目的  拟定小活络丸中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的含量测定方法，完善小活络丸的质量控制标准。

方法  采用HPLC法，色谱柱为Shim-pack Scepter C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（22 ∶ 78），流速为1.0 mL/min，检测波长为232 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的总含量，并对小活络丸进行相关质量评价。

结果   苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分别在0.077 4~1.548 0、0.016  2~0.324  0、0.016 1~0.322 0 μg质量范围内线性关系良好（r≥0.999 8），平均回收率分别为97.81%、96.29%、100.06%，RSD分别为1.38%、1.88%、1.58%（n=6）。依据测定结果拟定小活络丸中3种单酯型生物碱含量不低于55.1 μg/g的限量标准，28个企业的149批样品中，有5批样品含量低于拟定限度，均来自同一企业。

结论  建立的HPLC法准确性高、专属性强，测得的小活络丸中单酯型生物碱含量限定标准可作为该药质量评价的重要补充。

小活络丸，源自我国民间流传的活络丹方剂——宋代《太平惠民与药局方剂》卷一《活络丹》方剂，原名活络丹。由于大活络丹（丸）方由50味药组成，小活络丹（丸）方只用了6味药，原则上功效也不一样，故后世为了将这两种成药区分开来，前者命名为“大活络丹”，后者命名为“小活络丹”。小活络丸现收载于《中国药典（2020年版）》一部，其制法如下：胆南星180 g、制川乌180 g、制草乌180 g、地龙180 g、乳香（制）66  g、没药（制）66 g，以上6味药粉碎成细粉，过筛，混匀。每100 g粉末加炼蜜120~130 g制成小蜜丸或大蜜丸，即得。其有祛风散寒、化痰除湿、活血止痛的功效，适用于关节痹症[1]。方中制川乌、制草乌辛热燥散，善祛风除湿、散寒之痛，二者相须为用，药力更著，恰中病机，故为君药。川乌、草乌经加热处理、水煮等炮制后，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱类毒性成分，包括转化为苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等单酯型生物碱（也是主要的有效成分），毒性显著降低，安全治疗指数升高[2]。《中国药典（2020年版）》一部中制川乌和制草乌【含量测定】项将这3种单酯型生物碱作为指标成分进行测定。但在现行小活络丸药典标准中，仅对制草乌和制川乌的乌头碱限量作为【检查】项列出，缺失了对单酯型生物碱这一关键有效成分的质量控制，无法衡量制草乌和制川乌的投料质量与数量。为全面、客观地评价小活络丸的质量，本研究拟通过建立一种适合检测小活络丸中3种单酯型生物碱含量的方法[3-5]，在对不同企业、不同产地、不同批次的小活络丸中3种单酯型生物碱含量测定的基础上，拟定3种单酯型生物碱成分的含量限度，并对小活络丸的质量进行评价。

1 材料

1.1 主要仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，包括2998 PDA检测器（美国沃特斯公司）；Sartorius BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；ME204电子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.2 主要药品与试剂

149批小活络丸（大蜜丸、小蜜丸）来自31个省市自治区，共涉及28家生产企业；胆南星（批号：220901）、地龙（批号：JZ00202205024）、乳香（制）（批号：220901）、没药（制）（批号：220901）、炼蜜（批号：0920220601）等饮片均购自北京同仁堂，且均符合《中国药典（2020年版）》检验标准；对照品：苯甲酰新乌头原碱（批号：111795-201303，纯度96.3%）、苯甲酰乌头原碱（批号：111794-201303，纯度98.8%）、苯甲酰次乌头原碱（批号：111796-201303，纯度97.5%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱为Shim-pack Scepter C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（22 ∶ 78），流速为1.0  mL/ min，检测波长为232 nm，柱温为35 ℃，进样量为10  μL[1]。按苯甲酰新乌头原碱峰计，理论板数不低于8 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1 mL中分别含400、70、70 μg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液各5 mL，置50 mL量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液

取【重量差异】项下的本品，剪碎，混匀，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1  mol/L盐酸溶液25 mL，密塞，称定重量，超声（功率：500 W，频率：40 KHz）处理45  min，放冷，再称定重量，用上述溶液补足减失的重量，摇匀，离心10 min，滤过，精密量取续滤液10 mL，加在固相萃取柱上（填充剂：混合型阳离子交换反相吸附剂，规格：150  mg/6  mL，预处理洗脱：乙腈6 mL、水6  mL），用水3 mL、5%氨溶液5  mL、水5 mL、甲醇5 mL、乙腈5 mL依次洗脱，至洗脱液流尽，放置约5 min，再用乙腈-浓氨试液（9 ∶ 1）的混合溶液10 mL洗脱，收集洗脱液，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣用乙腈-0.1%磷酸（20  ∶  80）的混合溶液溶解，定容至5 mL，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 缺制川乌和制草乌的阴性样品溶液

取除制川乌和制草乌外的其余药材胆南星、地龙、乳香（制）、没药（制）适量，粉碎成细粉，过六号筛，混匀，加入炼蜜，制成阴性制剂大蜜丸，按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。阴性样品对测定结果无干扰，待测成分专属性良好。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 对照品；B. 供试品；C. 阴性样品；1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰乌头原碱；3.苯甲酰次乌头原碱。

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2.4 线性关系考察

分别取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以待测成分的进样量为横坐标（X， μg）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见表1。结果表明苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分别在一定质量范围内线性关系良好。

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  表格1 线性关系考察

  Table 1.Linear relationship investigation

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2.5 精密度试验

取混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰面积的RSD分别为0.18%、0.94%、1.03%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（企业28，批号：20220901）分别在放置0、3、6、9、12、17、24、37、48 h时取样，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。计算得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰面积的RSD分别为0.53%、1.50%、0.77%（n=9），结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一样品（企业28，批号：20220901），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。计算得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的平均含量为89.70、11.55、21.59  μg/g，RSD分别为0.53%、2.11%、0.82%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密量取3种不同浓度的对照品溶液苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱各1 mL，再精密称取同一样品（企业28，批号：20220901）1.5 g，按“2.2.2”项下方法制备回收率试验的供试品溶液，平行6份，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见表2。结果表明该方法回收率良好。

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  表格2 回收率试验结果（n=6）

  Table 2.Recovery test results (n=6)

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2.9 耐用性考察

选用不同厂家的色谱柱（Shim-pack Scepter C18和2根不同批号的CAPCELL PAK C18），照拟定的方法进行测定，计算得单酯型生物碱含量分别为198.414、206.645、202.943 μg/g，RSD为2.10%（n=3）。结果表明方法的耐用性良好。

2.10 样品测定

按照供试品方法制备，对149批小活络丸中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱含量进行测定，结果见表3。

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  表格3 149批小活络丸单酯型生物碱含量测定结果（μg/g，n=2）

  Table 3.Monoester alkaloids of content determination in 149 batches of Xiaohuoluo pills (μg/g, n=2)

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2.11 质量分析

2.11.1 拟定限度

选取合格制川乌和制草乌各3批，按处方生产工艺，制备模拟制剂3批。以拟定方法测定制川乌、制草乌和模拟制剂各3批。模拟制剂中3种单酯型生物碱含量分别为200.122、160.311、167.020  μg/g，从而计算转移率分别为85.2%、92.1%、88.1%。适合工业化大生产，在最低转移率85.2%的基础上下浮20%，即以65.2%转移率计算小活络丸中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱的总含量，结果应不低于55.1  μg/g。

最低总含量=（0.070%×180 g/1917  g+ 0.020%×180 g/1 917 g）×65.2%=55.1 μg/g

注：0.070%和0.020%分别为制川乌和制草乌3种成分的最低限量值；炼蜜按粉末1.25倍量（180×4+66×2）×1.25=1 917 g加入。

2.11.2 质量结果分析

建立HPLC法对28个生产企业149批小活络丸的3种单酯型生物碱含量进行检测，结果见图2和图3。

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  图2 3种单酯型生物碱含量频数分布图

  Figure 2.Frequency distribution of three monoester alkaloids

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  图3 28个企业149批样品中3种单酯型生物碱含量箱线图

  Figure 3.Box plots of the contents of three monoester alkaloids in 149 batches of samples from 28 enterprises

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149批样品单酯型生物碱的含量为7.717~ 448.482 μg/g。从频数图可以看出，14批样品含量低于100 μg/g，均来自企业10；81批样品含量处于101~200 μg/g，42批样品含量处于201~300 μg/ g；12批样品含量高于300 μg/g，涉及5家企业，分别为企业9、企业14、企业19、企业22和企业27。单酯型生物碱含量集中分布于100~300 μg/g区间内，共计123批，占比82.6%，说明多数企业制川乌和制草乌的原料药质量较好。

从箱线图可以看出，企业9有1批、企业13有2批、企业21有1批，以上3个企业的单酯型生物碱含量出现了异常值，波动较大，表明这3个企业对制川乌和制草乌来源及生产工艺参数控制不太稳定。另外，企业27的单酯型生物碱含量均值最高，企业9含量均值次之，企业10含量均值最低，其间的含量均值差异也较大，提示生产企业需加强原料药的质量控制。

结合拟定限度分析，有5批样品（企业10，批号：20210701、20220105、20220104、20211005、20211010）中3种单酯型生物碱含量低于拟定限度，其中有1批（7.717 μg/g）严重低于拟定限度（55.1 μg/g）。为估算该样品中制川乌和制草乌的投料量，分别按制川乌和制草乌处方用量的5%和10%制备模拟制剂各3批，以拟定方法测定，结果显示5%和10%模拟制剂中3种成分总量平均值分别为8.925 μg/g和17.650  μg/ g，计算样品中制川乌和制草乌的投料约为处方正常用量的4.3%。提示该企业生产的小活络丸（大蜜丸）在投料方面存在严重风险。

本次检测中发现有1个企业的5个批号的小活络丸（大蜜丸）样品中3种单酯型生物碱总量低于拟定限度，其中1个批号严重低于拟定限度。

3 讨论

3.1 提取溶剂和方法的考察

本研究考察了加入0.1 mol/L盐酸量分别为20、25、30、50 mL时3种生物碱的提取率，结果无明显差异，因此选取25 mL作为提取溶剂量。考察了加入25 mL水、0.1 mol/L盐酸、0.2 mol/ L盐酸3种不同溶剂超声处理40 min及0.1 mol/L盐酸分别超声处理提取15、30、45、60 min对3种单酯型生物碱提取率的影响，结果表明以0.1  mol/ L盐酸为提取溶剂，超声处理45 min时，3种单酯型生物碱的提取率最大。综合考虑各因素影响，最终选择加入0.1 mol/L盐酸25 mL、超声处理45  min为最终提取条件。

3.2 样品测定

小活络丸中制川乌、制草乌同为君药，3种单酯型生物碱为其主要有效成分。通过本研究发现：该批样品（企业10，批号：20210701）中制川乌、制草乌投料量仅为正常投料的4.3%（处方中制川乌、制草乌用量约为每100 g制剂中投料18.8 g，该批次用量为每100 g制剂中投料0.79 g），该企业疑似存在未按处方投料或以劣药投料的情况；另外，不同生产企业、同一企业不同批次之间的质量差异较大，这可能与各企业的原药材以及具体生产工艺流程有关，提示各生产企业需加强监控生产过程以及关注药材源头的质量，完善企业内部原料、中间品和成品的质量控制标准，以保证药品质量。

3.3 方法评价

方剂中的君药是指针对主病或主证起主要治疗作用的药物[6]，医家有谓上药为君，主养命，大抵养命之药宜多君[7]。小活络丸中的制川乌和制草乌作为君药，3种单酯型生物碱为其主要有效成分，3种成分的减少将使制剂的临床药效降低，对有效性产生影响。制川乌和制草乌作为炮制品，炮制[8-11]的方法差异、不同产地的制川乌 [8,  12]和制草乌质量的差异，导致制川乌、制草乌中的单酯型生物碱含量高低不同，这也是不同企业间含量差异的原因之一；参考《中国药典》中制川乌和制草乌项下含量最低限度，结合转移率，制定出小活络丸制剂的最低限度。本研究中在采用HPLC法同时测定149批小活络丸中3个单酯型生物碱成分的含量的基础上，通过对检测数据进行分析，拟定了小活络丸中3种单酯型生物碱限量标准，方法简便、专属性强，为临床用药效果、制剂质量标准和评价整体质量提供了参考。

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