目的  建立六月雪-葎草（以下简称“雪葎”）药对共煎液HPLC指纹图谱，并进行多成分定量分析，用于评价“雪葎”药对的质量。

方法  采用Agilent EC-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，4 µm）进行检测；以甲醇- 0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；流速为0~30 min：1.0 mL·min^-1，30~65 min：0.6 mL·min^-1；检测波长为350，240 nm；柱温为30℃。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.1版）》对“雪葎”药对共煎液进行相似度评价，并对其中4个指标成分进行定量分析，并将配伍前指标性成分的含量与配伍后相比。

结果  在特征指纹图谱研究中，共标定12个共有峰，以4号峰为参照峰，10批“雪律”药对共煎液与共有模式对照图谱之间有良好的相似性，相似度均在0.9以上；在建立的色谱条件下，4个成分具有良好的线性关系，平均加样回收率在98.7%~99.6% 之间，RSD均小于3%（n=6）。10份“雪葎”药对共煎液中车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷含量范围分别为0.249 4~0.402 8 mg·g^-1，0.109 1~0.238 9 mg·g^-1，0.045 9~0.076 8 mg·g^-1，0.091 4~ 0.173 7 mg·g^-1。雪葎药对配伍后，共煎液中木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷含量均降低，降低幅度分别为296.40%，47.86%和25.02%，而车叶草苷酸的含量增加，增长幅度为8.81%，其中大波斯菊苷的含量降低具有统计学意义（P＜0.05），木犀草苷和芦丁的含量降低具有显著统计学差异（P＜0.01）结论  所建立的“雪葎”药对共煎液HPLC指纹图谱和含量测定方法灵敏度高、专属性强，可以用于该药对的质量控制，该方法也为其配伍机制和药理研究奠定了基础。

六月雪Serissa japonica (Thunb.) Thunb.首载于《本草拾遗》，味苦、微甘，性凉，具备祛风散寒、清热润肺，消肿利咽、益气健脾、止血消疮的功效，可用于风湿痛、急慢性肝炎、肾盂肾炎、水肿、疳积、痢疾等疾病[1]。葎草Humulus scandens (Lour.) Merr.首次出现在魏晋南北朝的《名医别录》中，以“勒草”为药名收载，而唐朝《新修本草》中第一次以“葎草”作为药用名称记载[2]，其味甘，性寒，具有抑菌、抗结核病、抗骨质疏松、抗腹渴、抗肿瘤等功效[3]。六月雪-葎草（以下简称“雪葎”）药对是江苏省名老中医金庆江的经典药对，两者配伍相须为用，是我院肾病科临床常用药对，用于治疗糖尿病肾病。

课题组前期查阅大量文献资料发现，六月雪的主要化学成分包括车叶草苷酸、齐墩果酸等[4]，葎草的主要化学成分包括木犀草苷[5]、芦丁[6]、大波斯菊苷[7]等。相关文献较多涉及六月雪、葎草单味药的定量及指纹图谱分析[8-9]，很少涉及“雪葎”药对指纹图谱及定量分析研究[10]。为保证“雪葎”药对的临床疗效，全面反映药对信息，本文采用HPLC 法建立“雪葎”药对指纹图谱，并对其主要药效成分车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷的含量作定量分析研究，本试验还对“雪葎药对配伍前后指标成分的含量变化并分析其指纹图谱的变化”进行研究，为药对配伍前后在体内药物代谢动力学过程奠定基础，从而指导临床合理用药。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技公司）；FA2004型十万分之一天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津腾试验设备有限公司）；B-260型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DW-2型调温电热套（通州市张芝山镇决心化工电器厂）。

1.2 试药

车叶草苷酸对照品（批号：22030202，纯度99.6%）、木犀草苷对照品（批号：20060301，纯度99.34%）、芦丁对照品（批号：21010803，纯度98.93%）、大波斯菊苷对照品（批号：21053112，纯度98.47%）均购自于成都普菲德生物技术有限公司。

磷酸（色谱纯，批号：13040910475，南京化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，批号：20200801，上海展云化工有限公司）；超纯水由苏州市中西医结合医院中心试验室提供。

葎草和六月雪饮片购于安徽亳州药材市场，经苏州市中西医结合医院顾琴华主任中药师鉴定，分别为茜草科六月雪Serissa japonica （Thunb.）Thunb.的全草和桑科葎草Humulus scandens （Lour.）Merr.的全草，饮片产地和批号见表1。

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  表格1 葎草和六月雪饮片的产地和批号信息

  Table 1.Origin and batch numbers of Serissa japonica and Humulus scandens

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent EC-C₁₈（150 mm×4.6 mm，4 µm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~15 min，16%甲醇；15~30 min，16%~32%甲醇；30~50 min，32%甲醇；50~65 min，32%~45%甲醇）；流速：0~30 min，1.0 mL·min^-1；30~65 min，0.6 mL·min^-1；检测波长：0~7 min，350 nm；7~25 min，240 nm；25~65 min，350 nm；柱温：30℃；进样量：10 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

分别精密称取车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷对照品适量，加50%甲醇超声处理（功率：200 W，频率：40 kHz）使完全溶解，定容后制成浓度分别308，68，40，72 µg·mL^-1的对照品混合溶液。

2.2.2 “雪葎”药对共煎液

分别称取六月雪20 g，葎草10 g，根据前期研究[4]确定的最优水提方法：加15倍量水，提取1.5 h，共提取3次。将回流提取液过滤后合并、浓缩作为共煎液。

2.2.3 “雪葎”药对共煎供试品溶液

精密吸取上述药对共煎液100 mL置于蒸发皿中，水浴蒸干后加50%甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，超声处理（功率：200w，频率：40 kHz）20 min后，用0.45 μm微孔滤膜滤过至液相瓶中进样。

2.2.4 六月雪单煎供试品溶液

称取六月雪20 g，按“2. 2. 2”项下方法制得六月雪水煎液，再按“2. 2. 3”项下方法操作，制得六月雪单煎供试品溶液。

2.2.5 葎草单煎供试品溶液

称取葎草10 g，按“2. 2. 2”项下方法制得葎草水煎液，再按“2. 2. 3”项下方法操作，制得葎草单煎供试品溶液。

2.3 HPLC指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一雪葎药对共煎供试品溶液（六月雪批号：210805；葎草批号：210706），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以4号峰为参比峰，得“雪葎”药对共煎供试品12个共有峰相对保留时间的RSD为0.01%~0.75%，相对峰面积的RSD为0.35%~2.79%（n=6），结果表明仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取同一“雪葎”药对共煎供试品溶液（六月雪批号：210805；葎草批号：210706），按“2.1”项下色谱条件，分别于0，2，4，8，12，16，20，24 h依次进样，记录色谱图。以4号峰为参比峰，得“雪葎”药对共煎供试品12个共有峰相对保留时间的RSD为0.2%~1.07%，相对峰面积的RSD为0.26%~2.81%（n=8），表明“雪葎”药对供试液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批次六月雪、葎草各6份（六月雪批号：210805；葎草批号：210706），每份六月雪20 g，葎草10 g，按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备“雪葎”药对共煎供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以4号峰为参比峰，得到“雪葎”药对共煎供试品的12个共有峰相对保留时间的RSD为0.05%~2.77%，相对峰面积的RSD为0.17%~2.72%（n=6），结果表明，该方法重复性良好。

2.4 “雪葎”药对指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 共有峰的确定

取表1中10份六月雪-葎草饮片，每份六月雪20 g，葎草10 g，按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备“雪葎”药对共煎供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱结果，标记为S1~S10。将S1~S10色谱图通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.1版）》生成对照图谱并进行分析，10批不同产地饮片的指纹图谱见图1。计算其相似度，结果见表2。根据指纹图谱特点，标定了其中12个色谱峰为共有峰，4号峰形较好，保留时间恰当，故选为参照峰。10批“雪葎”药对指纹图谱的相似度为0.901~0.999，均大于0.9，表明不同批次六月雪-葎草的化学成分具有较好的一致性。

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  图1 10批“雪葎”药对共煎液的HPLC指纹图谱

  Figure 1.HPLC fingerprint of the co-decoction of "Xuelyu" drug pair

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  表格2 10 批饮片 HPLC指纹图谱的相似度数据

  Table 2.Similarity data of HPLC fingerprints of 10 batches of decoction pieces

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2.4.2 指纹图谱色谱峰的标定

精密取“2.2.1”项下的混合对照品溶液10 μL，进样测定，得到混合对照品色谱图。混合对照品色谱图与“雪葎”药对色谱图的比较结果见图2。

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  图2 混合对照品和“雪葎”药对共煎供试品溶液的 HPLC 色谱图

  Figure 2.HPLC diagram of the co-decoction of "Xuelyu" drug pair

  注：2-车叶草苷酸；9-木犀草苷；11-芦丁；12-大波斯菊苷

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2.4.3 指纹图谱色谱峰的归属

取六月雪单煎供试品溶液、葎草单煎供试品溶液及“雪葎”药对共煎供试品溶液分别进样，确定六月雪、葎草配伍后色谱峰的归属，结果见图3。由图3可以看出，1、2、4、8、11号峰来源于六月雪，1、3、4、5、6、7、9、10、11、12号峰来源于葎草，由此得出1、4、11 号峰同时来自六月雪和葎草。

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  图3 六月雪、葎草单煎供试品溶液和“雪葎”药对共煎供试品溶液的 HPLC 色谱图

  Figure 3.HPLC diagram of Serissa japonica, Humulus scandens single decoction and the co-decoction of "Xuelyu" drug pair

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2.5 “雪葎”药对中4个有效成分含量测定

2.5.1 专属性试验

分别精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品溶液、六月雪、葎草单煎供试品溶液和“雪葎”药对共煎供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。结果4个有效成分与相邻色谱峰之间的分离度均符合要求，各阴性样品溶液色谱图显示在相应色谱峰位置对分析结果无干扰，说明该色谱系统专属性较好。色谱图见图2。

2.5.2 线性关系考察

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  表格3 4个指标性成分的回归方程及线性范围

  Table 3.Regression equations and linear ranges of the four index components

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将“2.2.1”项下对照品混合溶液用50%的甲醇分别稀释0，5，10，15，25 倍，按“2.1”项下色谱条件依次进样，以峰面积为（Y）为纵坐标，浓度（X，µg·mL^-1）为横坐标[11]进行线性回归，得出车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷的标准曲线方程及线性范围，见表3。各指标性成分于各自范围内的线性关系均良好。

2.5.3 精密度试验

取“2.5.1”项下制备的同一浓度对照品混合溶液10 µL，连续进样6次，结果车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷峰面积的RSD分别为0.63%，0.42%，0.45%，0.41%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验

取同一“雪葎”药对共煎供试品溶液（编号：10），按“2.1”项下色谱条件，分别于0，2，4，8，12，16，20，24 h依次进样，结果车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷峰面积的RSD分别为2.03%、1.70%、2.31%、0.99%（n=8），表明“雪葎”药对共煎供试品在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验

取同一批次六月雪、葎草各6份（编号：10），按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备“雪葎”药对共煎供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷的含量，结果4个指标性成分含量平均值分别为0.378 0，0.224 1，0.070 5，0.168 8 mg·g^-1；RSD分别为3.75%，1.65%，2.84%，3.29%（n=6）。表明此法重复性良好。

2.5.6 加样回收试验

配制含车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷浓度分别为1.6，1.1，0.4，0.2 mg·mL^-1加样回收混合对照品溶液。取“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备的“雪葎”药对共煎供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，计算车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷的含量。精密吸取已知指标性成分含量的上述6份“雪葎”共煎液各100 mL，分别加入1 mL上述加样回收混合对照品溶液。按“2.2.3”项下方法制备6份“雪葎”药对加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定指标性成分的含量，计算加样回收率。结果车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷的平均加样回收率分别为99.6%，98.8%，98.7%，99.0%，RSD分别为2.87%，2.89%，2.55%，2.96%（n=6）。4种成分的回收率均符合相关规定。

2.5.7 样品含量测定

取S1-S10批六月雪20 g-葎草10 g、六月雪20 g、葎草10 g，平行3份，按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备雪葎药对共煎供试品溶液（GJ1-10）、六月雪单煎供试品溶液（LYX1-10）、葎草单煎供试品溶液(LC1-10)，按“2.1”项下色谱条件测定，计算每份供试品中车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷的含量，结果见表4。

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  表格4 各成分含量测定结果( mg·g-1，n=10)

  Table 4.Content determination results of each component (mg·g-1，n=10)

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2.5.8 雪葎药对配伍前后指标性成分含量变化

用 SPSS 17.0对不同组别间的浓度测定结果进行统计分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。雪葎药对配伍后，共煎液中木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷含量均降低，降低幅度分别为296.40%、47.86%和25.02%，而车叶草苷酸的含量增加，增长幅度为8.81%，其中大波斯菊苷的含量降低具有统计学意义（P＜0.05），木犀草苷和芦丁的含量降低具有显著统计学差异（P＜0.01）。结果见表5。

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  表格5 雪葎药对配伍前后多指标成分的平均含量变化（mg·g-1，x±s，n=3）

  Table 5.Average Content Changes of Multiple Index Components before and after Compatibility of "Xuelyu" drug pair (mg·g-1, x±s , n=3)

  注：与 GJ组相比，aP<0.05，bP<0.01

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3 讨论

3.1 色谱条件的选择

试验使用紫外全波长扫描，发现车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷的最大吸收波长分别为237，350，355，348 nm，通过对比色谱峰数量与质量，并能保证在一定时间内各指标性成分都能于最大吸收波长时出峰，且互不影响[12]，选择多波长切换法[13]，检测波长为0~7 min，350 nm（使基线更加平稳）；7~25 min，240 nm（检测车叶草苷酸）；25~65 min，350 nm（检测木犀草苷、芦丁、大波斯菊苷）。试验考察了1.0，0.8，0.6，0.4 mL·min^-1 4个流速，发现0~30 min内选择1.0 mL·min^-1且30~65 min内选择0.6 mL·min^-1时，出峰时间适中，洗脱效果较好。比较了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水等度和不同比例梯度洗脱，发现甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱可以使雪葎药对成分得到比较好的分离，故本试验选用甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。

3.2 指标性成分的选择

葎草化学成分复杂，主要包括黄酮类、多糖类、香豆素类等。黄酮类中主要包括大波斯菊苷、芦丁、木犀草苷、木犀草素，具有抑菌、抗结核病、抗骨质疏松、抗腹渴、抗肿瘤等功效[3]。六月雪中化学成分复杂，主要包括甾体类、木质素类、萜类等。萜类中的齐墩果酸、车叶草苷酸多次在文献中以指标性成分出现，能够作为质量标准考察的重要指标。故预试验中选用木犀草苷、木犀草素、大波斯菊苷、齐墩果酸、车叶草苷酸作为指标性成分。预试验结果显示木犀草素峰面积过低，齐墩果酸分离效果不好，故最终选用车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷作为指标性成分。

3.3 溶剂浓度对峰形的影响

根据各个对照品自身不同性质，往往采用的是不同的溶剂来溶解以达到更好的试验效果。本试验中选取的4个对照品根据已有文献查阅整理，常使用的溶剂有水、甲醇、50%甲醇，或直接加入流动相来溶解。本试验综合考察色谱峰峰形、分离度等因素，最终选取50%甲醇作为溶剂。

3.4 小结

本研究采用HPLC法建立“雪葎”药对指纹图谱，以及车叶草苷酸、木犀草苷、芦丁和大波斯菊苷4个有效成分含量测定方法，经准确、有效的方法学（如：精密度、重复性、稳定性、加样回收率等）考察，为雪葎药对中有效成分的定性及定量分析提供科学依据，本研究还通过比较雪葎药对配伍前后指标性成分的变化，为药对配伍前后在体内药物代谢动力学过程奠定基础，从而指导临床合理用药。

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