目的  对新型受体相互作用蛋白1（RIP1）激酶抑制剂的体内外生物活性及药动学进行初步研究，为后续新药开发提供参考。

方法  以GSK2982772为阳性参照，通过ADP-Glo方法评估新型RIP1激酶抑制剂对重组人源与鼠源RIP1激酶的抑制活性；采用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和凋亡抑制剂（Q-VD-OPh）建立细胞坏死模型，评估RIP1激酶抑制剂对人组织淋巴瘤细胞（U-937）与小鼠成纤维细胞（L-929）坏死抑制水平；考察RIP1激酶抑制剂经小鼠静脉及口服给药后的药动学；小鼠静脉注射mTNF-α诱导全身性炎症反应综合征（SIRS），口服给予RIP1激酶抑制剂通过防止体温损失评估治疗炎症的效果。

结 果   新型RIP1激酶抑制剂RIPK1-093、095、106对重组人源RIP1激酶抑制活性（4.55、7.38、10.93  nmol/L）与阳性参照化合物（18.93 nmol/L）相当，对重组鼠源RIP1激酶抑制活性（5.70、8.44  、70.58 nmol/L）优于阳性参照化合物（2 035.00 nmol/L）；对U-937细胞抑制坏死活性（4.92、2.95、6.84 nmol/ L）与阳性参照化合物（5.37  nmol/ L）相当，对 L-929细胞抑制坏死活性（8.59、6.54、41.34 nmol/L）优于阳性参照化合物（489.40  nmol/ L）；在小鼠药动学研究中，具有低清除率（P＜0.05），且口服暴露量显著提高（P＜0.05），其中RIPK1-106口服暴露量提升约4倍；在SIRS模型中，口服治疗10  mg/kg剂量组显示，6  h时体温损失与阳性参照化合物相当，24  h显著抑制体温损失（P ＜0.05），3 mg/kg剂量组显示，6 h体温损失显著减小（P＜0.05），且24 h显著改善动物死亡率。

结论  新型RIP1激酶抑制剂的体内外活性和药动学的特点，可以作为治疗炎症性和自身免疫性疾病的新药进一步开发研究。

受体相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinases，RIPKs）作为一种重要的上游激酶，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，已被证明可通过支架功能和激酶功能调节炎症反应[1]。RIPKs家族共有7个成员，其中受体相互作用蛋白（receptor interacting protein，RIP）1激酶处于先天免疫反应相关信号传导的关键节点。RIP1激酶的泛素化和磷酸化调节决定了细胞的存活、凋亡和坏死，因此，RIP1激酶的失调将严重影响炎症性疾病的结局[2]。RIP1激酶通路上关键蛋白的突变可导致自发的、强烈的炎症表型。在小鼠上皮特异性死亡结构域蛋白（fas-associating protein with a novel death domain，FADD）敲除产生的自发皮肤炎症中，RIP1~RIP3介导的角质形成细胞坏死发挥了关键的作用[3]。SHARPIN缺失的小鼠发生严重的皮肤和多器官炎症，RIPK1K45A可保护这种慢性增生性皮炎相关的病理损伤[4]。最近研究表明，上调的RIP1激酶活性可以通过直接调控程序性坏死、促炎细胞因子产生、炎性小体组装和某些形式的致病性细胞凋亡来驱动炎症。RIP1激酶已被证明是死亡受体肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）、凋亡相关因子配体（FasL）和TNF相关凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）下游通路以及Toll样受体促炎途径的关键驱动因素[5]。因此，阻断这一途径有可能为多种炎症性疾病带来广泛的治疗益处。研究和开发高活性、高选择性以及安全性的RIP1激酶抑制剂对临床相关疾病治疗有着十分重要的意义。

RIP1激酶作为调节炎症反应和细胞坏死的关键蛋白，目前尚未有以其作为靶点的药物获批上市。葛兰素史克公司公司开发的GSK2982772是最早进入临床研究的小分子抑制剂，目前处于Ⅱ期临床研究阶段[6]。Takeda公司通过高通量筛选得到苗头化合物10，其与GSK2982772在RIP1口袋可很好的叠合（图1），根据构效关系进一步优化得到候选化合物22（图2）[7]，包含4-氧代-6,7-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶部分作为母核结构。然而，GSK2982772在人和啮齿类动物上较大的活性种属差异限制了临床前有效的药效学和毒理学研究，化合物22有限的药动学性质也限制了其后续的开发。基于化合物22的共晶结构，其结合于非三磷酸腺苷（adenosine triphoshate，ATP）口袋附近的别构位点，核心结构与RIP1激酶Asp156在1号位置的氮原子和7号位置的羰基之间形成了一个氢键网络，苄基与ATP结合位点后面的变构疏水深口袋结合（图3）[7]，发现RIP1激酶口袋仍有足够的结合空间，经过系列的筛选优化，研究得到活性和药动学性质较好的化合物系列新型RIP1激酶抑制剂（RIPK1）-093、095、106，并且与化合物22具有相似的结合模式（图4） [8]。本研究探讨了该化合物系列对RIP1激酶活性和细胞坏死的影响，同时分析了其在小鼠体内的药动学过程以及在全身性炎症反应疾病模型中的治疗效果，为后续RIP1激酶抑制剂的开发提供支持。

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  图1 化合物10（白色）与GSK2982772（黄色）的叠合结果[7]

  Figure 1.Stacking results of compound 10（white）with GSK2982772 (yellow)[7]

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  图2 Takeda化合物22设计优化过程

  Figure 2.Design optimization process of Takeda compound 22

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  图3 化合物22的共晶结构[7]

  Figure 3.The co-crystal structure of compound 22[7]

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  图4 新型RIP1激酶抑制剂设计思路[8]

  Figure 4.Design concept for novel RIP1 kinases inhibitors[8]

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1 材料与方法

1.1 主要仪器

2185A18022457细胞计数仪（Invitrogen公司）；Cytation 3酶标仪（Biotek公司）；TQ-S-Mirco三重四极杆高效液相质谱仪（美国沃特世公司）；Sorvall ST16R高速低温离心机（Thermo Fisher公司）；AZ8856高精度温度计（台湾衡欣公司）。

1.2 主要药品与试剂

乙腈（质谱级，Fisher公司，批号：215625）；甲酸（质谱级，Fisher公司，批 号：212271）；蒸馏水（屈臣氏公司，批号：20211231）；二甲基亚砜（色谱级，DMSO，Fisher公司，批号：210435）；Hepes（SignalChem公司，批号：H3375）；BSA（SignalChem公司，批 号：CR84- 100）；氯化钠（SignalChem公司，批号：7647-100）；氯化镁（SignalChem公司，批号：M1028-100 mL）；CHAPS（SignalChem公司，批 号：C3023）；二硫苏糖醇（SignalChem公司，批号：43816-50 mL）；ADP-GloTM检测试剂盒（Promega公司，批号：V9102）；人源RIP1重组蛋白（SignalChem 公司，批号：R07-11G）；鼠源RIP1重组蛋白（SignalChem公司，批号：R07M-11G）；mTNF-α（义翘神州生物，批号：50349-MNAE）；hTNF-α（Gibco公司，批号：PHC3016）；Q-VD-OPh（Merk公司，批号：551476）；OptiPlate-384F板（珀金埃尔默，批 号：6007290）；胎牛血清（Gibco公司，批 号：10099141）；384孔板（Corning公司，批号：3570）；CellTiter-Glo试剂（Promega公司，批号：G7572）。

RIPK1-093（中国医药研究开发中心有限公司，批号：210400- 065，纯度100.00%）；RIPK1-095（中国医药研究开发中心有限公司，批号：210461-023，纯度99.90%）；RIPK1-106（中国医药研究开发中心有限公司，批号：210465-034，纯度99.99%）；GSK2982722（MedChemExpress公司，批号：113186，纯度98.98%）。

1.3 细胞与动物

U-937细胞（南京科佰生物科技有限公司，货号：CBP60277）；L-929细胞（南京科佰生物科技有限公司，货号：CBP60878）。

ICR雄性小鼠和C57BL/6J雄性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，使用许可证号：SYXK（京）2019-0051。本研究经中国医药研究开发中心有限公司实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：211224-113、220323-028）。

1.4 方法

1.4.1 人源和鼠源RIP1激酶活性抑制实验

应用ADP-Glo™激酶检测方法，通过定量激酶反应过程中产生的ADP的量来测定激酶活性，检测中产生的发光信号强度与激酶活性成正比[9]。

将浓度均为1 mmol/L的新型RIP1激酶抑制剂溶液和化合物GSK2982772溶液（均溶于DMSO）按1 ∶ 3梯度稀释系列浓度于稀释板，共稀释10个梯度。从稀释板转移10  nL至OptiPlate-384 F实验板后，每孔加入90  nL DMSO，各浓度平行两个复孔，阴性对照组和阳性对照组每孔加入100  nL DMSO。将0.794  µmol/ L的重组人源RIP1激酶蛋白/1.588  µmol/L的重组鼠源RIP1激酶蛋白分别用反应缓冲溶液（含50.00 mmol/L HEPES pH 7.5、0.02% CHAPS、50  mmol/L氯化钠、30 mmol/L氯化镁、1 mmol/ L二硫苏糖醇、0.05% BSA）稀释19.85倍/9.93倍至40 nmol/L，分别取5 µL/孔加入到实验板的化合物测试组及阳性对照组中，阴性对照组加入等体积的反应缓冲液。室温孵育30 min，将10  mmol/L ATP用反应缓冲溶液稀释100倍至100  µmol/L，取5 µL/孔加入到实验板中，25  ℃孵育4 h；将实验板置于室温条件放置5 min，加入10 µL/孔ADP-Glo试剂盒中的Reagent，室温孵育40  min；加入20  µL/孔ADP-Glo试剂盒的Detection reagent，室温孵育30  min，使用酶标仪读取发光值（L），并计算激酶活性抑制率[1-（L_化合物孔-L_{阴性对照孔}） /（L_{阳 性 对照孔}-L _{阴 性 对 照 孔}）×100%]。以激酶活性抑制率为纵坐标，化合物的浓度为横坐标，使用Graphpad 8.0拟合剂量-效应曲线，得到化合物的半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC₅₀）。

1.4.2 人组织细胞淋巴瘤细胞U-937和小鼠成纤维细胞L-929坏死抑制实验

RIP1激酶抑制剂的效应通过体外细胞坏死抑制实验进行检测。将U-937/L-929细胞从液氮中取出复苏并培养于含有10%胎牛血清、100  µg/ mL链霉素和100 U/mL青霉素的1  640培养基/MEM培养基中。检测时将细胞分别以17  500个/孔和1 750个/孔的密度接种于384孔板，体积为35 µL/孔。将30 mmol/L的新型RIP1激酶抑制剂溶液和GSK2982772溶液（溶于DMSO）按1 ∶ 3梯度系列稀释，共9个浓度，经培养基稀释100倍后，取5 µL加入到384孔板的细胞中。阳性对照孔加入5 µL浓度为50 μmol/L的GSK2982772，阴性对照孔加入等体积的含有0.1% DMSO的培养基。将Q-VD-OPh溶液（溶于DMSO）及hTNF-α/mTNF-α溶液（溶于无菌水）用培养基稀释后加入到384孔板的细胞中，反应终体系为50 µL，Q-VD-OPh终浓度为25  µmol/ L，hTNF-α/mTNF-α终浓度为100  ng/ mL。将细胞培养板放置培养箱中，在37  ℃、5%CO₂下孵育48 h。将细胞培养板取出，加入30 μL CellTiter-Glo试剂振荡混匀，室温孵育10 min后使用酶标仪读取发光值，并计算相对L（L_化合物孔-L_{阴性对照孔}）。以相对L为纵坐标，化合物的浓度为横坐标，使用Graphpad 8.0拟合剂量-效应曲线，得到化合物的IC₅₀。

1.4.3 新型RIP1激酶抑制剂在全身炎症反应综合征模型中的药效实验

取 mTNF-α溶解于无菌注射用水中配制成浓度为0.2 μg/μL的溶液，给予实验用雄性6周龄的C57BL/6J小鼠54只，每只静脉注射0.1 mL，造全身炎症反应综合征模型，模型表现为体温降低[10]。

本实验分为6组，包括阳性对照组（3    mg/ kg和10 mg/kg剂量组）、实验组（3 mg/kg和10  mg/ kg剂量组）、阴性对照组和造模组。给药方法：将不同剂量的实验品用含有3% DMSO和20%羟丙基-β-环糊精的溶媒溶解。阳性对照组：每剂量组6只，分别口服给予3 mg/kg和10  mg/ kg剂量的GSK2982772。实验组：每剂量组6只，分别口服给予3 mg/kg和10 mg/kg剂量的新型RIP1激酶抑制剂（RIPK1-093、095、106）。阴性对照组：6只小鼠口服给予溶媒15  min后静脉注射0.1 mL无菌水。造模组：6只小鼠口服给予溶媒。

给药15 min后，每只小鼠静脉注射20 μg mTNF-α[11]，用电子温度计检测小鼠直肠位温度，连续监测注射小鼠重组TNF-α后1、2、3、4、5、6、24 h小鼠的体温值及死亡率。

1.4.4 小鼠药动学实验

雄性6周龄ICR小鼠静脉给予1 mg/kg新型RIP1激酶抑制剂，口服给予2 mg/kg新型RIP1激酶抑制剂。每个受试物3只静脉给药，3只口服给药。静脉注射液与口服给药溶媒相同，为3% DMSO和20%羟丙基-β-环糊精溶液。

采用眼眦静脉丛采血，肝素钠抗凝，离心得血浆后冻存直至分析[12]。精密量取血浆样品10  μL，向其中加入100 μL 5 ng/mL的盐酸维拉帕米乙腈溶液，涡旋剧烈震荡5 min，用高速低温离心机以2 112×g离心10 min。取上清液50  μL，加入100 μL乙腈混匀，以2 112×g离心10 min，取上清液，置于进样盘中检测分析。

1.4.5 样品测试

色谱条件：色谱柱为Waters BEH C₁₈柱（50  mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为A（含1  mol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液）-B（乙腈）；梯度洗脱（0~0.2 min，30% B；0.2~1.6 min，30%~98% B；1.6~2.4 min，98%~30% B）；流速为0.4  mL/min；进样器温度：4 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压为1 kV；脱溶剂气温度为500  ℃；离子源温度为150 ℃；锥孔气流量为50 L/Hr；脱溶剂气流量为1 000 L/Hr；多反应监测扫描方式；定量离子对分别为：RIPK1-093（m/z 534.16 ＞90.82）；RIPK1-095（m/z 536.19＞331.80）；RIPK1-106（m/z 554.19＞349.75）；GSK2982772（m/ z 377.99＞185.99）。

1.4.6 数据处理

用标准曲线对样品进行定量分析。用Mas Studio软件对血药浓度进行统计分析，得到药时曲线及主要药动学参数。

1.5 统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新型RIP1激酶抑制剂对人源和鼠源激酶活性抑制的影响

使用人源和鼠源重组RIP1激酶，应用ADP-Glo™激酶检测方法研究RIPK1-093、095、106对RIP1激酶催化活性的抑制作用。结果显示，RIPK1-093、095、106抑制人源RIP1激酶活性IC₅₀值分别为4.55、7.38、10.93  nmol/ L，与阳性药物GSK2982772抑制RIP1激酶的活性相当（18.93 nmol/L）。GSK2982772对啮齿类动物的RIP1激酶表现出弱的抑制作用。其抑制RIP1激酶活性的IC₅₀为2 035.00 nmol/L，而新型RIPK1-093、095、106抑制鼠源RIP1激酶活性的IC₅₀值分别为5.70、8.44、70.58 nmol/L，对啮齿类动物的RIP1激酶也表现出显著的抑制（图5）。

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  图5 RIPK1-093、095、106和GSK2982772对人（A）和小鼠（B）RIP1激酶活性抑制的影响

  Figure 5.Inhibitory effect of RIPK1-093, 095, 106 and GSK2982772 on human (A) and mouse (B) RIP1 kinase activity

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2.2 新型RIP1激酶抑制剂对TNF-α介导的U-937和L-929细胞坏死抑制的影响

FasL、TNF-α和TRAIL在半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease，Caspase）被抑制的情况下可诱导细胞坏死的发生[13-14]。结果显示，RIPK1-093、095、106的处理抑制了细胞死亡，U-937细胞坏死抑制IC₅₀分别为4.92  、2.95、6.84  nmol/ L，与阳性药物GSK2982772有相当的活性（5.37  nmol/ L）。在L-929细胞中，同其较低的RIP1激酶抑制活性一致，GSK2982772抑制细胞坏死的活性仅为489.40  nmol/L。而RIPK1- 093、095、106的细胞坏死抑制IC₅₀分别为8.59、6.54、41.34 nmol/L，活性优于GSK2982772（图6）。

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  图6 RIP1激酶抑制剂对U-937细胞（A）和L-929细胞（B）的增殖抑制影响

  Figure 6.Effects of RIP1 kinases inhibitors on proliferation inhibition of U-937 cells (A) and L-929 cells (B)

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2.3 新型RIP1激酶抑制剂在全身炎症反应综合征中的治疗效果

阴性对照组小鼠体温恒定，维持在37.01 ℃左右。模型组在静脉给予TNF-α后，6 h小鼠体温下降至27.30 ℃，且24 h后6只动物全部休克死亡。口服给予10 mg/kg RIPK1-093、095、106治疗，在TNF-α静脉注射6 h时RIPK1-093、095、106相比于模型组，分别使小鼠体温损失减少52.12%、59.65%、64.17%，在保护小鼠体温损失方面与GSK2982772药效相似（体温损失减少47.00%）。且在24 h时小鼠全部存活，体温分别为35.37、35.77、35.67 ℃，显著预防小鼠的体温下降，优于GSK2982772（P＜0.05）。给予3 mg/kg 的RIPK1-093、095、106在24 h也均无小鼠死亡，在TNF-α静脉注射6 h时可使小鼠体温损失减少37.37%、63.87%、56.34%，显著优于GSK2982772（P＜0.05）。24 h时体温分别为26.63、35.33、29.97 ℃，而口服给予GSK2982772治疗的6只小鼠24 h后全部休克死亡（图7）。

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  图7 RIPK1-093（A、D）、RIPK1-095（B、E）、RIPK1-106（C、F）在全身炎症反应综合征模型中的体温随时间变化曲线及显著性差异图（n=6）

  Figure 7.Curves of the temperature over time in the model of SIRS response by RIPK1-093（A、D）、RIPK1-095（B、E）、RIPK1-106（C、F） and significant difference map（n=6）

  注：aP<0.0001。

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2.4 新型RIP1激酶抑制剂的体内药动学分析

HPLC-MS/MS分析方法验证结果显示，小鼠血浆中的RIPK1-093、095、106在5  ~5  000  μg/ L浓度范围内线性关系良好，r大于0.99，定量下限为5 μg/L；且该方法系统适用性、批内和批间准确度及精密度、特异性、残留各验证参数符合可接受标准，可用于小鼠血浆中RIPK1-093、095、106的浓度测定[15]，血药浓度-时间曲线具体见图8。

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  图8 静脉/口服给予剂量为1 mg/kg /2 mg/kg的RIP1激酶抑制剂后ICR小鼠血浆药物浓度随时间变化曲线（n=3）

  Figure 8.Plasma drug concentration profiles over time in ICR mice after intravenous/oral administration of RIP1 kinases inhibitors at doses of 1 mg/kg /2 mg/kg （n=3）

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与GSK298277相比，静脉给予1 mg/kg RIPK1-093、095、106在小鼠体内具有较低的清除率（P＜0.05），可在体内进行稳定的代谢。口服给予2 mg/kg RIPK1-093、095、106在峰值浓度和半衰期与阳性化合物GSK2982772持平，口服暴露量显著提高（P＜0.05），其中RIPK1-106的口服暴露量是GSK2982772的约4倍，药动学参数见表1和表2。

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  表格1 ICR小鼠经静脉分别给药RIP1激酶抑制剂（1 mg/kg）后血浆中的药动学参数（x ± s，n=3）

  Table 1.Pharmacokinetic parameters of RIP1 kinases inhibitor in plasma of ICR mice after intravenous administration at 1 mg/kg ( x ± s, n=3)

  注：与GSK2982772相比，aP<0.05；C0为0时血浆药物浓度；AUC（0-t）为0-t时间内曲线下面积；AUC（0-inf）为0~无穷大时间内曲线下面积；T1/2为半衰期；Vz为表观分布容积；CL为清除率。

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  表格2 ICR小鼠经口服分别给药RIP1激酶抑制剂（2 mg/kg）后血浆中的药动学参数（x ± s，n=3）

  Table 2.Pharmacokinetic parameters of RIP1 kinases inhibitor in plasma of ICR mice after oral administration at 2 mg/kg ( x ± s, n=3)

  注：与GSK2982772相比，aP<0.05；Tmax为达峰时间；Cmax为药物的峰值浓度；F为生物利用度。

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3 讨论

RIP1激酶已被证实在一些炎症及自身免疫性疾病的发生发展中扮演重要角色。RIP1激酶作为支架蛋白能够促进促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路的激活，并抑制细胞凋亡和坏死性凋亡，同时其作为激酶又反常地诱导细胞凋亡和坏死发生[1]。在关节炎、银屑病患者病理组织中观察到RIP1磷酸化的上调[16-17]。RIP1磷酸化介导TNF-α信号通路向凋亡和坏死转变，抑制RIP1激酶活性可能为自身免疫性疾病和炎症性疾病带来获益。

在本研究中，经过前期的筛选优化，发现了活性和药动学性质较好的化合物系列RIPK1-093、095、106。GSK2982772对小鼠RIP1激酶的抑制活性弱于人源108倍，与其临床前研究数据报道基本一致（156倍）[14]。但RIPK1-093、095、106对人源和鼠源的RIP1激酶活性均具有较好的抑制作用，并且在RIP1激酶驱动的细胞坏死模型中也进一步证实了这类新型抑制剂的效果。小鼠与人类的RIP1激酶存在70%的同源性，小鼠RIP1激活环中的关键氨基酸的突变，如V159L、T164M、Q176L、S180D和S181G，可以增强RIP1激酶抑制剂对啮齿类动物的抑制效力[18]。本课题组开发的新型RIP1激酶抑制剂可能避开了与这些关键氨基酸位点的相互作用，降低了种属差异。在使用啮齿类动物进行药效和安全性的研究中，新型RIP1激酶抑制剂对啮齿类动物RIP1激酶的抑制效果显著提高了实验的可行性。

鉴于新型抑制剂优异的体外活性，其在TNF-α诱导的急性致死性休克小鼠模型上进一步评估。RIP1的激酶活性对TNF-α引发的坏死性凋亡至关重要[19]，以RIP1介导的坏死性凋亡作为治疗SIRS的潜在靶标存在可能性。注射TNF-α导致全身性炎症反应，表现为低血压、肝炎、体温过低和肠坏死，已有研究证实这种急性致死性休克的保护作用具有RIP1激酶依赖性[10]。RIPK1-093、095、106在保护小鼠体温损失方面优于GSK2982772，特别是死亡率，GSK2982772在3 mg/kg治疗剂量下，24 h小鼠全部死亡，而新型抑制剂可使动物体温恢复至接近正常水平。

良好的体内药动学特征也是药物发挥药效的关键因素。在系统性炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗中，血药浓度和全身血液系统的暴露量是药物发挥疗效的关键驱动因素。相同给药剂量条件下，RIPK1-093、095、106的AUC显著提高，观察到其与GSK2982772有相似的达峰浓度和半衰期，新型RIP1激酶抑制剂AUC的提升可能来源于其在体内清除速率的减慢，但生物利用度低于GSK2982772，在一定程度上反映出新型RIP1激酶抑制剂的吸收弱于GSK2982772。在药动学测试方法方面，为更完整的观测小鼠药时曲线，采用连续微量采血。同时开发出微量生物样品分析方法，每个样品前处理仅消耗10  μL，在更完整药时曲线的观测方面起到积极作用。

目前，TNF-α单抗已广泛应用于自身免疫性疾病的治疗[20]，RIP1激酶作为TNF-α下游重要的调控因子，抑制其激酶活性或许能够为这类患者带来临床获益。但值得注意的是，TNF-α介导的NF-κB激活不依赖于RIP1的激酶活性，可能是RIP1激酶作为治疗靶标影响炎症性疾病和自身免疫性疾病治疗效果的另一个重要因素。

本研究基于结构进行药物设计，并根据构效关系对分子进行一系列优化，开发出一类高活性且在体内具有较好药动力学特征的新型RIP1激酶抑制剂。该类衍生物在体外具有较好的RIP1激酶抑制活性，在hTNF-α诱导的U-937细胞坏死模型中，抑制活性均小于10 nmol/L，且在动物体内有较高的暴露量和较长的半衰期，展示出好的成药性。在mTNF-α诱导的SIRS模型中，与GSK2982772相比，具有更好的抑制全身性炎症反应的效果[21]。该类化合物作为候选分子进行后续的临床开发，有望为炎症性和自身免疫性疾病的治疗提供新策略。

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