。本文通过试验选择了pH 5.0的醋酸盐缓冲液稀释CD80进行固定。

CM5芯片固定好配体后需要考察合适的再生条件，这是方法建立过程中很重要的一步，因为一些方法可能由于找不到合适的再生而无法建立，好的再生条件将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去且必须保持芯片上配体分子的活性，所以基线要平稳，且固定蛋白损失少。研究选用了3个不同pH的酸溶液进行再生条件的筛选，最终选择了pH 4.0枸橼酸溶液进行再生。

选取合适的响应值作为分析数据对于结果的准确度尤为重要，本文选取不同时间点的响应值分别进行分析，表1中数据显示采用进样结束后（120 s之后）测得响应计算效价结果的准确度要高于采用进样结束前（120 s之前）的响应测得响应计算效价结果的准确度。由于结束进样前的数据可能存在样品基质效应的干扰，进样结束后流经芯片表面的是缓冲液，不存在基质效应干扰，所以进样结束后（120 s之后）测得响应计算效价结果的准确度要高于采用进样结束前（120 s之前）的响应测得响应计算效价结果的准确度。

本文通过对试验过程中的各个参数进行筛选优化建立了基于SPR技术抗CD80生物技术药物结合活性方法。而且方法的固定量和流速的耐用性范围均较好。方法学验证数据显示，该方法的准确度高、精密度高、线性好、操作简便，相比于传统的ELISA方法更加节约时间和人力。本文基于SPR技术建立的结合活性方法为生物技术药物质量测定提供了有效可靠的保证。

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