目的  建立白茅根炮制前后的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱及多成分定量测定方法，并结合化学计量学分析进行质量评价。

方法  采用UPLC法分别构建白茅根和茅根炭的指纹图谱，运用化学模式识别技术筛选茅根炭炮制前后的主要差异成分并进行定量分析。

结果  白茅根UPLC指纹图谱共标定11个共有峰，茅根炭UPLC指纹图谱共标定16个共有峰，指认了5种成分。采用聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）可明显区分白茅根和茅根炭；OPLS-DA得出11个主要差异成分，按变量投影重要性（VIP）值大小排序依次为峰16、13、3（新绿原酸）、14、12（松柏醛）、15、8、7（绿原酸）、9（4-香豆酸）、6和2（5-羟甲基糠醛）。定量结果表明，白茅根炒炭后新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸含量明显下降，含量分别在0.004~0.019、0.048~0.167、0.031~0.155 mg/g范围内；同时，5-羟甲基糠醛、松柏醛含量显著增加，其含量分别在1.070~7.280、0.071~0.298 mg/g范围内。

结论  本研究所建立的质量评价方法稳定、可靠，可用于白茅根及茅根炭的定性与定量分析，为其质量评价提供科学依据。

白茅根为禾本科植物白茅[Imperata cylindrica Beauv. var. major（Nees）C. E. Hubb.]的干燥根茎，味甘，性寒，归肺、胃、膀胱经，具有凉血止血、清热利尿之功效[1]。现代药理研究表明，白茅根具有止血、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用，临床多用于血热出血、热病烦渴、湿热黄疸以及热淋涩痛等病证的治疗[2]。其炮制品茅根炭始载于唐代王焘的《外台秘要方》[3]，炮制历史悠久。同时，茅根炭也常用于散剂，如“十灰散”。炒炭作为白茅根的法定炮制方法，一直沿用至今，并被《中国药典（2025年版）》[1]及多省市炮制规范所收载。有研究表明，白茅根经高温炮制后，其止血效果大幅增强[4]。

中药指纹图谱是一种研究中药各类成分的实用技术。该方法从中药整体成分群入手，能够全面反映中药中所有化学成分的整体特征。其不仅具备整体性，还能精准区分不同中药、识别目标成分，是探究中药质量标志物的有效手段[5-6]。虽有研究发现，白茅根炒炭后多糖含量显著降低 [7]，绿原酸、4-香豆酸、5-羟甲基糠醛、咖啡酰奎尼内酯等成分的含量变化显著[8-9]，但并未见相关研究基于不同产地多批次白茅根样品，系统地将炮制前后的指纹图谱与多成分含量测定进行关联分析。

本研究建立了白茅根及茅根炭的超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指纹图谱，结合聚类分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等的化学计量学方法，筛选炮制前后的变化成分；并对白茅根炮制前后变化较大的新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸、5-羟甲基糠醛、松柏醛5种成分进行含量测定，探讨白茅根炮制前后含量变化规律，以期为白茅根和茅根炭的质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

Waters H-Class型高效液相色谱仪（美国沃特世有限公司）；ME204E型万分之一天平和XP26型百万分之一天平均购自瑞士梅特勒-托利多公司；HWS-28型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q-Direc型超纯水系统（德国 Merck公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品5-羟甲基糠醛（批号：111626-202417，纯度98.00%）、新绿原酸（批号：112110-202401，纯度99.00%）、绿原酸（批号：110753-202119，纯度96.30%）、4-香豆酸（批号：112037-202102，纯度99.00%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品松柏醛（成都乐美天医药科技有限公司，批号：DST211128-161，纯度98.25%）；乙腈和磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

白茅根药材分别来自广西、广东、山东、河南4个产地，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，均为禾本科植物白茅[Imperata cylindrica Beauv. var. major（Nees）C. E. Hubb.]的干燥根茎。各批次样品的具体信息见表1。

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  表格1 白茅根及茅根炭样品信息

  Table 1.Sample information for Imperata cylindrica Rhizome and Imperata cylindrica Carbonisata

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2 方法与结果

2.1 茅根炭饮片的制备

取20批白茅根饮片，按照《中国药典（2025年版）》一部白茅根项下方法[1]，照炒炭法（通则0213）[10]炒至焦褐色，取出，晾凉，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取茅根炭粉末约1.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50  mL，称定重量，加热回流30 min，取出放冷，用50%乙醇补足至原重量，过滤、蒸干，用50%乙醇溶于5 mL量瓶中，过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称定新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸、松柏醛、5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为59.67、210.74、76.69、149.00、400.00 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4 色谱条件

采用UPLC法，色谱柱为YMC Triart C₁₈柱（150 mm×2.1 mm, 1.9 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~8 min，2%~4% A；8~15 min，4%~8% A； 15~22 min，8%~10% A；22~28 min，10%~11% A；28~34 min，11%~15% A；34~48 min，15%~21% A；48~60 min，21%~25% A，60~70 min，25% A）；流速为0.3 mL/min；柱温为35 ℃；除5-羟甲基糠醛含量测定检测波长为280 nm，其余项目检测波长均为325 nm；进样量为2 μL。

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验

取茅根炭供试品溶液（编号：T8），按“2.4”项下色谱条件连续进样测定6次，以绿原酸为对照（S）峰，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD为0.23%~1.37%，相对峰面积RSD为1.77%~3.95%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验

取同一批茅根炭粉末（编号：T8）6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，以绿原酸为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD为0.23%~2.63%，相对峰面积RSD为2.53%~4.85%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验

取室温[（25±2）℃]放置的茅根炭供试品溶液（编号：T8），分别在0、3、6、9、12、15、18、24 h时，以绿原酸为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD为0.20%~0.62%，相对峰面积RSD为1.01%~3.28%（n=8），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 指纹图谱建立及化学模式识别

2.6.1 白茅根及茅根炭指纹图谱的建立

取白茅根和茅根炭粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并将其分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）进行分析。白茅根指纹图谱共标定11个共有峰，茅根炭指纹图谱共标定16个共有峰，经与对照品比对，指认了其中的5个色谱峰，分别为峰2（5-羟甲基糠醛）、峰3（新绿原酸）、峰7（绿原酸）、峰9（4-香豆酸）、峰12（松柏醛）。相关的指纹图谱叠加图见图1和图2，对照品指认图谱见图3。

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  图1 20批白茅根的指纹图谱叠加图

  Figure 1.Overlay plot of fingerprints for 20 batches of Imperata cylindrica Rhizome

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  图2 20批茅根炭的指纹图谱叠加图

  Figure 2.Overlay plot of fingerprints for 20 batches of Imperatae cylindrica Carbonisata

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  图3 对照品指认图谱

  Figure 3.Reference substance identification chromatogram

  注：A. 茅根炭供试品；B. 绿原酸、4-香豆酸和松柏醛对照品；C. 5-羟甲基糠醛对照品；D. 新绿原酸和绿原酸对照品；2. 5-羟甲基糠醛；3. 新绿原酸；7. 绿原酸；9. 4-香豆酸；12. 松柏醛。

  

2.6.2 相似度分析

将“2.6.1”项下采集的白茅根、茅根炭UPLC指纹图谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行全谱峰匹配，生成对照指纹图谱（图4），并计算各样品与对照指纹图谱的相似度，结果见表2。20批白茅根样品与白茅根对照图谱相似度为0.764~0.998，20批茅根炭样品与茅根炭对照图谱相似度为0.887~0.994。

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  图4 对照指纹图谱

  Figure 4.Reference fingerprint

  注：A. 白茅根；B. 茅根炭。

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  表格2 相似度计算结果

  Table 2.Results of similarity calculation

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2.6.3 CA

以白茅根和茅根炭指纹图谱各色谱峰的峰面积为变量，将该变量数据集导入至IBM SPSS Statistics 20软件中，在CA过程中，采用瓦尔德法作为核心分析方法，并选用欧氏距离来计算变量间的相似度，结果见图5。结果显示，当欧氏距离在21~25之间时，可将白茅根与茅根炭明显区分开。

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  图5 CA结果

  Figure 5.Results of CA

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2.6.4 PCA

以白茅根和茅根炭指纹图谱各色谱峰的峰面积（未检测到的峰面积以0计）为变量，将其导入 SIMCA 14.1软件，采用PCA观察样品的聚集情况，得分图矩阵见图6。R²X（X变量的累积解释率） =0.972，Q²（交叉验证预测能力） =0.797，均大于0.5，表明所建模型预测能力较强。结果显示，白茅根与茅根炭可被明显区分，表明两者指纹图谱的整体成分差异显著。

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  图6 PCA得分图

  Figure 6.PCA score plot

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同时，将白茅根和茅根炭各色谱峰的峰面积导入IBM SPSS Statistics 20软件进行分析，计算主成分的特征值及方差贡献率，结果见表3。以特征值＞1为标准进行因子抽取，前2个成分的累积贡献率可达到77.31%，表明这两个主成分可代表白茅根和茅根炭样品中共有峰77.31%的信息。同时，由图7可见，变化曲线存在明显拐点，说明前2个主成分的分析结果能够较为全面地反映白茅根和茅根炭指纹图谱共有峰的大部分信息，可用于评价白茅根和茅根炭样品的质量评价。结合主成分载荷矩阵（表4）分析，第1主成分主要代表色谱峰2、8、12、13、14、15、16；第 2主成分则主要代表色谱峰10和11。

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  表格3 主成分特征值及方差贡献率

  Table 3.Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

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  图7 碎石图

  Figure 7.Scree plot

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  表格4 主成分因子载荷矩阵

  Table 4.Factor loading matrix of principal components

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2.6.5 OPLS-DA

将白茅根和茅根炭的单位峰面积导入SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA分析，以实现对样品的分类识别，结果见图8。OPLS-DA模型中的R²X=0.772，R²Y=0.979，Q²=0.970，各参数均大于0.5，表明所建模型具有较好的预测能力。

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  图8 OPLS-DA得分图

  Figure 8.OPLS-DA score plot

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进一步计算了16个色谱峰的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，结果见图9。以VIP值＞1作为筛选标准，用以识别区分白茅根与茅根炭的差异性标志物。VIP 值越高，说明这个指标在区分不同类别时贡献越大。按照这一标准，共筛选出11个重要的特征峰，其VIP值由高到低依次为：峰16、峰13、峰3、峰14、峰12、峰15、峰8、峰7、峰9、峰6、峰2。

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  图9 VIP值图

  Figure 9.VIP score plot

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2.7 茅根炭炮制前后差异成分的含量测定

2.7.1 线性关系考察

取5-羟甲基糠醛对照品适量，置20 mL量瓶中，加甲醇制成含5-羟甲基糠醛400 μg/mL的对照品储备液。另取新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸及松柏醛对照品各适量，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇制成浓度依次为59.67、210.74、76.69、149 μg/mL的对照品储备液。

分别精密吸取5-羟甲基糠醛对照品储备液0.5、1.4、2.7、8.1、13.5、18.2 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成6种不同浓度的5-羟甲基糠醛对照品溶液。另精密吸取新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸及松柏醛对照品储备液，按比例配制成6个不同浓度的混合对照品溶液。具体如下：新绿原酸和绿原酸各取0.1、0.3、0.5、1、3、4 mL，4-香豆酸取0.2、0.5、1、1、3、4 mL，松柏醛取0.1、0.5、1、1、3、4 mL，分别置于100、50、25、5、10、5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。

精密吸取上述不同浓度的对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见表5。

2.7.2 检测限与定量限

分别精密配制系列低浓度的对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，以信噪比约为3时的对照品浓度作为检测限，以信噪比约为10时的对照品浓度作为定量限，结果见表5。

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  表格5 线性关系、检测限与定量限考察结果

  Table 5.Investigation results of linear relationships, detection, and quantification limit

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2.7.3 精密度试验

取同一对照品溶液（5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸、松柏醛的浓度分别为：20.40、19.10、20.02、19.16、20.38 μg/mL），按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，计算得到5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸、松柏醛峰面积的RSD分别为 0.15%、0.23%、1.84%、1.57%、1.41%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7.4 重复性试验

取同一批次茅根炭粉末（编号：T8）6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，计算得到5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸及松柏醛的平均含量分别为6.57、0.008、0.124、0.047、0.082  mg/g，RSD分别为1.97%、1.82%、0.65%、1.66%、2.14%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.7.5 稳定性试验

将供试品溶液（编号：T8）分别于室温条件下放置0、3、6、9、13、16、24 h后，按“2.4”项下色谱条件进样测定，计算得到5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸及松柏醛峰面积的RSD分别为0.25%、1.67%、2.46%、2.58%、2.28%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的茅根炭粉末（编号：T8）约0.5 g，按各对照品与茅根炭饮片中待测成分含量之比分别为0.5 ∶ 1、1 ∶ 1、1.5 ∶ 1设计3组试验，每组平行3份。按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，计算得到5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸及松柏醛的平均回收率分别为101.85%、85.69%、88.13%、85.45%、87.69%，RSD分别为2.58%、2.36%、1.93%、2.41%、1.38%（n=9），表明该方法准确度良好。

2.7.7 样品的含量测定

取各批次白茅根及茅根炭样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，计算各成分含量，结果见表6。与白茅根相比，茅根炭中5种成分的含量发生了显著变化，其中，新绿原酸、绿原酸和4-香豆酸的含量均呈下降趋势，平均降幅分别为87.83%、87.86%和49.78%，其含量范围依次为0.004~0.019、0.048~0.167、0.031~0.155 mg/g；相反，5-羟甲基糠醛和松柏醛的含量则明显升高，含量范围分别为1.070~7.280 mg/g和0.071~0.298 mg/g。

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  表格6 白茅根和茅根炭样品中各成分的含量（mg/g，n=3）

  Table 6.Contents of each component in Imperata cylindrica Rhizome and Imperata cylindrica Carbonisata samples (mg/g, n=3)

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3 讨论

3.1 供试品溶液的制备及色谱条件考察

本研究以“总峰面积/称样量”和5个含量测定项为评价指标，比较了不同提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇等）、提取时间（30、40、60、90、120 min）、提取方式（回流、超声）和溶剂体积（15、25、50 mL）对茅根炭各色谱峰的影响。结果发现，使用50%乙醇为提取溶剂时，各色谱峰分离度最优，故选择50%乙醇作为提取溶剂。比较了不同提取法对茅根炭的提取效果，结果表明，超声提取法的“总峰面积/称样量”和5种测定指标成分的含量略低于回流提取法，因此选择回流提取法进行后续处理。

同时对不同流动相（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%冰醋酸）、流速（0.28、0.30、0.32 mL/min）、柱温（33、35、37℃）、检测波长（280、325、350 nm）等参数进行考察，最终确定的色谱条件可使白茅根与茅根炭中的化学成分得到较全面的分离，同时满足各指标成分的含量测定要求。其中，5-羟甲基糠醛在280 nm下响应值最高，其余成分则在325 nm条件下峰型最好、峰面积最大。因此，选择除5-羟甲基糠醛含量测定波长为280 nm，其他项目检测波长均为325 nm。

3.2 指纹图谱的建立及化学计量学分析

本研究建立了白茅根和茅根炭的UPLC 指纹图谱，其中，白茅根指纹图谱共标定11个共有峰，茅根炭指纹图谱共标定16个共有峰，并指认了其中5个色谱峰。同时，为深入分析指纹图谱中复杂成分的分布特征及其相关性，采用相似度评价、CA、PCA及OPLS-DA等方法，对白茅根和茅根炭的质量展开综合评价。结果显示，CA、PCA及OPLS-DA均能明显区分白茅根和茅根炭。通过OPLS-DA分析，共筛选出11个具有差异性的标志物，分别为峰16、峰13、峰3（新绿原酸）、峰14、峰12（松柏醛）、峰15、峰8、峰7（绿原酸）、峰9（4-香豆酸）、峰6、峰2（5-羟甲基糠醛）。

3.3 含量指标的选择

白茅根主要含有三萜、苯丙素、多糖等成分[11]，其中，苯丙素类成分（如新绿原酸、绿原酸、4-香豆酸）是白茅根产生抗菌、抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[12]。经炮制成茅根炭后，虽性质不稳定，在高温下易发生分解而导致含量降低[4]，但仍是茅根炭饮片中的重要活性成分。此外，松柏醛具有抗菌、抗炎及止血作用[13-14]，是白茅根炒炭后含量显著增加的成分。5-羟甲基糠醛则是炮制过程中通过美拉德反应生成的产物[15]。研究发现，5-羟甲基糠醛具有双向药理作用，一定剂量下可能产生毒性，而其含量在白茅根炒炭后明显升高。因此，为确保临床用药安全，对其含量进行监测十分必要[16-18]。临床试验证明，茅根炭的止血作用优于白茅根，这可能与本研究中上述成分的含量变化有关。然而，这些成分的变化是否与止血作用的增强存在关联，尚需进一步通过药理实验加以验证[4]。

综上所述，本研究建立的UPLC指纹图谱可有效区分白茅根与茅根炭，同时所构建的5种指标成分的含量测定方法，可为两者的质量控制提供科学依据。

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