目的  运用网络药理学方法预测莲心季铵碱治疗胰腺癌的核心作用靶点及信号通路。

方法  通过TCMSP、SwissTargetPrediction数据库筛选莲心季铵碱的潜在作用靶点，GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库收集胰腺癌相关靶点，经Venny 2.1.0获取二者交集；通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，经Cytoscape 3.10.4软件可视化分析并筛选核心靶点；采用DAVID数据库进行GO功能及KEGG信号通路富集分析；开展分子对接实验验证结合亲和力、动物实验验证药物效果。

结果  共筛选出莲心季铵碱潜在作用靶点112个、胰腺癌相关靶点2 187个，获得交集靶点37 个。PPI网络分析显示，Jun原癌基因（JUN）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、热休克蛋白90α（HSP90AA1）、雌激素受体1（ESR1）、酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）为核心靶点；GO功能富集分析显示，其主要参与细胞增殖调控、凋亡过程、炎症反应及血管生成等生物学过程；KEGG信号通路分析表明，交集靶点基因显著富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K AKT）信号通路及其他肿瘤相关通路。分子对接结果显示，莲心季铵碱与ESR1（-7.8  kcal/mol）、SRC（-8.2 kcal/mol）及HSP90AA1（-8.7 kcal/mol）均具有较强的结合亲和力。体内实验表明，20 mg/kg莲心季铵碱可显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达34%（P ＜0.05），且未造成明显体重指数降低。

结论  莲心季铵碱在体内可抑制胰腺癌异种移植瘤的生长，其作用机制可能与调控PI3K AKT等多个靶点及信号通路相关。

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）作为一种起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，在所有癌症中其病死率排名第4，5年总生存率仅为12.5% [1]。尽管随着诊疗技术的不断进步，手术联合放化疗可使早期诊断的PC患者5年生存率提高至43.9%。但由于PC早期症状隐匿且缺乏特异性临床表现，约80%的患者在确诊时已处于局部进展期或伴有远处转移[2]。对于晚期患者，即使接受系统性化疗，5年生存率也仅为3.1%~14.7% [1]。目前，美国国立综合癌症网络指南推荐局部进展或转移性PC治疗方案主要包括：改良FOLFIRINOX方案（5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、奥沙利铂和伊立替康）或吉西他滨联合白蛋白紫杉醇方案[3-5]。然而，这些传统化疗方案疗效有限，且易产生耐药性，同时伴随骨髓抑制、消化道反应等严重不良反应，显著降低患者生活质量。近年来兴起的靶向治疗和免疫治疗虽为PC治疗带来新希望，但由于PC分子分型复杂、肿瘤微环境呈“冷肿瘤”特性、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）突变率高等因素，客观缓解率仍不理想[6-7]。因此，开发高效低毒、机制新颖的天然来源候选药物，已成为破解PC治疗困境的迫切需求。

中药在肿瘤防治领域具有悠久的历史和独特的优势。天然生物碱类化合物因其多靶点协同抗肿瘤、毒性低、患者耐受性好等特点，已成为新型抗肿瘤药物研发的重要方向[8]。莲子心（Nelumbinis Plumula）为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的成熟种子中的干燥幼叶及胚根，是传统的清热解毒中药。现代药理学研究表明，莲子心中主要含有莲心碱（liensinine）、异莲心碱（isoliensinine）、甲基莲心碱（neferine）和莲心季铵碱（lotusine）等双苄基异喹啉类生物碱。其中，莲心季铵碱（lotusine，CAS号：6871-67-6）分子式为C₁₉H₂₄NO₃（常以季铵阳离子形式存在），相对分子质量为314.4，是莲子心的主要活性成分之一。传统中医药理论认为莲子心性味苦寒，归心、肺、肾经，具有清心去热、固精止血、安神强心的功效[9]。现代药理学研究进一步揭示了莲心季铵碱在心血管系统[10]、神经系统[11]、皮肤保护[12]及肝脏代谢[13]等方面的多种生物活性。

近年来，莲子心中的生物碱类成分在抗肿瘤领域展现出良好的应用前景。研究表明，甲基莲心碱可通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信号通路，抑制肝癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡[14]。莲心碱可通过调节AMP依赖的蛋白激酶/缺氧诱导因子-1α（AMP-activated protein kinase/hypoxia-inducible factor-1α，AMPK/HIF-1α）轴重编程肿瘤免疫微环境，增强免疫治疗效果[15]。莲心季铵碱可通过抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/AKT/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路，抑制非小细胞肺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期于G0/G1期[16]。此外，网络药理学研究表明莲心季铵碱具有多靶点、多通路的药理作用特点[17]。然而，目前关于莲心季铵碱抗PC作用的研究尚未见报道。基于上述研究背景，本研究拟采用网络药理学方法预测莲心季铵碱治疗PC的潜在作用靶点及信号通路，并通过分子对接和动物实验进行验证，旨在为其作为抗PC候选药物的研发提供理论依据和实验支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Heracell Vios 160i CR细胞培养箱（美国ThermoFisher scientific公司）；DMi1和DM IL LED倒置显微镜（德国Leica公司）；血球计数板（北京索莱宝科技有限公司）；5804/5804R高速台式离心机（美国Eppendorf公司）；Heraguard ECO超净工作台（美国ThermoFisher scientific公司）。

1.2 主要药品与试剂

莲心季铵碱（货号：B28264-50mg）购自上海源叶生物科技有限公司；称取50 mg该药物，溶于适量生理盐水中，定容至2.5 mL，配制成浓度为20  mg/mL的储存液，分装后于-20 °C避光保存；给药前，将储存液置于室温解冻，涡旋混匀后使用。

Gibco Advanced RPMI-1640细胞培养（货号：12633020）、胎牛血清（货号：A5669401）和胰酶（货号：15050057）均购自美国ThermoFisher scientific公司；青霉素-链霉素（杭州Genom Bio公司，货号：GNM15140-1）；PBS（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1003）。

1.3 动物及细胞

SPF级C57BL/6J雄性小鼠，6~8周龄，购自杭州医科院，动物生产许可证号：SCXK（浙）2024-0037。小鼠饲养于浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心，饲养环境保持恒温（25 ℃）、恒湿（55%±5%），并采用昼夜明暗交替的光照周期，小鼠可自由饮水与进食。本实验经浙江大学医学院附属第一医院实验动物伦理委员会批准（伦理批件号：2025-262），所有动物实验操作均遵循实验动物3R原则。

小鼠PC细胞系KPC源自Kras^G12D/+ Trp53R ^172H/+ Pdx1-Cre小鼠模型的自发性肿瘤组织，经分离提纯后冻存于-18 ℃备用[18]。

1.4 网络药理学预测

1.4.1 莲心季铵碱潜在作用靶点筛选

通过SwissTargetPrediction数据库（https://www.swisstargetprediction.ch/）输入莲心季铵碱的英文名称“lotusine”及SMILES结构（C[N+]1(CCC2= CC(=C(C=C2[C@H]1CC3=CC=C(C= C3)O)OC)O)C），设置物种为“Homo sapiens”，筛选置信度≥0.1 的潜在靶点。同时结合中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中莲心相关生物碱的靶点信息进行补充，去除重复靶点后得到莲心季铵碱的潜在作用靶点集合。

1.4.2 PC相关靶点收集

在人类基因（GeneCards） 数据库（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://omim.org/）、DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）中分别以“pancreatic cancer”“pancreatic carcinoma”为关键词检索PC的相关靶点，合并3个数据库的结果，去除重复靶点后获得PC相关靶点集合。

1.4.3 交集靶点筛选与蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

利用Venny 2.1.0在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对莲心季铵碱潜在作用靶点和PC相关靶点进行交集分析，得到两者的共同靶点，即莲心季铵碱治疗PC的潜在作用靶点。将交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），设置物种为“Homo sapiens”，置信度得分＞0.7，隐藏孤立节点，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）网络。将PPI网络数据导出为 TSV 格式，导入Cytoscape 3.10.4 软件进行可视化分析，通过度（degree）值筛选核心靶点（degree 值≥5.52）。

1.4.4 GO功能与KEGG通路富集分析

将交集靶点上传至 DAVID（The Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery）数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/），设置物种为“Homo sapiens”，选择“GO biological process”（生物学过程，BP）、“GO  cellular component”（细胞组分，CC）和“GO molecular function”（分子功能，MF）进行GO功能富集分析，选择“KEGG Pathway”进行信号通路富集分析，以P＜0.05 为筛选标准，获取显著富集的功能条目和信号通路。

1.4.5 分子对接验证

莲心季铵碱的三维构象取自PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），核心靶点蛋白的晶体结构则源于蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB，https://www.rcsb.org）。借助AutoDock Tools 1.5.7完成受体分子的质子化处理后，将配体与受体同时导入，设定对接盒子以包络蛋白活性口袋；分子对接运算由AutoDock Vina执行，依据结合亲和力及氢键相互作用数目筛选最优构象，最终通过PyMOL Anaconda 3实现结果解析与图形呈现[19]。

1.5 动物实验

1.5.1 模型构建及分组给药

将小鼠PC细胞KPC细胞系于RPMI-1640完全培养基、混合10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，培养于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中。取处于对数生长期的KPC细胞，胰酶消化后调整细胞密度至5×10⁶个/mL，用PBS重悬，制成细胞悬液。另取5只C57BL/6J雄性小鼠作为正常组，仅皮下接种0.1 mL PBS作为假手术对照。向10只C57BL/6J雄性小鼠右前肢腋下皮下接种0.1 mL细胞悬液，待小鼠接种部位出现肿瘤结节且直径大于5 mm时，即PC荷瘤小鼠模型构建成功[20]。待移植瘤体积生长至100~150 mm3时，采用随机数字表法将建模成功的荷瘤小鼠随机分为2组：对照组（给予生理盐水）和莲心季铵碱组（20 mg/kg）[21]，每组5只。每次给药100 μL，ip，qd，连续给药9 d；正常组同步给予同体积生理盐水。

1.5.2 观察各组小鼠不同时间点肿瘤体积

利用游标卡尺测定给药前（记为第0天）及给药期间每2 d每只小鼠的肿瘤长径（a）与短径 （b），计算肿瘤组织体积（1/2×a×b2）。

1.5.3 计算各组小鼠抑瘤率

末次给药后24 h，麻醉后处死各组小鼠，称量体重，迅速剥离完整瘤体，称取肿瘤重量，并按公式计算抑瘤率[（对照组瘤重-给药组瘤重）/对照组瘤重×100%]。

1.5.4 统计学分析

通过GraphPad Prism 9.0.0软件进行处理分析，计量资料以表示，两组之间比较采用t检验。P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 莲心季铵碱潜在作用靶点与PC相关靶点筛选

通过SwissTargetPrediction和TCMSP数据库筛选，共获得莲心季铵碱潜在作用靶点112个。在GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库中检索并合并PC相关靶点，共得到2 187个。利用 Venny 2.1.0进行交集分析，最终获得37个莲心季铵碱治疗PC的潜在作用靶点（图1）。

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  图1 莲心季铵碱与PC韦恩图

  Figure 1.Venn diagram of lotusine and PC

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2.2 PPI网络分析与核心靶点筛选

将37个交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络，共包含37个节点和69条边，平均节点度为3.73。通过Cytoscape 3.10.4软件分析，根据degree值筛选出核心靶点12个，分别为雌激素受体2（estrogen receptor 2，ESR2，degree=6）、核糖体蛋白S6激酶B1（ribosomal protein S6 kinase B1，RPS6KB1，degree=6）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14，degree=6）、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2，degree=6）、雄激素受体（androgen receptor，AR，degree=7）、孕激素受体（progesterone receptor，PGR，degree=7）、mTOR（degree=8）、Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN，degree=10）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA，degree=10）、热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1，degree=13）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1，degree=15）、酪氨酸蛋白激酶Src（SRC proto-oncogene，SRC，degree=15）（图2）。

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  图2 莲心季铵碱与PC的PPI网络互作图

  Figure 2.PPI network interaction diagram of lotusine and PC

  注：A. 交集靶点PPI网络图；B. MCOD（molecular complex detection）聚类模块图；C. 拓扑分析核心靶点网络图。

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2.3 GO功能富集分析

GO功能富集分析结果显示，37个交集靶点共富集到148个显著差异的BP条目、23个CC条目和82个MF条目（P＜0.05）。其中，BP条目主要集中在“RNA聚合酶II转录”“信号转导”“DNA转录”“凋亡”等；CC条目主要富集在“细胞质膜”“细胞质”“细胞核”“线粒体” 等；MF条目主要包括“蛋白结合”“ATP结合”“酶结合”等（表1和图3A）。

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG信号通路富集分析共得到89条显著富集的通路（P＜0.05），主要涉及肿瘤相关信号通路，包括：磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）信号通路、内分泌耐药、催乳素信号通路及乳腺癌相关通路，提示交集靶点基因可能通过激素受体信号、生长因子受体信号及免疫检查点通路参与肿瘤发生发展及治疗耐药。其中，PI3K-AKT信号通路富集基因数有8个，提示其可能是莲心季铵碱治疗PC的核心通路（表2和图3B）。

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  表格1 莲心季铵碱治疗PC靶点GO功能富集分析Top10条目

  Table 1.Top 10 GO functional enrichment analysis of lotusine for PC

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  图3 GO功能与KEGG通路富集分析

  Figure 3.Enrichment analysis of GO functional enrichment analysis and KEGG pathway

  注：A. GO功能富集分析；B. KEGG信号通路富集分析。

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2.5 莲心季铵碱与核心靶点的分子对接

结合能为负值时提示配体-受体相互作用可自发进行，当该数值低于-5 kcal/mol时，提示二者间存在显著亲和力，且能量越低结合越稳固。分子对接数据显示，莲心季铵碱与ESR1、SRC及HSP90AA1的结合能分别为-7.8、-8.2、-8.7 kcal/mol，均远低于自发结合阈值，表明该生物碱与上述关键靶标间存在强效结合作用（图4）。

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  图4 莲心季铵碱与靶点对接模式图

  Figure 4.Schematic diagram of the docking mode between lotusine base and target

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2.6 莲心季铵碱对小鼠胰腺肿瘤生长的影响

造模成功并给药干预9 d后，对照组移植瘤体积（930.03±203.96）mm³及重量（0.88±0.26）g显著高于给药组（599.75±59.62  mm³，0.58±0.11 g，P＜0.05），给药组抑瘤率达34%，且给药组体重与正常组比较差异无统计学意义（图5）。

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  图5 莲心季铵碱对C57BL/6J小鼠PC移植瘤生长的影响（n=5）

  Figure 5.Effects of lotusine on the growth of PC xenografts in C57BL/6J mice (n=5)

  注：A. 体重曲线；B. 肿瘤体积变化曲线；C. 终末瘤重；D. 皮下瘤体的代表性图片；与对照组比较，aP<0.05。

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3 讨论

PC的发生发展是一个涉及多基因、多信号通路异常激活的复杂生物学过程，包括细胞增殖失控、凋亡受阻、炎症反应异常、血管生成过度等多个关键环节[22-23]。传统单一靶点的抗肿瘤药物往往难以有效抑制PC的恶性进展。网络药理学作为一种新兴的研究方法，强调从系统生物学和网络生物学的角度阐释中药多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，为揭示中药活性成分治疗复杂疾病的分子机制提供了新思路[24-25]。本研究通过整合网络药理学预测、分子对接验证和动物实验评价，系统阐明了莲心季铵碱抗PC的潜在分子机制。

3.1 核心靶点的生物学意义

本研究通过构建莲心季铵碱-PC交集靶点的PPI网络，筛选出12个高degree值的核心靶点，包括SRC、ESR1、HSP90AA1、PIK3CA、mTOR、JUN等。这些核心靶点在PC的发生发展中发挥关键作用。SRC作为非受体型酪氨酸激酶家族的重要成员，可通过激活EGFR/PI3K和黏着斑激酶/MAPK等多条信号通路促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[26]。HSP90AA1作为热休克蛋白90家族成员，可通过分子伴侣功能稳定突变型KRAS、SRC及雌激素受体α等致癌蛋白，保障其正确折叠并逃避泛素-蛋白酶体降解途径[27]。ESR1和ESR2等雌激素受体在PC中异常表达，可通过调控细胞周期蛋白D1、MYC原癌基因等增殖相关基因的转录促进肿瘤进展[28]。PIK3CA、mTOR与RPS6KB1构成经典的PI3K-AKT-mTOR-S6K生长信号轴，是调控蛋白质合成、细胞周期进程和代谢重编程的核心通路[29]。MAPK14与JUN构成应激-转录调控模块，可将细胞外炎症或缺氧信号转化为促进肿瘤细胞侵袭和上皮-间质转化的基因表达程序[30]。JAK2-STAT3信号通路则通过维持白细胞介素-6、血管内皮生长因子等促炎因子和血管生成因子的表达，促进肿瘤微环境的形成和维持[31]。莲心季铵碱可能通过同时作用于上述多个核心靶点，从多个层面协同抑制PC的恶性生物学行为。

3.2 关键信号通路的作用机制

KEGG通路富集分析结果显示，莲心季铵碱治疗PC的潜在靶点显著富集于PI3K-AKT信号通路、化学致癌-受体激活通路、内分泌耐药通路、雌激素信号通路等多条肿瘤相关通路。其中，PI3K-AKT信号通路是最核心的调控枢纽。该通路在约60%的PC中异常激活，可通过促进细胞周期进程、抑制细胞凋亡、增强蛋白质合成和糖酵解代谢等多种机制驱动肿瘤进展[32]。化学致癌-受体激活通路整合了外源致癌物和突变信号，可上调芳烃受体核转位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）、细胞色素P450 1A1（cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1，CYP1A1）等转录因子和代谢酶的表达，启动DNA损伤修复和原癌基因表达程序[33]。内分泌耐药和雌激素信号通路的富集提示莲心季铵碱可能通过调控激素受体信号影响PC细胞的增殖和存活[34]。蛋白聚糖在肿瘤中的作用通路则提示莲心季铵碱可能通过调节肿瘤微环境中的细胞外基质成分影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力  [35]。这些通路的协同调控构成了莲心季铵碱抗PC的多层次、多维度作用网络。

3.3 动物实验的验证

体内实验结果进一步证实了莲心季铵碱的抗PC活性。在连续9 d的给药周期内，20 mg/kg剂量的莲心季铵碱可显著抑制C57BL/6J小鼠PC移植瘤的生长，抑瘤率达34%，且未引起小鼠体重明显下降，显示出良好的安全性。这一结果与网络药理学预测的“多靶点-快速阻断PI3K/MAPK信号”机制相吻合[36]。值得注意的是，本研究中莲心季铵碱的抑瘤率虽低于临床一线药物吉西他滨单药治疗（文献报道约50%~60%）[37]，但考虑到莲心季铵碱为天然来源化合物、给药周期较短且未观察到明显毒性反应，其作为PC辅助治疗药物或与其他化疗药物联合应用具有潜在的临床应用价值。

3.4 研究局限性与展望

本研究存在一定的局限性。首先，动物实验样本量相对较小（每组5只），虽符合初步探索性研究的设计要求，但可能限制统计效力及结果的普适性。其次，本研究仅通过网络药理学预测、分子对接及短期皮下移植瘤模型进行初步验证，缺乏原位PC模型、转移模型及肿瘤免疫微环境的相关数据。此外，核心靶点（SRC、ESR1、HSP90AA1等）的因果关系尚未通过基因敲除/敲入等实验手段进行确证，莲心季铵碱的药代动力学特征和长期毒性也有待进一步研究。未来研究拟扩大样本量至8~10只以上，延长给药周期至4~6周并同步开展药代动力学/药效学分析；借助KPC基因工程小鼠原位模型、CRISPR-Cas9基因编辑技术、患者来源类器官疾病模型和患者来源异种移植瘤模型平台系统验证关键靶点；进一步设计“莲心季铵碱+吉西他滨”“莲心季铵碱+抗PD-1抗体”等联合治疗方案，以析因设计和Bliss模型评估协同指数，并探索ESR1/ESR2表达水平作为预测莲心季铵碱疗效的生物标志物，为精准临床试验提供依据。

3.5 结论

本研究通过网络药理学分析初步揭示，莲心季铵碱可能通过作用于SRC、ESR1、HSP90AA1等核心靶点，调控PI3K-AKT等关键信号通路，从抑制细胞增殖、促进凋亡、减轻炎症反应、抑制血管生成等多个方面发挥治疗PC的作用。该结果为后续莲心季铵碱的抗PC实验研究提供了理论基础和研究方向。

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