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目的 筛选紫杉醇注射液的最优处方工艺，并对其进行表征。
方法 根据参比制剂的处方组成，结合可行的放大生产工艺，采用Minitab软件对辅料的处方用量进行优化，以有关物质作为考察指标，进行全因子实验设计与分析。对紫杉醇注射液的粒径及粒径分布、Zeta电位进行表征。
结果 优化的处方工艺：水分控制为≤0.3%，处方中不加入枸橼酸，残氧量控制为≤6%。能够确保优化处方工艺制备的紫杉醇注射液有关物质控制为≤0.4%。优化后处方工艺制备的样品与参比制剂表征一致。
结论 筛选的紫杉醇注射液处方合理，工艺可行。
紫杉醇，属于天然类抗癌药，通过抑制细胞的有丝分裂，从而发挥抗肿瘤的作用，在头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等疾病治疗中广泛应用[1-3]。紫杉醇具有高亲脂性，不溶于水，故紫杉醇注射液需要加入增溶剂[聚氧乙烯（35）蓖麻油]，但增溶剂会带来一系列过敏反应，因此极大限制了紫杉醇在临床上的应用。为了降低紫杉醇过敏反应的发生率，提高紫杉醇的最大耐受剂量[4-6]，研究者开展了相关研究工作。聚氧乙烯（35）蓖麻油具有变态反应、肾脏毒性及神经毒性等不良反应[7-8]，研究者对现有注射级的聚氧乙烯（35）蓖麻油（Kolliphor ELP型，BASF生产）进行进一步纯化，除去其中含有的聚乙二醇蓖麻酸酯、葵酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、乙二醇和二甘醇等，制备出超纯级聚氧乙烯（35）蓖麻油（含油酸不得少于98.5%）[9]。本研究通过药品说明书获得参比制剂（安素泰，Hospira生产）处方，采用全因子实验设计，以有关物质为考察指标，筛选处方中枸橼酸用量、含水量和工艺中的残氧量，优化处方工艺[10]。紫杉醇注射液临床配伍后形成胶束，采用激光粒度分析仪对粒度及其分布、Zeta电位进行表征[11]。
1 仪器与试药
Nano-ZS型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；870KF型微量水分测定仪（瑞士万通）；LC-20T型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XS205Du型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；JA1003型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；GS1型微量顶空气体分析仪[希仕代仪器贸易（上海）有限公司]；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义予华仪器有限责任公司）；KH-500B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
紫杉醇（上海金和生物制药有限公司，批号：STS201709022，含量99.1%）；三尖杉宁碱（杂质Ⅰ，批号：100926-201503，供HPLC法系统适用性试验用）、7-表-10-去乙酰基紫杉醇（杂质Ⅱ，批号：100925-201503，供HPLC法系统适用性试验用）、7-表-紫杉醇（杂质Ⅲ，批号：100925-201804，供HPLC法系统适用性试验用）均购自中国食品药品检定研究院；紫杉醇注射液参比制剂（Hospira公司，批号：E096852AA，规格：5 mL ∶ 30 mg）；聚氧乙烯（35）蓖麻油（ELP型，德国BASF，批号：725762447G0）；枸橼酸（含有1个结晶水，湖南华日制药有限公司，批号：200911067C）；无水枸橼酸（不含结晶水，湖南尔康制药股份有限公司，批号：102120200801）；无水乙醇（太仓新泰酒精有限公司，批号：22033102，含量≥99.7%）；5%葡萄糖注射液（上海百特医疗用品有限公司，批号：S2106104，规格：100 mL）。
2 方法与结果
2.1 紫杉醇有关物质检查
2.1.1 色谱条件
采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（40 ∶ 60），按表1进行梯度洗脱；流速：1.5 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：227 nm；进样体积：10 μL[11]。
2.1.2 空白辅料1的配制
取未纯化的聚氧乙烯（35）蓖麻油、无水乙醇适量，加乙腈溶解并稀释制成聚氧乙烯（35）蓖麻油浓度为44 mg·mL-1，无水乙醇浓度为4.1%的溶液。
2.1.3 空白辅料2的配制
取纯化的聚氧乙烯（35）蓖麻油、无水乙醇适量，加乙腈溶解并稀释制成聚氧乙烯（35）蓖麻油浓度为44 mg·mL-1，无水乙醇浓度为4.1%的溶液。
2.1.4 系统适用性溶液的配制
取紫杉醇、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ和杂质Ⅲ对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成紫杉醇浓度为0.5 mg·mL-1，杂质Ⅰ与杂质Ⅱ浓度为2.5 μg·mL-1，杂质Ⅲ浓度为25 μg·mL-1的溶液。
2.1.5 供试品溶液的配制
取本品，加乙腈溶解并稀释制成浓度为0.5 mg·mL-1的溶液。
2.1.6 对照溶液的配制
精密量取供试品溶液适量，用乙腈定量稀释制成浓度为2.5 μg·mL-1的溶液。
2.1.7 系统适用性试验
精密量取上述溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。杂质Ⅰ为三尖衫宁碱，杂质Ⅱ为7-表-10-去乙酰基紫杉醇，杂质Ⅲ为7-表紫杉醇，紫杉醇峰与杂质Ⅱ峰之间的分离度应大于1.1。上述杂质均为紫杉醇的降解杂质，所以需要在紫杉醇注射液中进行杂质定位并控制其限度，以便保证产品的质量的可控性及安全性。
2.2 紫杉醇注射液处方工艺
根据参比制剂（美国食品药品监督管理局列为对照制剂）在美国上市的说明书中记载，每1 mL无菌紫杉醇注射液包含6 mg紫杉醇、527 mg聚氧乙烯（35）蓖麻油、49.7%无水乙醇和2 mg枸橼酸。以参比制剂的处方组成为依据，在常规用量范围内对处方进行筛选。
紫杉醇注射液以100瓶计的处方工艺描述：向烧杯中加入200 mL无水乙醇，搅拌条件下加入紫杉醇原料药3.0 g，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）溶解后，加入无水枸橼酸（选择三水平，加入量分别为0，0.5，1 g）和聚氧乙烯（35）蓖麻油263.5 g，搅拌均匀，继续加无水乙醇49 mL，搅拌均匀，在充氮保护的条件下，每瓶按5.3 mL分装至中硼硅西林瓶中，全加塞，轧盖（本品在20℃药液密度为0.930 g·mL-1）。
2.3 全因子实验设计优化紫杉醇注射液处方工艺
全因子实验设计的目的是选择处方中枸橼酸用量，控制处方中的含水量，并确定这些变量与工艺中残氧量的控制是否存在交互作用。该实验采用3中心点的23全因子实验设计用于研究这2个处方因素和1个工艺因素对表2中所列响应量的影响。
2.3.1 全因子实验设计
紫杉醇注射液各规格所含原辅料的浓度完全一致，其中加入量最大的为聚氧乙烯（35）蓖麻油，该辅料归属为关键物料，枸橼酸能提供氢离子，从而改善聚氧乙烯（35）蓖麻油中游离脂肪酸引起紫杉醇有关物质的增加；紫杉醇不溶于水，其引湿性较强，样品中的含水量也属于关键质量参数；从紫杉醇的化学结构来分析，其含有易氧化的官能团，工艺过程中对残氧量的控制也属于关键工艺参数。上述指标的微小变动均可通过有关物质来准确反映，故选择有关物质作为本品处方工艺筛选的响应因子。23全因子实验设计见表2。
中国药典2020年版紫杉醇注射液[12]有效期内有关物质可接受范围为≤2.0%，为了保证产品在贮藏及运输过程中的质量可控，研究者制订有关物质的放行可接受范围为≤0.4%，一般而言，有关物质越小，代表产品质量越优。
2.3.2 模型拟合及分析
采用Minitab软件设计实验，软件设计3因子2水平加设3个中心点的全因子实验，结果见表3。
采用Minitab软件进行数据分析，模型分析结果显示含水量的主效应显著（P＜0.05），即可以判定本模型总的来说是有效的，失拟P=0.134＞0.05，弯曲P=0.128＞0.05，则表明应拒绝原假设，即可判定本模型有效。具体分析结果见表4和表5。
Minitab软件使用“在模型中不包括中心点”的全因子实验设计确定了主效应和交互效应，用全因子实验设计模型进一步建立紫杉醇注射液处方工艺变量的可接受范围。仅含水量对有关物质影响显著，并呈负相关，故含水量控制得越低越好。含水量控制策略如下：①控制起始物料紫杉醇、聚氧乙烯（35）蓖麻油、无水乙醇的水分；②由于紫杉醇引湿性较强，故从原包装中取出后应立即称量，不宜在空气中放置时间过长；③紫杉醇注射液在制备过程中采用无水乙醇荡洗容器，避免容器中残留的水引起处方中含水量升高。处方工艺变量对有关物质的影响见图2，两个响应的等值线叠加图见图3和图4，基于紫杉醇注射液处方中控制含水量的水平，通过原辅料的前端控制与生产中的过程控制，可以把处方中水分控制≤0.3%，此条件下需要保证有关物质≤0.4%，可不加入枸橼酸，残氧量控制≤6%。
2.3.3 优化后处方工艺的验证
紫杉醇注射液优化后的处方工艺：向烧杯中加入200 mL无水乙醇，在搅拌条件下加入紫杉醇原料药3.0 g，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）并搅拌溶解后，加入聚氧乙烯（35）蓖麻油263.5 g，搅拌均匀后，继续加无水乙醇49 mL，继续搅拌均匀，在充氮保护的条件下（目的是保证中硼硅玻璃瓶中残氧量控制在6%以下），每瓶按5.3 mL分装至中硼硅西林瓶中，全加塞，轧盖，制得3批样品。3批样品的有关物质分别为0.3%，0.4%，0.3%（n=3）。结果表明优化后紫杉醇注射液的处方工艺稳定、合理、可行，耐用性好。
2.4 紫杉醇注射液的表征
紫杉醇注射液中聚氧乙烯（35）显著蓖麻油属于表面活性剂，具有增溶作用，临床配伍后紫杉醇会进入其形成胶束的不同位置，从而增加紫杉醇的溶解度。参照紫杉醇注射液说明书项下的用法用量，本品应稀释于5%葡萄糖注射液或于其他等渗的大输液中，稀释后浓度为0.3~1.2 mg·mL-1，再对紫杉醇注射液进行表征。
2.4.1 粒度和粒度分布
低浓度自研制剂溶液的配制：精密量取紫杉醇注射液1 mL，精密加入5%葡萄糖注射液19 mL，混合均匀，即得0.3 mg·mL-1的低浓度自研制剂溶液。
低浓度参比制剂溶液的配制：精密量取紫杉醇注射液参比制剂1 mL，精密加入5%葡萄糖注射液19 mL，混合均匀，即得0.3 mg·mL-1的低浓度参比制剂溶液。
高浓度自研制剂溶液的配制：精密量取紫杉醇注射液1 mL，精密加入5%葡萄糖注射液4 mL，混合均匀，即得1.2 mg·mL-1的高浓度自研制剂溶液。
高浓度参比制剂溶液的配制：精密量取紫杉醇注射液参比制剂1 mL，精密加入5%葡萄糖注射液4 mL，混合均匀，即得1.2 mg·mL-1的高浓度参比制剂溶液。
精密量取低、高浓度自研制剂和参比制剂溶液各1 mL，缓慢延着管壁加入样品皿中，样品加入过程中不能产生气泡，参照中国药典2020年版0982粒度和粒度分布测定法[13]，利用动态光散射原理，通过激光粒度仪测定样品粒度和粒度分布。自研制剂溶液粒度分布图见图5，参比制剂溶液粒度分布图见图6。粒度测定结果见表6。
结果表明，自研制剂与参比制剂与5%葡萄糖注射液配伍后，配伍溶液的粒度和粒度分布测定结果一致。
2.4.2 Zeta电位
精密量取低、高浓度自研制剂溶液及低、高浓度参比制剂溶液各1 mL，置聚苯丙乙烯U型测试管内，需要确保溶液充满整个U型测试管，参照中国药典2020年版0982粒度和粒度分布测定法[12]检测Zeta电位。自研制剂溶液Zeta电位典型测定图见图7，参比制剂Zeta电位典型测定图见图8。低、高浓度自研制剂溶液及低、高浓度参比制剂溶液的Zeta电位分别为2.72，3.54，2.78，3.68，结果表明，自研制剂与参比制剂与5%葡萄糖注射液配伍后，配伍溶液的Zeta电位测定结果一致。
3 讨论
3.1 优化后紫杉醇注射液处方工艺
采用纯化后的聚氧乙烯（35）蓖麻油作为紫杉醇的增溶剂，未知杂质明显减少，进一步证实纯化可以去除或减少该辅料中的杂质，如聚乙二醇蓖麻酸酯、葵酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、乙二醇和二甘醇等。采用超纯级聚氧乙烯（35）蓖麻油可能会减少该辅料本身引起的不良反应，如过敏反应、神经毒性与肾脏毒性[9]。
注射剂辅料选用的基本原则[14]包括：①选用符合注射级要求的辅料；②在满足需求的前提下，注射剂选用辅料的种类与用量应尽可能少；③应尽可能选用注射剂常用辅料。在满足质量要求的前提下，优化后紫杉醇注射液处方工艺中不加入枸橼酸，更好地保证了产品的安全性。
优化后紫杉醇注射液处方工艺中残氧量控制为≤6%，即可以保证本品的质量可控。正常空气中含氧量为20.9%，有研究者通过灌装后在中硼硅玻璃瓶上端空隙充氮，即可以实现残氧量在6%以下[15]；如果需要把紫杉醇注射液处方工艺中残氧量控制为≤4%，需要在灌装前充氮，灌装后在中硼硅玻璃瓶上端空隙充氮，甚至还需要在灌装全加塞工序进行相对封闭的氮气保护，大大增加了工艺控制的难度。
3.2 全因子实验设计的考虑
全因子实验设计是指所有因子的所有水平的所有组合都至少要进行1次实验，其优点是可以评估出所有的主效应和所有的各阶交互效应，因此，如因子数较少且的确需要考察较多的交互作用时，最优的选择是全因子实验设计。全因子实验设计的统计分析方法不仅能找到最优因子，还可以得知哪些因子是显著影响的因子（P＜0.05），预估并推测出将要达到的最佳值和这个最佳值将在多大的范围内波动。本研究在“中心点”处设置了3次重复实验，一方面可以充分估算实验误差，另外由于增加了实验水平，提升了预估能力[16]。
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