目的  基于主要三萜成分预测雷公藤及昆明山海棠改善白癜风的药效强弱，并筛选出三萜成分作用的候选关键microRNA，为后续新药开发奠定理论基础。

方法  采用高效液相色谱二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法测定雷公藤和昆明山海棠中主要三萜活性成分去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素的含量，结合网络药理学及分子对接技术预测三萜成分治疗白癜风的活性，综合评估雷公藤和昆明山海棠改善白癜风的药效强弱，同时对作用的候选关键microRNA进行预测。

结果  雷公藤中去甲泽拉木醛、雷公藤红素含量以及改善白癜风的药效综合评分均显著高于昆明山海棠（P＜0.01），同时筛选得到hsa-miR-7-5p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-4795-3p等17个三萜成分治疗白癜风的候选关键microRNA。

结论  雷公藤与昆明山海棠均可调控多个microRNA改善白癜风症状，但两者的药效强弱存在差异，雷公藤相较于昆明山海棠更适合用于白癜风的治疗。

白癜风是一种由于表皮黑素细胞破坏导致皮肤出现白斑的色素脱失性疾病，全世界发病率为0.5%~1% [1]，该疾病具有迁延难愈、易复发的特点。由于白癜风好发于暴露部位，常影响患者外观，并因此带来不同程度的心理负担。值得注意的是，精神压力不仅是白癜风发病的常见诱因之一，还可能进一步加重病情发展，形成不良循环[2]。除精神因素外，自身免疫、氧化应激、黑色素细胞自毁、病毒感染等均被认为是导致白癜风病发的原因[3]。近年来，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）与白癜风的关系受到了学者们的广泛关注。研究表明，miR-370-3p可靶向抑制趋化因子CXC配体（C-X-C motif chemokine ligand，CXCL）12的分泌，进而抑制黑色素细胞的迁移[4]。胡雯等[5]的研究表明，miR-223-3p可改善H₂O₂诱导的人表皮黑色素细胞的氧化应激损伤，减少细胞凋亡。此外，miR-577、miR-211、miR-155等多种miRNA也被报道与白癜风的治疗调控相关[6-7]。目前西医治疗方法主要包括外用糖皮质激素、光疗、手术治疗等，短期效果显著，但具有一定的不良反应，且复发率较高[3]。中医认为，白癜风是由于脏腑功能失调、邪气入侵、气血不和所致，中药能够通过调节机体的免疫功能，保护黑色素细胞不被破坏，从而发挥白癜风的治疗作用[8]。

雷公藤属制剂常用于免疫系统疾病的治疗，临床应用广泛，且疗效确切。该属植物在我国分布有3种：雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）、昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum (Lévl.) Hutch.]和东北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）[9]。萜类成分为上述植物的主要活性成分之一，目前已得到广泛研究，并被证实具有抗炎、抗风湿、诱导细胞凋亡等多种药理作用[10]。去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素为该属植物的代表性三萜类成分。常毓倩[11]的研究表明，去甲泽拉木醛可作用于Janus激酶2-信号转导与转录激活因子1（Janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 1，JAK2-STAT1）通路，抑制CXCL9、CXCL10的表达，阻断CXC基序趋化因子受体3（C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3）介导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CD8⁺ T）的趋化运动，进而改善白癜风症状。这一机制提示，雷公藤属植物可能具有较强的白癜风改善作用，值得进一步开展新药研发探索。

雷公藤与昆明山海棠为传统药用植物，两者亲缘关系较近，但所含活性成分存在明显差异[12]。故有必要对两者的药效强弱进行研究，以便更好地指导临床用药及产品开发。本研究通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（high performance liquid chromatography with diode array detector，HPLC-DAD）法测定雷公藤与昆明山海棠中主要三萜成分—去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素的含量，结合网络药理学及分子对接技术预测上述成分治疗白癜风的活性，对雷公藤和昆明山海棠改善白癜风的药效进行综合评估，同时对成分作用的候选关键miRNA进行筛选，以期为后续治疗白癜风的新药开发奠定前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

莱芙-800T型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；RUZT1-101型超纯水机（南京智拓仪器仪表有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E型万分之一电子天平和MS205DU型十万分之一电子天平购自瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品去甲泽拉木醛（批号：AFDH1352，纯度99.88%）和扁塑藤素（批号：AFCC2408，纯度99.72%）购自成都埃法生物科技有限公司；雷公藤红素（中国食品药品检定研究院，批号：111946-201501，纯度≥97%）；甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

雷公藤药材采集自浙江省兰溪市及新昌县，昆明山海棠药材采集自广西、云南、四川等地，经重庆市药研院制药有限公司高级工程师王江瑞鉴定编号L1~L8为卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的干燥根，编号K1~K6为卫矛科植物昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum (Lévl.) Hutch.]的干燥根。样品详细信息见表1。

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  表格1 样品信息

  Table 1.Sample information

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1.3 三萜成分的含量测定

1.3.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱为InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），以乙腈（A）-0.15%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0~20 min，50% A；20~40 min，50%→75% A；40~50 min，75%A），流速为1.0 mL/min，检测波长为218 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

1.3.2 混合对照品溶液的制备

分别取去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素对照品约10 mg，精密称定，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，上述成分的质量浓度依次为0.103 8、0.104 6、0.103 0 mg/mL。

1.3.3 供试品溶液的制备

取雷公藤或昆明山海棠药材，粉碎，过4 号筛，精密称取约0.5 g，置于250 mL锥形瓶中，加入二氯甲烷50 mL，超声（功率：600 W，频率：40 kHz）2次，每次10 min，过滤，合并2次滤液，水浴蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.4 方法学考察

① 系统适用性试验。精密量取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂（甲醇），按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。结果显示，去甲泽拉木醛、雷公藤红素与扁塑藤素各峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于5 000。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms

  注：A. 对照品溶液；B. 空白溶剂；C. 供试品溶液；1. 去甲泽拉木醛；2. 雷公藤红素；3. 扁塑藤素。

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② 标准曲线的绘制。取“1.3.2”项下混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件分别进样1、2、5、10、15、20 μL，记录峰面积，以进样量为横坐标（X，μg）、峰面积为纵坐标（Y）计算回归方程，结果见表2。结果表明，各成分进样量与峰面积在相应范围内均有良好的线性关系。

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  表格2 线性关系考察结果

  Table 2.Results of linear relationship investigation

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③ 精密度试验。取“1.3.2”项下混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得到去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素峰面积的RSD分别为0.10%、0.21%、0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

④ 重复性试验。取同一批昆明山海棠样品（样品编号：K4），按“1.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，并按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素的平均含量分别为0.756 7、0.787 0、1.731 6 mg/g，RSD分别为1.66%、0.82%、0.91%（n=6），表明方法重复性良好。

⑤ 稳定性试验。取同一供试品溶液（样品编号：K4），分别于室温[（25±2）℃]条件下放置0、3、6、12、24、36、48 h后按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素峰面积的RSD分别为0.24%、1.06%、0.59%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置48  h稳定性良好。

⑥ 加样回收率试验。 精密称定已知含量（甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素分别为0.734  6、0.750 8、1.689 7 mg/g）的样品约0.5 g，共6份，于每份样品中精密加入适量对照品（甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素分别为0.368 4、0.374  2、0.845 9 mg），按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，并按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，计算得到去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素的平均回收率分别为94.61%、100.05%、93.96%，RSD分别为3.12%、2.58%、2.45%（n=6），表明该方法准确度良好。

1.3.5 样品测定

各批次样品按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，并按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算各成分含量。

1.4 三萜成分治疗白癜风的候选关键miRNA筛选

1.4.1 成分有效靶点的筛选

在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中对3种三萜成分进行检索，下载对应的2D结构，通过SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）和PharmMapper数据库（https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）预测成分作用靶点，并通过UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）转化为标准的Gene Symbol，未匹配到Gene Symbol的靶点予以剔除，同时在HERB（A High-throughput Experiment- and Reference-guided Database of Traditional Chinese Medicine）数据库（herb.ac.cn/）中查找成分对应靶点，整合各数据库靶点信息，作为成分的有效靶点。

1.4.2 白癜风疾病靶点的获取

通过GeneCard（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/）及DrugBank（https://go.drugbank.com/）数据库，以“vitiligo”作为关键词进行检索，获得白癜风相关靶点。其中GeneCard数据库中选择得分值大于2 倍中位数的基因。

1.4.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点的筛选

对成分有效靶点和白癜风疾病靶点进行Venny分析，将两者的交集靶点作为3种三萜成分治疗白癜风的潜在作用靶点。并将交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）的“Multiple Proteins”栏目中，物种选择“Homo sapiens”，选取置信度高于0.7的数据，导出蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）关系列表。采用Cytoscape 3.10.1软件绘制PPI网络图，同时利用CytoHubba插件分析网络拓扑参数，以“节点连接度”（degree）、“介度中心性”（betweenness centrality）、“紧密中心性”（closeness centrality）的中位数为卡值，选取同时满足大于3 个卡值的基因，作为3种三萜成分治疗白癜风的关键靶点。

1.4.4 GO与KEGG富集分析

通过DAVID（The Database for Annotation，Visualization，and Integrated D_iscovery）数据库（https://david.ncifcrf.gov/），完成3种三萜成分治疗白癜风的关键靶点在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析，以P＜0.05作为筛选条件，获得差异显著的功能和信号通路。

1.4.5 分子对接分析方法

① 成分结构的处理。将3种三萜成分的2D结构式导入Chem 3D 19.0软件中，选择MM 2（Molecular Mechanics 2）力场进行能量最小化处理，得到最稳定的空间构象。

② 靶蛋白的收集与处理。通过蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org）筛选关键靶点的人源晶体结构，选取得分最高的含有原配体的蛋白晶体复合结构，使用PyMol软件将原配体抽离，并进行去多余蛋白构象、去水等预处理，作为分子对接的受体。

③ 活性口袋的定义。使用AutoDock Vina将从蛋白中抽离出的原配体重新对接回去，运用PyMol软件计算对接前后分子构象的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），若小于2.0，表明该部位适合进行分子对接，活性口袋定义成功。

④ 活性口袋的位置参数获取。使用AutoDock Vina确定活性口袋的中心和大小，将蛋白晶体结构原配体的中心作为活性口袋的中心，大小包裹原配体所在活性位点所有关键残基。

⑤ 三萜成分与关键靶点蛋白对接。使用AutoDock Vina进行三萜成分与关键靶点蛋白的对接工作。对受体蛋白进行加氢、计算电荷等预处理后，设置活性口袋位置参数，将活性成分对接到活性口袋处，计算结合能。若结合能小于0  kcal/mol，则表明配体分子可与受体分子自发结合，即可认为该成分与靶点蛋白对接成功。

1.4.6 候选关键miRNA的筛选

采用TargetScan数据库（http://www.targetscan.org/vert_72/）和miRDB 数据库（http: //www.mirdb.org/miRDB/）对关键靶点进行miRNA预测。选择最具代表性的转录本，得到在保守位点结合的miRNA，筛选保留seed match为8 mer的miRNA。选取TargetScan数据库中语境评分百分位数和miRDB预测值均不低于80的miRNA，运用Cytoscape 3.10.1软件构建“成分-靶点-miRNA”网络。

1.5 雷公藤与昆明山海棠药材改善白癜风的药效评价方法

对“成分-靶点-miRNA”网络进行拓扑分析，得到成分的各项拓扑参数。其中，degree值为最具代表性的拓扑参数，该值可表征成分与各靶点之间的关联程度，能体现成分在生化过程中的地位，是用来反映成分活性的关键参数。故基于重要拓扑参数degree值的大小，根据公式（1）计算成分的活性权重，并依据公式（2）计算药材改善白癜风的药效综合得分。

式中，D_i表示成分i的degree值；D_i′表示归一化degree值，即成分i的degree值占所有成分degree值总和的比值。

式中，E_j表示药材j的综合药效得分；C_ij表示药材j中成分i的含量。

2 结果

2.1 雷公藤与昆明山海棠中三萜成分含量对比分析

雷公藤与昆明山海棠的三萜成分含量检测结果见表3。对三萜成分含量原始数据进行归一化处理后完成主成分分析（principal component analysis，PCA），图2为雷公藤和昆明山海棠样品的PCA得分散点图，模型稳定性（R²X）为0.980，模型预测率（Q²）为0.838。样品虽有产地差异，但物种差异对成分含量的影响更为明显，图2中的样品明显按物种区分为雷公藤和昆明山海棠药材两大类，表明三萜成分在两者间的含量分布整体存在明显差异。样品含量检测数据符合正态分布且方差齐，t检验结果表明，雷公藤中的去甲泽拉木醛和雷公藤红素含量均显著高于昆明山海棠（P≤0.001），而扁塑藤素差异无统计学意义（P=0.121）。雷公藤样品中去甲泽拉木醛含量均高于2 mg/g，而昆明山海棠样品中含量最高的仅为1.561 9 mg/g；雷公藤红素在雷公藤样品中含量范围为3.459 5~4.629 7 mg/g，而在昆明山海棠样品中的范围仅为0.610 7~2.192 3 mg/g。相较于昆明山海棠，雷公藤中含有更高含量的三萜成分。

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  表格3 雷公藤与昆明山海棠中的三萜成分含量（，mg/g，n=3）

  Table 3.Content of three triterpenoids in Tripterygium wilfordii and Tripterygium hy-poglaucum (, mg/g, n=3)

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  图2 PCA得分散点图

  Figure 2.PCA scatter plot

  注：L. 雷公藤；K. 昆明山海棠。

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2.2 三萜成分治疗白癜风的潜在作用靶点获取

在SwissTargetPrediction、PharmMapper和HERB数据库中预测去甲泽拉木醛、雷公藤红素、扁塑藤素的相应靶点，合并去重后得到132个化合物作用靶点。在GeneCard、OMIM和DrugBank基因数据库中，以“vitiligo”为关键词进行检索，合并去重后得到672个与白癜风相关的人源靶点。通过在线绘图网站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制韦恩图（图3），将三萜成分作用靶点和白癜风相关靶点进行交集分析，最终获得三萜成分治疗白癜风的28个潜在作用靶点。

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  图3 三萜成分-白癜风疾病靶点韦恩图

  Figure 3.The venn diagram of the targets both in triterpenoids targets and vitiligo targets

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2.3 PPI网络的构建与分析

在STRING数据库中，对三萜成分治疗白癜风的潜在作用靶点进行蛋白互作分析，并通过Cytoscape软件绘制PPI网络图。如图4所示，该网络包含28个节点，50条边，节点平均度数是3.57。图中节点越大，表明degree值越大，即该靶点与其他靶点作用越紧密。靶点与靶点之间的连接线越粗，表明综合评分越高，即两者的关系越紧密。以网络拓扑参数degree、betweenness centrality和closeness centrality的中位数为卡值，筛选得到7个同时满足大于3个卡值的靶点，作为三萜成分治疗白癜风的关键靶点。关键靶点及相应拓扑参数见表4。

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  图4 PPI网络图

  Figure 4.PPI network diagram

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  表格4 关键靶点及拓扑参数

  Table 4.Key targets and topological parameters

  注：ALB：白蛋白（albumin）；BCL2：B细胞淋巴瘤因子2（B cell lymphoma 2）；ESR1：雌激素受体1（estrogen receptor 1）；CASP3：胱天蛋白酶3（Caspase-3）；SIRT1：沉默信息调节因子1（silent information regulator 1）；mTOR：帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin）；PARP1：聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase-1）。

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2.4 关键靶点的GO与KEGG富集分析

通过DAVID数据库对三萜成分治疗白癜风的7个关键靶点进行GO和KEGG分析（图5和图6）。根据P＜0.05，GO富集得到37个BP（如DNA损伤反应、对过氧化氢的反应等）、10个CC（如细胞核、细胞质等）、5个MF（如相同蛋白结合、酶结合等）。KEGG富集得到13条相关通路，其中涉及基因数最多且最具显著性意义的通路为miRNAs in cancer，提示三萜成分治疗白癜风极有可能与miRNA的调节密切相关。富集得到的通路涉及BCL2、ESR1、CASP3、SIRT1、mTOR、PARP1共计6个关键靶点，用于后续进一步的研究。运用Cytoscape 3.10.1软件构建“疾病-成分-靶点-通路”网络（图7），该网络包含21个节点，47条边，可以看出3种三萜成分可作用于多靶点、多通路发挥治疗白癜风的作用。

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  图5 GO功能富集分析图

  Figure 5.GO function enrichment analysis

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  图6 KEGG通路富集气泡图

  Figure 6.KEGG pathway enrichment analysis

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  图7 “疾病-成分-靶点-通路”网络图

  Figure 7.“Disease-compound-target-pathway”network diagram

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2.5 分子对接结果

从PDB数据库中搜索得到6个关键靶点的人源蛋白，将原配体与靶点蛋白在活性口袋处进行对接，对接参数与RMSD值见表5。所有原配体与靶点蛋白对接前后构象的RMSD值均小于2，表明原配体所在部位适合用于分子对接，活性口袋定义成功。将6个关键靶点的人源蛋白与3种三萜成分进行对接，结合能均小于0 kcal/mol，表明关键靶点与三萜成分均能成功对接（表6）。去甲泽拉木醛和扁塑藤素均对CASP3具有最高的结合亲和力，去甲泽拉木醛与CASP3蛋白的结合亲和力主要通过与HIS-237、PHE-381B残基之间的相互作用，扁塑藤素与HIS-237残基间也可通过氢键结合；雷公藤红素与mTOR之间的结合能绝对值最大，主要是通过与ALA-206残基间的作用相结合（图8）。由此可以推测，3种三萜成分能够与白癜风的关键靶点良好结合，在治疗过程中发挥作用。

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  表格5 活性口袋对接参数与RMSD值计算结果

  Table 5.Docking parameters of active pockets and calculation results of RMSD value

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  表格6 分子对接结合能

  Table 6.Molecular docking binding energy

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  图8 构象可视化的结合模式

  Figure 8.Combination mode of conformational visualization

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2.6 三萜成分治疗白癜风的候选关键miRNA筛选

根据TargetScan 数据库中的语境评分百分位数和miRDB 预测值，筛选得到127个三萜成分治疗白癜风的miRNA，运用Cytoscape 3.10.1软件构建“成分-靶点-miRNA”网络图（图9），观察三萜成分、作用靶点及对应的miRNA三者之间的相关作用。表7中所列hsa-miR-7-5p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-4795-3p等17个miRNA在TargetScan 数据库中的语境评分百分位数和miRDB预测值均不低于95，被筛选为三萜成分治疗白癜风的候选关键miRNA。Brahmbhatt等 [13]研究表明，上调SIRT1可抑制miR-211的表达，保护白癜风表皮中紫外线介导的DNA损伤。Sahoo等[14]的研究确立了miR-211为白癜风细胞中细胞代谢的关键调节因子，可调控氧化磷酸化和线粒体能量代谢。miR- 211的异常调控，会导致白癜风细胞氧消耗率降低、脂质代谢异常以及活性氧生成增加，造成细胞损伤[15]。与健康组织相比，白癜风患者病变组织中的miR-9升高而黏附分子降低；可通过抑制miR-9表达，使病灶周围黑素细胞向病灶组织迁移，促进白癜风复色[16]。由此可以看出，miRNA对于白癜风的治疗具有重要作用。

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  图9 “成分-靶点-miRNA”网络图

  Figure 9.“Compound-target- miRNA”network diagram

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  表格7 三萜成分治疗白癜风的候选关键miRNA

  Table 7.Candidate key miRNAs for the treatment of vitiligo with triterpenoid components

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2.7 雷公藤与昆明山海棠药材改善白癜风的药效综合评价

按“1.5”项下公式计算雷公藤和昆明山海棠样品的药效综合得分，结果见表8。样品得分符合正态分布且方差齐，t检验结果表明，雷公藤的药效综合得分显著高于昆明山海棠（P ＜0.01）。雷公藤样品的平均药效综合得分为1.947 2，是昆明山海棠样品的2.40倍。评价结果提示，雷公藤和昆明山海棠虽为同属植物，亲缘关系较近，但两者改善白癜风的药效强弱存在一定差异，雷公藤相较于昆明山海棠更适合用于白癜风的治疗。后续可通过相应的药理实验对评价结果做进一步验证。

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  表格8 雷公藤和昆明山海棠样品药效综合得分

  Table 8.Comprehensive score of pharmacological effects of Tripterygium wilfordii and Tripterygium hypoglaucum

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3 讨论

在试验前期，对含量测定所用供试品溶液的制备方法进行了系统考察，包括提取溶媒、提取时间及提取次数等关键参数。在建立HPLC分析条件过程中，考察了不同流动相体系（乙腈-纯水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%冰醋酸水）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）以及不同柱温（25、30、35℃）。在确定采用磷酸水溶液体系后，进一步考察了不同磷酸浓度（0.05%、0.1%、0.15%），并对洗脱梯度进行了反复优化。最终，综合各色谱峰的峰形、分离度及出峰时间等因素，确定了最佳色谱条件。

白癜风病发与黑色素细胞功能异常密切相关，减轻黑色素细胞的损伤即可使病症得到改善。虞海燕等[17]研究表明，白癜风患者的黑色素细胞中mTOR蛋白水平明显低于正常对照组。苦参碱可促进SIRT1蛋白表达，降低mTOR磷酸化水平，减少白癜风小鼠黑色素细胞的丢失[18]。京尼平苷能上调H₂O2诱导的体外氧化应激模型中BCL2的表达，降低黑色素细胞的氧化损伤程度[19]。故药物可通过调节相关靶点功能，保护黑色素细胞不被破坏，进而发挥治疗白癜风的作用。

miRNAs in cancer为本研究通过KEGG富集得到的关键通路。查阅文献[20]发现，miRNA可调控人类的各项生命活动，其在白癜风发病机制中具有重要作用。临床检验结果显示，miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p在白癜风患者外周血中的表达量均异于健康对照组，且表达量与病程相关。杨敏等[21]通过体外实验发现，miR-125b-5p可调控小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）的表达，提高黑色素细胞的增殖率，同时减少细胞凋亡。miR-223-3p可靶向作用于叉头框蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3），亦可对表皮黑色素细胞的生物学行为进行调控[22]。本研究仅通过生物信息学技术对雷公藤属植物中三萜成分治疗白癜风的作用机制进行预测，后续进行药理实验验证时可重点关注其对miRNA的功能调控情况。

雷公藤与昆明山海棠种间界限模糊，在分类学上一直存在争议，有将两者视作同种中药使用的情况。但据文献[23-24]报道，雷公藤与昆明山海棠的药效物质基础存在一定差异。本研究结果显示，相较于昆明山海棠，雷公藤中三萜成分含量整体较高。生物信息学分析结果提示，雷公藤与昆明山海棠改善白癜风的药效强弱具有明显差异。故两者在使用时应加以区分，混用将导致疗效的不稳定。本研究所用样品的产地、批次有限，后续可从多个产地收集更多批次的药材对结果做进一步的验证。

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