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目的 建立鲁索替尼固体脂质纳米粒（Ru-SLN）包封率的测定方法。
方法 以熔融乳化-超声法制备Ru-SLN，以超滤离心法分离游离药物和Ru-SLN，采用HPLC法测定Ru的含量，并计算其包封率。
结果 Ru在4.08~408.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.999 7），平均回收率为101.60%，RSD为1.09%（n=9）；超滤离心法选择截留分子量为10 kDa的超滤离心管，10 961×g离心10 min，无显著膜吸附作用，测得Ru-SLN的包封率为（97.01±1.23）%。
结论 超滤离心法结合HPLC法测定Ru-SLN包封率快速便捷、准确性高，可为Ru制剂含量及包封率的测定提供有效的试验指导。
鲁索替尼（ruxolitinib，Ru）是选择性Janus激酶（Janus kinase，JAK）抑制剂，能够选择性抑制JAK1和JAK2，防止以JAKs为介导的细胞因子或其他分子将外界信号传递至细胞核[1-2]。其口服片剂（商品名：Jakavi）是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的首个用于治疗骨髓纤维化的口服药物[3]，也是治疗对羟基脲治疗效果不充分或不耐受的真性红细胞增多症的二线用药[4]；其外用乳膏（商品名：Opzelura）是FDA批准作为非节段性白癜风的首个家庭治疗药物[5]，对白癜风、特应性皮炎、斑秃等皮肤疾病具有较好的疗效 [6- 8]。2023年8月，Opzelura落地国内医疗先行区，针对治疗白癜风开出国内首张处方，为白癜风治疗药物迎来新突破。然而，乳膏作为经皮给药载体，药物的透皮效果及皮肤滞留效果还有很大的提升空间 [9-10]。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）作为一种新型的给药载体，能够提高药物稳定性和溶解性，控制粒径从而提高药物经皮渗透量和皮肤滞留率等[11]，在多种给药途径中均具有较大的开发潜力和市场前景 [12]。将Ru制备为SLN，有望提高药物经皮给药透过量和皮肤滞留率，在较小给药量下达到满意的治疗效果。
包封率是SLN处方工艺筛选和质量评价的重要指标，国家药品监督管理局新药审评中心2021年8月27日发布的《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》中特别强调了应根据纳米药物的特点对包封率进行方法的适用性研究和验证[13]。常用的包封率测定方法有超滤离心法、超速离心法、微柱离心法和分子排阻色谱法等[14]。超速离心法对仪器要求较高；微柱离心法需人工补充凝胶填料，易受人为影响导致测定结果不准确；透析法的透析时间长，需要大量透析介质；超滤离心法简便易于操作，适用范围广，是较为常用的方法之一[15]。本文将HPLC法与超滤离心法相结合，建立一种专属性强、准确、高效的Ru-SLN包封率测定方法，旨在为Ru纳米制剂含量及包封率的测定提供试验基础。
1 材料
1.1 主要仪器
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；SCIENTZ-IID超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HT165R高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；90PlusPALS纳米粒度及Zeta电位分析仪（美国布鲁克海文仪器公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Ultimate3000高效液相色谱仪，包括LPG-3400SDN进样泵、WPS-3000SL ANALYTICAL自动进样器和VWD-3100检测器（美国赛默飞世尔科技公司）；HT-7800透射电子显微镜（株式会社日立制作所）。
1.2 主要药品与试剂
Ru（南京泽和医药科技有限公司，批号：202203001，纯度99.7%）；聚氧乙烯氢化蓖麻油CO-40（上海源叶生物科技有限公司，批号：S25692）；月桂酸（上海源叶生物科技有限公司，批号：S24134）；大豆卵磷脂（LIPOID，批号：579010-1210122-01/713）；乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 Ru-SLN的制备
采用熔融乳化-超声法制备Ru-SLN[16]。精密称取Ru 80 mg、月桂酸80 mg，在75 ℃下加热搅拌熔融，得油相；精密称取CO-40 750 mg、大豆卵磷脂300 mg，置于15 mL超纯水中溶解混匀，得水相。待水相加热至与油相等温后缓慢滴入油相中并以1 000 r/min转速搅拌20 min，得初乳；将初乳常温超声（功率：480 W，off：5 s，on：5 s）10 min后置于冰浴中固化10 min，以超纯水定容至20 mL，得Ru-SLN。按上述方法制备不含主药Ru的空白SLN。
2.2 Ru-SLN 粒径的测定
以超纯水将Ru-SLN适当稀释后，使用粒度分析仪的动态光散射（dynamic light scattering，DLS）测定Ru-SLN的平均流体动力学粒径（nm）及多分散指数（polydispersity index，PDI）。结果得到Ru-SLN的平均粒径为（41.58±2.83） nm，PDI为0.248±0.011。纳米粒径范围应在10~1 000 nm之间，Ru-SLN符合纳米粒径范围；PDI范围在0~0.5内，Ru-SLN分散较均匀。Ru-SLN的粒径分布见图1。
2.3 Ru-SLN形态的测定
以超纯水将Ru-SLN适当稀释后，吸取10 μL滴于有支撑膜的铜网上，自然挥干，重复滴加3次，再滴加2%磷钨酸溶液10 μL负染，自然挥干，复染3次，于透射电子显微镜下观察Ru-SLN。由图2可知，Ru-SLN整体呈圆形、大小较均一，分布较均匀，透射电子显微镜下粒子粒径与动态光散射法测定结果相似。
2.4 Ru含量测定方法的建立
2.4.1 色谱条件
色谱柱：Horizon C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：含0.05%磷酸的10 mmol/ L碳酸氢铵水溶液-乙腈（55 ∶ 45）；检测波长：260 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
2.4.2 溶液的制备
对照品溶液：取Ru 20 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入适量乙腈充分溶解混匀后定容至刻度，得储备液（2 000 μg/mL）。精密量取储备液1 mL置于10 mL量瓶中，加入适量流动相充分混匀后定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，即得对照品溶液（200 μg/mL）。
供试品溶液：精密量取Ru-SLN混悬液1 mL置于10 mL量瓶中，加入适量乙腈超声10 min溶解破乳，再以流动相定容至刻度，摇匀后过0.22 μm微孔滤膜，即得。
阴性样品溶液：精密量取空白SLN混悬液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入适量乙腈超声10 min溶解破乳，再以流动相定容至刻度，摇匀后过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.4.3 专属性的考察
精密量取“2.4.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录色谱图，考察辅料对药物含量测定的影响。由图3可知，供试品与对照品在相同保留时间处有一色谱峰，而阴性样品无相应色谱峰，表明辅料对Ru的测定无干扰.
2.4.4 标准曲线绘制
精密量取“2.4.2”项下Ru储备液适量，以流动相稀释制成4.08、51.00、122.40、204.00、285.60、346.80、408.00 μg/mL的对照品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积。以浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并计算得回归方程Y=0.292 9X+0.667 6（r=0.999 7）。结果表明Ru在4.08~408.00 μg/mL内峰面积与浓度线性关系良好。
2.4.5 重复性试验
按照“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得供试品中Ru的平均含量为103.30 μg/ mL，RSD为0.56%（n=6），结果表明该方法重复性良好。
2.4.6 稳定性试验
精密量取“2.4.2”项下供试品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，记录峰面积，计算得峰面积的RSD为0.93%（n=8），结果表明Ru-SLN混悬液在24 h内稳定性良好。
2.4.7 精密度试验
精密量取“2.4.2”项下Ru储备液适量，以流动相稀释制成低、中、高浓度（160、200、240 μg/mL）待测液，按照“2.4.1”项下色谱条件将待测液于1 d内分别进样5次，记录峰面积，计算日内精密度；连续测定3 d，记录峰面积，计算日间精密度。结果表明该方法具有良好的精密度，具体见表1。
表格1 不同浓度Ru储备液的日内、日间精密度
Table 1.The intraday and daytime precision of Ru stock solution with different concentration
2.4.8 回收率试验
精密称取“2.4.2”项下Ru储备液适量与空白SLN混悬液1.0 mL，加入适量乙腈超声10 min破乳后以流动相定容，制成低、中、高浓度（160、200、240 μg/mL）待测液，按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得3个浓度Ru的平均回收率为101.60%，RSD为1.09%（n=9），表明该方法回收率良好，具体见表2。
表格2 不同浓度Ru储备液、B-SLN物理混合物的回收率（n=3）
Table 2.The recovery rates of the mixture of Ru stock solution and B-SLN with different concentration (n=3)
2.5 Ru-SLN包封率测定方法的建立
本文以超滤离心法测定Ru-SLN的包封率。按照“2.1”项下方法制备Ru-SLN，取Ru-SLN混悬液适量置于超滤离心管中，在冷冻离心机中离心后收集滤液，滤液经乙腈1 ∶ 1稀释后按照“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算游离药物量（W游离）；精密量取“2.4.2”项下供试品溶液适量，按照“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算总药物量（W总），根据公式计算Ru-SLN包封率：
包封率（%）=（W总-W游离）/W总×100%
2.5.1 截留分子量的筛选
精密量取B-SLN混悬液适量置于截留分子量为3、10、30 kDa的超滤离心管中，15 784 ×g离心30 min，收集滤液。滤液经稀释后置于粒径测定仪中检测纳米粒子情况，结果见图4。空白SLN混悬液经3、10、30 kDa的超滤管离心后滤液中均无相应粒子积分，初步表明3种超滤管均能有效截留纳米粒。
图4 不同截留分子量超滤离心管的滤液粒径图
Figure 4.Particle size image in ultrafiltration tubes with different molecular
注：A. 3 kDa；B. 10 kDa；C. 30 kDa；D. 空白SLN。
精密量取空白SLN混悬液适量置于截留分子量为3、10、30 kDa的超滤离心管中，15 784 ×g离心30 min，收集滤液。滤液分别在紫外分光光度计中510 nm波长处测定吸光度（A 滤 液），空白SLN经适当稀释后测定吸光度（A空白SLN），按公式计算截留率：截留率（%） =（A空白SLN-A滤液）/A空白SLN×100%，结果见表3。3、10、30 kDa超滤管中溶液透光率较高，表明3种超滤管均无纳米粒。
表格3 不同超滤离心管对空白SLN截留效果的影响（ x ± s，n=3）
Table 3.Retention effects of different ultrafiltration centrifugal tubes on blank SLN ( x ± s, n=3)
精密量取“2.4.2”项下对照品溶液适量置于截留分子量为3、10、30 kDa的超滤离心管中，15 784 ×g离心30 min，收集滤液。滤液经适当稀释后按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得对照品溶液在3种超滤管中的平均回收率分别为103.42%、98.75%、97.78%，RSD分别为6.11%、4.83%、0.03%（n=3），表明游离Ru均能通过3种不同分子量的超滤管。综上结果，选择截留分子量为10 kDa的超滤离心管进行后续Ru-SLN的离心试验。
2.5.2 离心力的筛选
精密量取“2.4.2”项下供试品溶液适量置于截留分子量为10 kDa的超滤离心管中，分别以7 015×g、8 878×g、10 961×g、13 263×g、15 784×g离心30 min，收集滤液。滤液经适当稀释后按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，包封率，考察不同离心转速对包封率的影响，结果见表4。离心力在8 878~13 263 ×g的范围内包封率较为稳定，最终选择10 961 ×g作为离心力。
表格4 不同离心转速对Ru-SLN包封率的影响（ x ± s，n=3）
Table 4.The influence of different centrifugal speed on Ru-SLN encapsulation rate ( x ± s, n=3)
2.5.3 离心时间的筛选
精密量取“2.4.2”项下供试品溶液适量置于截留分子量为10 kDa的超滤离心管中，分别以10 961×g离心10、20、30、40、50 min，收集滤液。滤液经适当稀释后按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算包封率，考察不同离心时间对包封率的影响，结果见表5。离心时间对包封率影响不大，最终选择最短离心时间10 min。
表格5 不同离心时间对Ru-SLN包封率的影响（ x ± s，n=3）
Table 5.The influence of different centrifugal time on Ru-SLN encapsulation rate ( x ± s, n=3)
2.5.4 超滤膜的吸附性考察
精密量取“2.4.2”项下Ru储备液适量，以流动相稀释制成低、中、高浓度（160、200、240 μg/mL）待测液，置于截留分子量为10 kDa的超滤离心管中，10 961 ×g离心10 min，收集滤液按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得3种浓度待测液的平均回收率分别为95.71%、96.71%、98.95%，RSD分别为1.45%、1.58%、1.82%（n=3），表明超滤管的滤膜对游离药物无吸附作用。
2.5.5 加样回收率考察
精密量取“2.4.2”项下Ru储备液适量，加入适量B-SLN以超纯水稀释制成低、中、高浓度待测液，置于截留分子量为10 kDa的超滤离心管中，10 961×g离心10 min，收集滤液按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算得3种浓度待测液的平均回收率为99.16%，RSD为1.24%（n=9），表明纳米粒对游离药物无吸附作用。
2.5.6 包封率的测定
按照“2.1”项下平行制备3批次Ru-SLN混悬液，分别取适量Ru-SLN置于截留分子量为10 kDa的超滤离心管中，10 961×g离心10 min，收集滤液，滤液经适当稀释后按照“2.4.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，计算包封率，结果见表6。
表格6 Ru-SLN包封率的测定结果（ x ± s，n=3）
Table 6.The determination results of Ru-SLN encapsulation rate ( x ± s, n=3)
3 讨论
3.1 流行相筛选
本研究为提高HPLC检测Ru含量的准确性，在试验前期，根据厂家所提供HPLC方法结合自身研究经验，考察碳酸氢铵/乙酸铵-乙腈的最佳流动相比例。结果发现，乙酸铵-乙腈体系在不同比例下峰形均前沿较严重，不对称度＜0.85；碳酸氢铵-乙腈（55 ∶ 45）峰形较好。但可能由于Ru为碱性化合物，易与色谱柱填料中的残留硅羟基形成氢键，导致峰形出现拖尾现象。磷酸可以降低流动相的pH，使碱性化合物质子化，从而减弱药物与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。本研究加入适量磷酸以改善峰拖尾情况，最终以含0.05%磷酸的10 mmol/L碳酸氢铵水溶液-乙腈（55 ∶ 45）作为HPLC测定Ru的流动相组成。
3.2 超滤法工艺筛选
在超滤法工艺筛选中，筛选不同截留分子量的超滤管时，常规方法为检测不同超滤管对纳米粒的截留效果。Ru-SLN粒径大小约为40 nm，3、10、30 kDa的超滤离心管平均孔径均＜10 nm，因此理论上均能有效截留纳米粒。本文以超滤液粒子大小和超滤管截留率分别考察超滤管对纳米粒的截留能力，以回收率考察超滤管对游离药物的透过作用，综合筛选最优超滤管。最后在粒径和透过作用均较优的前提下，选择超滤后粒子浓度最少的10 kDa超滤管。
在超滤法离心转速的筛选中，离心力在7 015~10 961×g时，随着离心力的增加，包封率轻微增大，可能是由于离心力的增加，质量较大的纳米粒紧贴超滤管内壁，导致游离药物穿过膜的效率减少，从而包封率增大；而离心力在10 961~15 784×g时，随着离心力的增加，包封率轻微减小，可能是过高的离心力导致膜破损，使药物泄露，从而包封率减小。
在离心时间的筛选中，离心时间在30~50 min时，随着离心时间的增加，包封率也存在轻微增大。理论上，随着离心时间的增加，包封率应越低，可能是由于浓度极差导致该现象[17]。浓度极差是由于在超滤离心过程中，膜内溶剂和游离药物均能透过超滤膜，大分子的纳米粒被保留在膜内，这会导致膜内表面的大分子浓度增加，从而引起膜内表面的渗透压增大，阻碍溶剂继续向膜外扩散而降低溶剂和游离药物的透过率。
在试验过程中，还考察了离心时控温与否对包封率的影响，发现控温所得包封率结果更加稳定。长时间的离心过程，高速旋转会导致离心机温度过高，Ru及SLN辅料对热稳定，虽然离心时控温与否对纳米粒泄露无显著影响，但高温会使超滤管更易破裂或膜泄露，这提示以超滤离心法测定药物包封率时，无论药物及辅料是否对热稳定，都应以控温离心。
3.3 小结
Ru治疗骨髓纤维化和真性红细胞增多症早已在临床上表现出显著的治疗作用[18-19]，近年来的研究也提示该药在皮肤疾病上的显著疗效[20-22]，在未来将会成为一个被广泛研究的明星药物。本文以HPLC法测定Ru的含量，该法对于Ru专属性高，线性范围广，重复性、稳定性、精密度、回收率较好。结合超滤离心法测定Ru-SLN的包封率, 测得Ru-SLN平均包封率为（97.01±1.23）%，该法重现性好、准确度高，是一种具有应用价值的方法，可为未来Ru含量及包封率的测定提供理论依据。
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