目的  建立15批达原饮物质基准指纹图谱及多指标成分含量测定方法，研究量值传递规律，为经典名方达原饮的质量控制及评价提供参考。

方法  遵古考证制备15批达原饮物质基准样品，采用HPLC法建立达原饮指纹图谱及多成分含量测定方法，明确色谱峰归属及批次间相似度差异，通过指标性成分含量测定了解药材到物质基准量值传递规律，建立达原饮物质基准质量研究体系。

结果  15个批次达原饮物质基准指纹图谱以黄芩苷为参照峰通过相似度软件计算得相似度均＞0.97，有24个共有峰，参照对照品图谱指认出12个色谱峰。含量测定以芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷成分含量较高，且转移率也较高，厚朴的转移率最低。

结论  指纹图谱结合多指标成分含量测定方法适用于达原饮物质基准的质量控制与评价，操作便捷，结合整体量值传递规律，为达原饮的质量控制和后续的制剂开发提供了科学依据。

达原饮首见于《温疫论》，是治疗瘟疫的著名方剂，用于治疗瘟疫邪伏膜原证。方中槟榔能消能破，除伏邪；厚朴芳香化浊，破戾气所结；草果辛香辟秽，三药协力，可直达膜原，驱邪外出。邪易伤阴，用白芍以和血、知母以滋阴，佐以黄芩苦寒清热，甘草清热解毒，调和诸药。现代药理研究表明，该方具有解热、抗炎、抗肺损伤、抗病毒、保肝等多种生物活性[1]，临床上治疗急性传染病及各种原因引起的发热等疾病效果显著[2-3]。

目前对达原饮的质量控制方法研究较少，尚缺乏全面可靠、稳定可行的质量控制方法反映其整体质量。对于经典名方物质基准，是衡量其制剂质量的标准参照物，在经典名方开发中承担了对照物质的角色，体现了所含药味的整体物质基础，一致性和可追溯性是质量控制的关键[4]。本研究采用指纹图谱结合多成分含量测定的质量控制方法[5-9]，快速、直观地辨识达原饮物质基准的药效物质基础，结合质量传递研究为达原饮物质基准的关键质量属性提供科学、系统的参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-10AT VP高效液相色谱仪和SPD-M10A VP二极管阵列检测器（日本岛津公司）；SECURA125-1CN电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；CP214电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；KQ5200DE超声提取器（昆山美美超声仪器有限公司）；YTLG-10A真空冷冻干燥机（上海叶拓科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品厚朴酚（批号：110729-202015，纯度≥99.0%）、和厚朴酚（批号：110730-201915，纯度≥99.8%）、芍药苷（批号：110736-202145，纯度≥94.6%）、黄芩苷（批号：110715-202122，纯度≥94.2%）、黄芩素（批号：111595-201808，纯度≥97.9%）、汉黄芩苷（批号：112002-201702，纯度≥98.5%）、汉黄芩素（批号：111514-201706，纯度≥95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-201619，纯度≥93.0%）均购自中国食品药品检定研究院；儿茶精（上海源叶生物科技有限公司，批号：S01HB191501，纯度≥98.0%）；新芒果苷（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20061603，纯度≥98.0%）；槟榔（批 号：120915-201813）、草果（批 号：121550-201602）、知母（批号：121070-201806）、白芍（批 号：120905-202011）、黄芩（批 号：120955-201810）、甘草（批号：120904-201519）等对照药材均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈和磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

达原饮物质基准用各药材分别购于各味药的道地产地及主产区，系3个产地，产地和批次信息见表1，参考《中国药典（2020年版）》及饮片炮制规范[10-11]，炮制成各单味饮片，经长春中医药大学姜大成教授鉴定，各药材及饮片均符合《中国药典（2020年版）》一部项下相关规定。

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  表格1 15批达原饮物质基准用各药材的产地信息

  Table 1.Origin information of each medicinal herb used as a reference material for 15 batches of Dayuan drink material benchmark

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Grace Vision HT C₁₈ HL（250 mm× 4.6  mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~20  min，12%~23% A，20~40 min，23%~35% A，40~50 min，35%~70% A，50~60 min，70% A）；检测波长：230 nm；柱温：30℃；流速：1.0  mL/ min，进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

取新芒果苷、儿茶精、芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为0.334、0.195、1.367、3.752、1.231、0.215、0.308、0.177、0.039、0.083 mg/mL的混合对照品储备液；精密吸取混合对照品储备液0.8 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

物质基准样品制备参考关键信息表及古籍文献[12-13]等，经考证换算，取槟榔7.46 g、厚朴3.73  g、草果仁1.87 g、知母3.73 g、白芍3.73  g、黄芩3.73  g、甘草1.87 g为1个基础方，加400  mL水煎煮，恒温电热板加热至滤液约160  mL，过滤，滤液冷冻干燥，粉碎，得15批次物质基准冻干粉（批号：DYYS1~DYYS15），出膏率在18.1%~20.0%之间。

精密称取冻干粉（批号：DYYS1）约0.4  g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25  mL，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，称重，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液

按“2.2.2”项下方法制备各单味药材冻干粉及其供试品溶液，即为槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草对照药材溶液。

2.2.4 阴性样品溶液

按“2.2.2”项下方法制备各药材阴性冻干粉及其供试品溶液，即为缺槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草的各阴性样品溶液。

2.3 指纹图谱研究

2.3.1 精密度试验

取同一批达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1）的供试品溶液连续进样6次，以13号峰（黄芩苷）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别为0.01%~0.32%和0.15%~1.41%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1）的供试品溶液放置 0、2、4、6、8、24 h后进样测定，以13号峰（黄芩苷）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别为0.02%~0.66%和0.28%~2.67%（n=6），表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

平行制备同一批达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1）的供试品溶液6份，进样测定，以13号峰（黄芩苷）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD分别为0.01%~0.34%和0.25%~2.92%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价

对15批次达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1~DYYS15）的供试品溶液进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）生成叠加指纹图谱及对照图谱（图1和图2），并进行相似度计算，结果其相似度均大于0.97，具体见表2。共确定24个共有峰，根据对照品HPLC图谱指认出12个色谱峰，峰1为新芒果苷，峰3为儿茶精，峰5为芒果苷，峰6为芍药苷，峰8为甘草苷，峰13（参照峰）为黄芩苷，峰16为汉黄芩苷，峰17为黄芩素，峰19为甘草酸铵，峰20为汉黄芩素，峰22为和厚朴酚，峰24为厚朴酚。通过与对照药材HPLC图谱比对，峰3为槟榔特征峰，峰9、峰22、峰23和峰24为厚朴特征峰，峰2是槟榔和厚朴共有峰，峰7为草果仁特征峰，峰1和峰5为知母特征峰，峰6为白芍特征峰，峰10、峰11、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰20和峰21为黄芩特征峰，峰4、峰8和峰19为甘草特征峰。所建立指纹图谱全面准确的反映了方中各味药材属性信息，更大程度上保证了经典名方物质基准所要求的整体成分可追溯性[14]。

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  图1 15批达原饮物质基准的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱（R）

  Figure 1.HPLC fingerprint of 15 batches of Dayuan drink material benchmark and its control fingerprint (R)

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  图2 达原饮物质基准HPLC对照指纹图谱（R）

  Figure 2.HPLC control fingerprint of Dayuan drink material benchmark (R)

  注：1. 新芒果苷；2. 槟榔和厚朴共同特征峰；3. 儿茶精；5.芒果苷；6. 芍药苷；7. 草果仁特征峰；8. 甘草苷；13. 黄芩苷（参照）；16. 汉黄芩苷；17. 黄芩素；19. 甘草酸铵；20. 汉黄芩素；22. 和厚朴酚；24. 厚朴酚。

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  表格2 15批达原饮物质基准HPLC指纹图谱的相似度结果

  Table 2.Similarity results of HPLC fingerprint of 15 batches of Dayuan drink material benchmark

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2.4 10种成分的含量测定

2.4.1 专属性试验

通过测定混合对照品溶液、供试品溶液、7种对照药材溶液和6种阴性样品溶液，结果表明样品中10种成分来自槟榔、厚朴、知母、白芍、黄芩、甘草，各成分分离度和理论板数均较好，且阴性样品无干扰，具体见图3。

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  图3 达原饮物质基准专属性试验HPLC色谱图

  Figure 3.HPLC chromatogram of specificity test for Dayuan drink material benchmark

  注：A. 供试品溶液；B. 混合对照品溶液；C. 槟榔药材溶液；D. 厚朴药材溶液；E. 草果仁药材溶液；F. 知母药材溶液；G. 白芍药材溶液；H. 黄芩药材溶液；I. 甘草药材溶液；J. 缺槟榔阴性样品溶液；K. 缺厚朴阴性样品溶液；L. 缺知母阴性样品溶液；M. 缺白芍阴性样品溶液；N. 缺黄芩阴性样品溶液；O. 缺甘草阴性样品溶液；1. 新芒果苷；2.  槟榔和厚朴共同特征峰；3. 儿茶精；5.芒果苷；6.芍药苷；7.  草果仁特征峰；8. 甘草苷；13. 黄芩苷（参照）；16. 汉黄芩苷；17. 黄芩素；19. 甘草酸铵；20. 汉黄芩素；22. 和厚朴酚；24. 厚朴酚。

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2.4.2 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.0、1.4、1.6 mL分别置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液；分别吸取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，计算得各成分回归方程，结果见表3。

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  表格3 各成分线性考察结果

  Table 3.Linear test results of each component

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2.4.3 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液连续6次进样测定，计算得新芒果苷、儿茶精、芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的RSD分别为0.43%、1.16%、0.49%、0.53%、1.14%、1.54%、0.98%、1.55%、1.44%、0.80%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取达原饮物质基准冻干粉同一批次样品（批号：DYYS1）平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新芒果苷、儿茶精、芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的平均含量分别为3.103、0.458、10.078、41.258、10.195、2.170、1.048、2.834、0.181、0.416 mg/g，RSD分别为0.82%、1.42%、1.37%、1.33%、1.71%、1.49%、1.70%、0.84%、1.46%、0.88%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

取达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1）的供试品溶液室温放置0、2、4、6、8、24 h后按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新芒果苷、儿茶精、芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的RSD分别为1.40%、1.21%、1.16%、0.82%、1.32%、2.10%、2.01%、2.23%、1.77%、1.21%（n=6），结果表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

取已知含量的达原饮物质基准冻干粉（批号：DYYS1）粉末6份，精密称取约0.2 g，分别按指标成分已知含量的100%加入10种对照品溶液，制备供试品溶液后按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新芒果苷、儿茶精、芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚的平均回收率分别为98.8%、99.1%、100.6%、101.4%、102.5%、101.0%、100.1%、100.9%、100.0%、99.6%，RSD分别为1.82%、1.15%、1.54%、1.59%、1.39%、2.05%、2.07%、2.53%、0.00%、2.41%（n=6），结果表明该方法回收率良好。

2.4.7 达原饮物质基准中多种成分含量测定

取15批达原饮物质基准冻干粉末（批号：DYYS1~DYYS15），制备供试品溶液后进样测定，结果见表4。结果发现达原饮物质基准冻干粉中以芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷成分含量较高，提示与其成分水溶性程度有关。

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  表格4 15批达原饮物质基准10种成分的含量测定结果（mg/g，n=2）

  Table 4.Content determination results of 10 components in 15 batches of Dayuan drink material benchmark (mg/g，n=2)

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2.4.8 指标成分转移率传递情况

处方中共7味药材，参考《中国药典（2020年版）》[10]中指标性成分的选取，通过槟榔碱、厚朴酚与和厚朴酚之和、芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸来考察质量传递情况。采用强阳离子交换柱对物质基准中槟榔碱进行了含量测定，由于芒果苷阴性有干扰，未测定芒果苷含量，参考知母药材中芒果苷含量测定方法，测定了物质基准中芒果苷含量，具体见表5。结果可知厚朴的转移率偏低，由于厚朴酚与和厚朴酚脂溶性较大，故水煎溶出率较低。芍药苷和黄芩苷的转移率较高，指标成分水溶性较高。草果仁所含成分为挥发类成分，物质基准样品中含量较低，未来需进一步进行气相色谱研究。

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  表格5 指标成分转移率结果（%）

  Table 5.Results of indicator component transfer rate (%)

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3 讨论

由于成方中化学成分较复杂，梯度洗脱能更全面地获得整体信息。通过综合考察不同流动相、体积流量、柱温、色谱柱等，结果表明乙腈-0.1%磷酸水溶液、1.0 mL/min流速、30℃条件下色谱峰峰形、分离度及特征峰数量等方面最优。采用二极管阵列检测器对物质基准样品进行检测，结果显示在紫外230 nm可以检出方中所有饮片特征峰，且基线稳定，色谱峰数目多，分离效果较好，各个特征峰的吸收灵敏。

指纹图谱相似度均大于0.97，一致性良好，整体质量相对稳定；匹配结果显示共有24个共有峰，根据与对照品HPLC图谱比对指认出12个色谱峰；通过与对照药材HPLC图谱比对，所建立的指纹图谱特征峰全面反映了组方中各味药材。通过含量测定发现芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷含量较高，转移率也较高；厚朴酚、和厚朴酚含量较低且转移率较低，与其在水中溶解度低有关。

达原饮具有抗病毒、抗炎、抗氧化及免疫调节等作用，君药槟榔中槟榔碱是生物碱类主要成分[15-16]，具有抗菌、抗炎、抗病毒作用，是其关键药效物质，厚朴与黄芩也具有显著的抗炎作用，草果、槟榔、厚朴、黄芩和白芍具有抗氧化的作用，能通过抗氧化应激反应抑制炎性因子产生[17]。通过测定多种指标成分含量，能进一步提升对达原饮内在质量的控制，为后续研究药效与物质成分的关系提供基础。

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