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目的 通过测定44批当归药材阿魏酸、藁本内酯含量并筛查59种植物生长调节剂（PGRs）残留量，分析总残留量与当归关键药效成分间的剂量效应关系。
方法 采用HPLC法测定44批不同产区当归样品中阿魏酸和藁本内酯的含量，并用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定样品中59种PGRs的残留量，最后运用R语言对药效成分含量与PGRs残留量进行相关性分析和回归模型拟合。
结果 阿魏酸与藁本内酯含量呈中度正相关（r =0.62，P＜0.001）。44批当归样品中共检出13种PGRs，其中5-硝基邻甲氧基苯酚钠、对硝基苯酚钠、萘乙酸甲酯的检出率高达95%。相关性分析表明，阿魏酸和藁本内酯含量均随PGRs总残留浓度的升高而呈总体下降趋势，二次多项式回归模型对两者关系的拟合优度略优于线性模型，呈现出“U型”或“先降后缓”的非线性特征。
结论 当归中PGRs残留具有普遍性和特异性的特点，其浓度的升高对阿魏酸和藁本内酯的积累具有抑制作用，且两者呈非线性衰减关系，建议应加强种植监管，保障当归临床疗效。
当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效，在《伤寒论》《千金方》等典籍中记载应用逾千例，素有“十方九归”之称，被誉为“血中之圣药”[1]。阿魏酸和藁本内酯是当归的关键活性成分[2]，前者通过抑制血小板聚集发挥活血作用[3]，后者则具有显著的抗炎镇痛活性[4-5]。《中国药典（2025年版）》[6]明确将二者作为质量评价的关键指标。当归种植已有1 400多年的历史，随着中药材种植产业化发展，当归栽培面临连作障碍加剧以及病虫害频发等问题[7]。为保障产量，部分药农通过使用植物生长调节剂（plant growth regulators，PGRs）干预药用植物生长。已有研究在当归药材中检出赤霉酸、矮壮素以及多效唑等PGRs的残留[8-9]。研究表明，使用PGRs会影响药用植物有效成分的积累[10]。例如，党参使用“壮根灵”后，党参多糖、党参炔苷、白术内酯Ⅲ含量会显著降低；脱落酸能提高甘草的甘草酸和甘草苷的含量[11-12]。PGRs虽可促进根系膨大、缩短生长周期，提高产量，但过度或滥用可能会干扰次生代谢通路从而影响药效成分的积累[13]。现行《中药材生产质量管理规范》[14]已明确禁止中药材种植使用PGRs。尽管《中国药典（2025年版）》[15]已收录69种PGRs的检测方法，但尚未规定其残留量的限量标准。因此，有必要对PGRs进行深入研究以制定科学合理的限度要求，从而保障中药材的临床疗效和用药安全。
本研究通过测定44批当归阿魏酸、藁本内酯含量以及PGRs残留量，采用R语言进行可视化和相关性分析，解析当归阿魏酸、藁本内酯含量与PGRs残留量之间的关系，以探讨确定当归合理的PGRs残留限量标准。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器
Sciex Qtrap 5500液质联用仪（美国AB SCIEX公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ME204/02电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；XMTD 4000电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；VXRBSO25混匀仪（德国IKA公司）；ZTY-70N摇床（上海知楚仪器有限公司）；S4-30R离心机（艾本德中国有限公司）；N-EVAP-112氮吹仪（美国Organomation公司）。
1.2 主要药品与试剂
阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，纯度99.0%）；藁本内酯对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：JB336265，纯度98.0%）；乙腈/水中59种PGRs混标溶液（天津阿尔塔科技有限公司，批号：S204825，浓度：100 mg/L）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
44批样品（编号：S1~S44，表1）均为2024年10~11月自行采集样品，经甘肃省药品检验研究院李冬华主任药师鉴定均为当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根。
2 方法与结果
2.1 当归药材阿魏酸和藁本内酯含量测定
2.1.1 混合对照品储备液的制备
分别精密称取阿魏酸对照品15.29 mg、藁本内酯对照品20.01 mg，置50 mL棕色量瓶中，用70%甲醇溶解定容，即得混合对照品储备液。
2.1.2 供试品溶液的制备
取当归药材，粉碎（过三号筛），精密称取药材粉末0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 HPLC色谱条件
色谱柱：Waters X-Bridge® C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.3%醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；检测波长：316 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。
2.1.4 系统适用性考察
取空白溶剂（70%甲醇）、混合对照品溶液（取混合对照品储备液，用70%甲醇稀释即得，其中含阿魏酸61.16 mg/L、藁本内酯80.04 mg/L）和供试品溶液适量，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，各被测成分色谱峰与相邻峰间的分离度均≥1.5，未见明显干扰（图1）。
2.1.5 线性关系考察
精密吸取混合对照品储备液，用70%甲醇稀释2、4、5、10、20倍，配制成一系列不同浓度的对照品溶液。按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得线性回归方程：阿魏酸：Y=45 705X-9 252（r=0.999 9）；藁本内酯：Y=45 793X-18 666（r=0.999 7）。阿魏酸和藁本内酯分别在15.29~152.90 μg/mL、20.01 ~200.10 μg/ mL浓度范围内线性关系良好。
2.1.6 精密度试验
取混合对照品溶液（阿魏酸61.16 mg/L、藁本内酯80.04 mg/L），按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次。计算得阿魏酸和藁本内酯峰面积的RSD分别为0.89%和1.20%（n=6），结果表明仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性试验
将供试品溶液分别于（25±2）℃条件下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。计算得阿魏酸和藁本内酯峰面积的RSD分别为0.66%和1.04%（n=6），结果表明供试品溶液在室温条件下放置24 h稳定性良好。
2.1.8 重复性试验
取当归样品（编号：S1），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。计算得阿魏酸和藁本内酯的平均含量分别为0.096%和1.623%，RSD分别为1.02%和1.31%（n=6），结果表明该方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验
取已知阿魏酸（0.096%）和藁本内酯（1.623%）含量的当归粉末（编号：S1）9份，每份约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入70%甲醇20 mL，再分别加入相当于样品含量50%、80%、100%的对照品溶液，按“2.1.2”方法制备回收率试验的供试品溶液，并按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，计算得阿魏酸和藁本内酯的平均回收率为99.62%和99.71%，RSD分别为0.76%和1.32%（n=9），结果表明该方法准确度良好。
2.1.10 当归阿魏酸和藁本内酯含量分布与相关性分析
取不同产地的当归样品粉末各约0.2 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.3”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积。采用外标法计算各样品中阿魏酸和藁本内酯的含量，并运用R语言进行Pearson相关性分析及含量分布可视化分析（图2）。
阿魏酸与藁本内酯含量呈中度正相关（r=0.62，P＜0.001），说明两种成分可能存在协同合成代谢途径。阿魏酸含量为（0.123±0.046）%，变异系数（coefficient of variation，CV）为37.4%；而藁本内酯含量为（1.732±0.742）%，CV为42.8%。这表明藁本内酯含量的波动更大，这可能与其化学性质不稳定有关。阿魏酸含量主要分布在0.05%~0.25%，呈右偏分布；藁本内酯含量主要分布在1.0%~3.0%，呈双峰分布。
2.2 当归药材中59种PGRs的测定
2.2.1 样品制备
取当归药材，粉碎（过三号筛），精密称取药材粉末3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入水10 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min；精密加入乙腈15 mL，涡旋混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min；加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠的混合粉末（4 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.5）6.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min，于冰浴中冷却10 min，离心（1 790 ×g）5 min；精密吸取上清液9 mL，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈振荡5 min使净化完全，离心（1 790×g）5 min；精密吸取上清液5 mL，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.2 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流动相：含0.05%甲酸和10 mmol/L甲酸铵水溶液（A）-含0.05%甲酸和10 mmol/L甲酸铵甲醇溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表3）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。
2.2.3 质谱条件
采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下同时采集，扫描方式为定时多重反应监测模式；辅助气压力GS1和GS2分别为55 psi、55 psi；雾化气压力为35 psi；离子化电压为正离子模式 +5 500 V、负离子模式-4 500 V；碰撞气强度为10；雾化温度为400 ℃。59种PGRs的检测离子对及对应的碰撞电压见表4，其多反应监测色谱图见图3。
2.2.4 方法学验证
参照《中国药典（2025年版）》四部通则9101分析方法验证指导原则[15]，对所建立的分析方法进行了方法学验证，结果见表5。结果表明，该方法符合方法学验证的相关要求。
2.2.5 样品测定结果可视化分析
采用R语言（4.4.2）中的pheatmap包，对44批当归样品中检出的13种PGRs的浓度进行可视化分析（图4）。原始浓度数据经lg（X+1）转换处理，有效解决了右偏分布问题，偏度由2.37降至0.85，转换后数据范围压缩至[0，1.92]区间。热图采用优化的9级蓝色渐变色谱，低于定量限的数值（n=177）以浅灰色标示。54号（5-硝基邻甲氧基苯酚钠）、57号（对硝基苯酚钠）及27号（萘乙酸甲酯）几乎在所有样本中均有检出。54号和57号在多个样本中呈现深蓝色，表明其普遍浓度较高，尤其在S3（83.657 μg/kg）、S7（66.957 μg/kg）及S16（75.799 μg/kg）等样本中浓度异常偏高。27号（萘乙酸甲酯）的浓度范围为2.895~27.116 μg/kg。
2.3 当归药材阿魏酸含量与PGRs残留相关性分析
为明确PGRs残留量与当归中阿魏酸、藁本内酯含量的相关性，采用R语言（4.4.2）中的ggplot 23.4.2和ggpmisc 0.5.0包，对44批样品的测定结果进行线性回归与二次多项式回归分析（图5和图6）。在阿魏酸的相关性分析中，线性回归模型显示阿魏酸含量随PGRs总残留浓度升高呈显著负相关下降趋势（Y=0.196-0.001 12X，Radj2=0.20）；二次多项式模型拟合优度略有提升（Y=0.13-0.177X+0.064 3X2，Radj2=0.21），曲线呈“U型”特征，提示在试验浓度范围内阿魏酸含量随浓度升高持续降低，但下降速率逐渐放缓。
在藁本内酯的相关性分析中，线性回归模型表明藁本内酯含量与PGRs总残留浓度呈显著负相关线性下降趋势（Y=2.37-0.011X，Radj2=0.14）；二次多项式模型拟合优度略有提高（Y=1.73-1.73X+0.792X2，Radj2=0.16），同样呈现“先降后缓”的趋势，且在50~100 μg/kg浓度区间内拟合一致性更高。
综合来看，两种有效成分含量均随PGRs浓度升高而降低，且二次模型对数据变异的解释能力略优于线性模型，但整体调整决定系数（Radj2=0.14~0.21）均较低，提示单一浓度变量对成分含量的解释能力有限，其调控效应可能受植物品种、生长环境等多因素共同影响。
3 讨论
3.1 药效成分关联性分析
本研究证实当归中阿魏酸与藁本内酯含量呈中度正相关（r=0.62，P＜0.001），二者均源自苯丙烷类代谢通路[16-17]，该通路是植物次生代谢的核心通路之一。阿魏酸作为酚酸类物质，是苯丙烷类代谢通路的重要中间产物，而藁本内酯作为苯酞类化合物，是该通路的终产物之一[18-19]；阿魏酸的积累可通过激活4-香豆酰辅酶A连接酶的活性，促进藁本内酯的合成[20]，因此二者呈现协同合成的正相关关系。
3.2 PGRs 残留污染特征
本研究采用LC-MS/MS法对59种PGRs进行筛查，44批不同产区当归样品中均检出PGRs 残留，共检出13种，其中5-硝基邻甲氧基苯酚钠、对硝基苯酚钠、萘乙酸甲酯检出率＞95%，为当归中主要的PGRs残留种类，表明当归PGRs污染具有广泛性和特异性。结合实际种植情况分析，当归PGRs残留的主要原因并非单一的直接使用，还包括种植环境的交叉污染：当归主产区多采用套种、轮作模式，与其套种的农作物（如小麦、马铃薯）常使用PGRs，导致土壤中PGRs残留并被当归根系吸收；同时，部分药农为提高当归产量，仍存在非法使用PGRs的行为。
3.3 PGRs 残留与阿魏酸、藁本内酯的相关性
阿魏酸、藁本内酯含量均随PGRs施用浓度的升高而呈总体下降趋势，提示外源PGRs的介入可能对当归次生代谢产物的积累产生抑制效应。在模型拟合优度方面，二次多项式模型对两者关系的解释能力均略优于线性模型。这一结果表明，PGRs对有效成分的调控并非简单的线性递减关系，而是呈现出“U型”或“先降后缓”的非线性特征，即在低浓度区间可能下降速率较快，而随着浓度进一步升高，下降速率逐渐趋于平缓。这与植物化感调节中常见的“低促高抑”现象及非线性响应模式具有一定相似性。
3.4 小结
本研究虽明确了当归PGRs残留与药效成分的U型剂量效应关系，但仍存在一定不足：样本量相对有限，仅分析了PGRs总残留的效应，未深入研究单一PGRs组分（如5-硝基邻甲氧基苯酚钠）对药效成分的独立作用。后续研究将从3 个方面展开：扩大样本量至200批以上，分析主要PGRs单一组分与当归药效成分的剂量效应关系，明确各组分的独立作用及协同/拮抗效应；结合多组学技术（转录组、代谢组）和离体培养体系，从分子水平阐明PGRs调控当归药效成分合成的机制，同时开展动物实验评估PGRs残留与药效成分的交互作用对当归临床疗效的影响，为当归PGRs残留限量标准制定和质量控制提供更全面的科学依据。
当归中阿魏酸与藁本内酯因共享苯丙烷代谢通路而呈显著正相关。PGRs残留具有普遍性和特异性，5-硝基邻甲氧基苯酚钠等3种PGRs检出率＞95%。相关性分析表明，PGRs浓度升高对两种有效成分的积累具有抑制作用，且呈非线性衰减特征。PGRs可能通过干扰苯丙烷代谢通路影响有效成分合成，其污染防控需重点关注种植环境交叉传递。
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