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目的 对国家抽验品种佐米曲普坦片的质量现状进行评价，建立佐米曲普坦片有关物质测定的HPLC法，完善质量标准，为药品监管提供技术支持。
方法 Supelco Ascentis Express90 Phenyl-Hexy色谱柱（10 cm×3.0 mm，2.7 μm），流动相为含己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（pH 2.0）-乙腈，梯度洗脱，检测波长为220 nm，流速为0.8 mL·min-1，柱温为40℃，进样量为10 μL。采用该方法对从全国范围内抽取的40批佐米曲普坦片样品及收集的原料进行检测。
结果 佐米曲普坦在0.840~1.260 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好（r=0.999 9），检出限为1 ng；杂质1~5的检出限分别为0.11，0.52，10.91，1.04，2.18 ng。
结论 所建立的方法专属性强，采用该方法对市售佐米曲普坦片进行质量评价，发现该品种生产工艺的关键控制点及包衣工艺对产品质量的影响，并建议将产品的储存条件规定为“凉暗处”。
佐米曲普坦为一种选择性5-羟色胺IB/ID受体激动药，临床上适用于成人伴或不伴先兆症状急性偏头痛的治疗，1997年AstraZeneca UK limited公司的佐米曲普坦片（规格：5 mg）在英国批准上市，次年英国上市了2.5 mg规格的片剂，1998年美国食品药品监督管理局批准上市，我国于1999年开始应用本品（规格：5 mg）[1-3]。佐米曲普坦适用于有或无先兆的偏头痛急性发作、月经期偏头痛及睡眠中发生的偏头痛。其常见的不良反应有头晕、恶心、嗜睡、温热感、无力、口干等。感觉异常或感觉障碍。咽喉部、颈部、四肢及胸部可能出现沉重感、紧缩感和压迫感，还可出现肌病、肌肉无力。
现收集的佐米曲普坦原料合成路线（图1）均以中间体（S）-4-（4-氨基苄基）-2-噁唑烷酮（佐米胺）为起始原料[4]，经过环合制得佐米曲普坦。佐米曲普坦在生产和储藏过程中极易产生氧化降解杂质。
佐米曲普坦片现行标准为中国药典2020版二部[5]，其中有关物质检查仅对单个杂质和杂质总量进行控制[5-16]。国外药典EP 10.0收载了本品的原料药标准[7]，USP 42收载了本品的原料药及片剂标准[6]。通过标准比对可知：①中国药典、EP 10.0和USP 42标准中有关物质检查法的差别较大，流动相、色谱柱、检测波长、系统适用性、限度等均不相同；②中国药典未对已知杂质进行测定，EP 10.0标准中明确了佐米曲普坦的9种已知杂质A~I的结构信息，USP 42标准中规定了3种已知杂质，通过比较分子结构可知，USP 42这3种已知杂质即为EP 10.0标准中的杂质B、杂质F和杂质C；③中国药典有关物质检查仅对单个杂质和杂质总量的限度进行控制，EP 10.0和USP 42则控制了已知杂质的限度。各药典中的已知杂质结构图见图2。
本文采用HPLC法，参考EP药典收载的佐米曲普坦原料的有关物质方法，建立了佐米曲普坦片的有关物质检查方法，检测出现行标准中未能检出的已知杂质和未知杂质，应用该方法，对不同厂家佐米曲普坦片仿制药及参比制剂进行了考察，并结合各厂家的生产工艺，对产品质量进行评价，通过加速试验对该产品的稳定性进行考察，为保障临床用药安全及科学监管提供了有力支撑，对片剂仿制药质量一致性评价起到积极引导和示范作用。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters e2695 高效液相色谱仪；XP 205型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2 试药
佐米曲普坦对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100698-201602，含量99.5%）；杂质1对照品（EP杂质B，批号：251451-30-6，含量100%）、杂质2对照品（EP杂质D，批号：139264-15-6，含量100%）、杂质3对照品（EP杂质E，批号：152305-23-2，含量100%）、杂质4对照品（EP杂质F，批号：139264-69-0，含量100%）、杂质5对照品（（EP杂质G，批号：139264-35-0，含量100%）、杂质6对照品（EP杂质I，批号：659738-69，含量100%）、杂质7对照品（佐米胺，批号：139264-24-7，含量100%）均购自Panphy Chemicals Corporation；佐米曲普坦片（参比制剂，英国Authorisation公司，规格：2.5 mg/片，批号：101P19）；乙腈和甲醇为色谱纯；正己烷磺酸钠和磷酸为分析纯；水为纯化水。
国家抽验工作收集的40批佐米曲普坦片的检验标准均为中国药典2020年版二部[5]，涉及国内5家制剂企业，规格均为2.5 mg/片；2批不同企业生产的佐米曲普坦原料。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Supelco Ascentis Express90 Phenyl-Hexy色谱柱（10 cm×3.0 mm，2.7 μm），流动相为含己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.72 g和己烷磺酸钠0.94 g，加水800 ml使溶解，加水至100 0 ml，用磷酸调节pH至2.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1），检测波长为220 nm，流速为0.8 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为10 μL。
2.2 溶液的配制
稀释溶剂：乙腈-含己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（90 ∶ 10）。系统适用性溶液：用甲醇配制成含佐米曲普坦1 mg·mL-1、杂质1~杂质7各10 μg·mL-1的溶液。供试品溶液：取佐米曲普坦片粉末用稀释溶剂制成1 mg·mL-1的溶液。对照溶液：精密量取供试品溶液，用稀释溶剂稀释至0.01 mg·mL-1的溶液。
2.3 系统适用性要求
精密吸取系统适用性溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（图3）。杂质2与佐米曲普坦间的峰分离度≥5.0；杂质7与佐米曲普坦间的峰分离度≥1.5；与佐米曲普坦较为接近的峰为杂质5、6和1，而参照USP 42佐米曲普坦片剂有关物质检测方法，将杂质1与佐米曲普坦间的峰分离度≥5.0作为系统适用性要求，结果表明，当杂质1与佐米曲普坦间的峰分离度≥5.0时，杂质与佐米曲普坦间及杂质与杂质之间的峰分离度均符合要求，故系统适用性规定为“杂质1与佐米曲普坦间的峰分离度≥5.0”。
2.4 专属性试验
取佐米曲普坦原料适量，分别采用高温破坏、氧化破坏、光照破坏、酸破坏及碱破坏强制降解试验，考察选定色谱条件是否能够有效分离各中间体和降解产物，结果见图4。
2.4.1 高温破坏
精密称取0.010 2 g佐米曲普坦原料置10 mL量瓶中，用稀释溶剂溶解后置于水浴中加热6 h，放冷后，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.4.2 氧化破坏
精密称取0.010 4 g佐米曲普坦原料置10 mL量瓶中，加入5 mL 30% H2O2溶液放置1 h后，放冷用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.4.3 光照破坏
精密称0.010 5 g佐米曲普坦原料置10 mL量瓶中，用稀释溶剂溶解并稀释至刻度后于阳光下放置3 d。
2.4.4 酸破坏
精密称取0.010 5 g佐米曲普坦原料置10 mL量瓶中，加入2 mol·L-1盐酸溶液2 mL放置4 h后，再加适量2 mol·L-1氢氧化钠溶液中和，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.4.5 碱破坏
精密称取0.010 8 g佐米曲普坦原料置10 mL量瓶中，加入2 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL放置4 h后，再加适量2 mol·L-1盐酸溶液中和，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.5 稳定性考察
经考察，主成分在8 h内稳定（主成分峰面积的RSD为0.53%，n=8），但氧化杂质1含量呈上升趋势，以杂质变化的绝对值小于0.1%计算，应在4 h内完成测定，故供试品应临用新制。
2.6 检出限
在信噪音比大于3时，佐米曲普坦的检出限为1 ng，杂质1~5的检出限分别为0.11，0.52，10.91，1.04，2.18 ng。
2.7 线性与校正因子
精密称取佐米曲普坦原料和各杂质对照品，用稀释溶剂制成不同浓度的系列标准溶液，以质量浓度为横坐标（X，μg·mL-1），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程，并以标准曲线法计算7个杂质相对于佐米曲普坦的相对校正因子，结果见表2。
2.8 精密度试验
取中间浓度线性溶液，连续进样6次，测得佐米曲普坦和7个杂质峰面积的RSD均小于2.0%（n=6），表明该仪器精密度良好。
2.9 佐米曲普坦杂质的归属
经文献检索、现场调研及专属试验，将佐米曲普坦中可能存在下述7种杂质的来源进行大致归属（表3）。
2.10 已知杂质毒性预测
基于公开报道的文献数据以及制药企业授权的实验数据，通过采用AI算法，搭建了约100个ADME性质的预测模型，采用ADMET Predictor 药物吸收/药物毒性预测软件对7个已知杂质的致突变风险预测、化合物毒性预测、致磷质病预测、致雄性受体毒性质病预测、皮肤过敏反应预测、呼吸致敏反应预测等6个方面进行毒理评价。预测结果毒性风险系数（TOX Risk）越大表示毒性预测越不理想，一般其≤2.0。具体结果见表4。
2.11 样品的测定
采用“2.1”项下的色谱条件，对4家企业3批原料样品（不同生产厂家）和3批片剂及参比制剂进行有关物质测定，结果见表5。
2.12 加速试验稳定性考察
选取4家生产企业的佐米曲普坦片各1批，带完整包装样品在40℃、相对湿度75%的恒温恒湿加速箱中放置2个月，进行加速试验的考察。按“2.1”项色谱条件进样分析，记录色谱图（图5），分别测定4家生产企业常规放置样品及加速试验后的样品4批，对其已知杂质、最大单个杂质、杂质总量的变化情况进行考察，结果见表6。
2.13 有关物质限度确定
抽取的样品中，已知杂质1和未知杂质（相对保留时间为1.96）为主要检出杂质，且杂质1为氧化杂质，在生产工艺极运输贮藏过程中易产生，毒性预测杂质1有致突变风险，因此对杂质1和相对保留时间为1.96的未知杂质进行控制非常必要。结合EP药典有关物质限度及样品检出情况，有关物质限度设定为供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质1峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.2%），相对保留时间为1.96的杂质峰面积不得大于对照主峰面积的0.2倍（0.2%），其他单个杂质峰面积不得大于对照峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照主峰面积（1.0%）。小于对照峰面积的0.01倍的色谱峰忽略不计。
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
本研究针对现行有关物质检查方法中，等度洗脱条件下分析时间过短，部分杂质未被洗脱及已知杂质未进行归属的问题，以已知杂质之间及杂质与佐米曲普坦之间的有效分离为系统适用性要求，分别对中国药典2020年版、EP 10.0及USP 42收载的佐米曲普坦标准的色谱条件进行对比分析，结果显示，在EP 10.0的色谱条件下，各已知杂质峰之间、佐米曲普坦峰与相邻的已知杂质峰之间的分离均良好，且佐米曲普坦在EP 10.0采用的正己烷磺酸钠缓冲液-乙腈流动相体系中的洗脱速度较快，有利于多批次样品的分析，故选择EP 10.0标准中的方法作为有关物质色谱分析条件。
3.2 检测浓度与检测波长的选择
中国药典、EP 10.0、USP 42标准的供试品浓度不一致（分别为10，2，2 μg·mL-1），为避免供试品浓度过低导致杂质无法检出，故选择10 μg·mL-1作为供试品浓度。中国药典、EP 10.0、USP 42标准的检测波长均不相同（分别为210，225，225 nm），对已知杂质混合溶液进行全波长扫描，结果显示佐米曲普坦及杂质均在220 nm有最大吸收，故选择220 nm作为检测波长。
3.3 有关物质测定情况分析
对比2批原料的有关物质检出情况，原料杂质个数为3~4个，杂质总量为0.1%~0.3%，最大单个杂质均为未知杂质1（相对保留时间1.93）；对比原料与片剂杂质情况可知，制剂中的杂质4、5及未知杂质1均与原料杂质的个数与检出量一致，说明这3种杂质均由原料带入；根据有关物质强降解试验可知，杂质1为佐米曲普坦氧化杂质，且在加热条件下加速氧化。
3.4 杂质归属、杂质毒性预测和杂质限度分析
结合原料的合成路线、制剂与原料的强降解试验、制剂的加速试验，对7个杂质进行了归属，杂质1为氧化降解杂质且温度加剧氧化反应，杂质4为水解降解杂质，其余杂质均由原料带入。
对7个已知杂质进行毒性预测，杂质1致突变风险为1.5（大于1.0），其他杂质均小于1.0；杂质毒性杂质1化合物毒性值为2.0，其他杂质毒性评估值均小于2.0；其中杂质2、4、5可能会有产生雄性激素受体毒性和致磷脂质病风险，杂质4和6可能会有致呼吸道过敏风险，杂质3、4、6有致皮肤过敏风险。因此对氧化杂质1进行控制非常有必要，其单个不大于0.2%，其他杂质不大于0.5%。
3.5 制剂工艺对产品质量的影响
通过制剂工艺调研可知，仅有A企业采用直接压片法，B企业采用湿法制粒未控制温度，C企业同样采用湿法制粒但控制温度为50℃。采用“2.1”项下的条件对比分析A、B、C企业的原料（分别为0.012%，0.013%和0.025%）与片剂（分别为0.03%，0.22%和0.08%）中杂质1的含量，A企业的杂质量几乎无变化，B企业的杂质量增加了近20倍，C企业的杂质量增加了3倍，因此推测氧化杂质1的可能与制剂工艺中的制粒温度相关。
3.6 包装材料对产品质量的影响
A、B、C、D企业的片剂在加速条件下杂质1均有增加，其中C企业（批号：121907）的杂质1增加了将近20倍；A企业的杂质1增加了近10倍；B企业的杂质1增加了2.5倍；D企业的杂质1增加了1.25倍。对比分析各片剂的包装材料可知，C企业未进行包衣，而A、B、D企业虽然都有包衣，但是包衣材料及工艺不同，好的包衣材料能够更好地阻隔氧气，减少氧化杂质1的产生。杂质1在加速条件下的产生与包衣与否及包装材料的质量关系密切，也提示了该产品在高温和高湿下均易产生杂质1，故该产品的储存条件应该在凉暗处。
3.7 储藏条件对产品质量的影响
通过强降解试验及加速试验可知，在高温和高湿条件下，氧化杂质迅速增加，提示温度可加速氧化杂质的产生，因此建议该产品的贮藏条件应为凉暗处密封保存。
3.8 国内不同企业制剂的质量评价
采用新建立的有关物质对样品进行检测，国内4家企业的杂质控制良好，杂质总量均未超过1.0%，但是C企业氧化杂质达到0.18%，接近氧化杂质的限度，对该企业的处方及包装材料进行分析可知，该企业的制剂生产工艺中未对制粒过程中的温度进行控制，也无包装工艺，从而导致氧化降解杂质增加。各企业应关注在制剂生产工艺中控制制粒温度，关注包衣材料对产品质量的影响，在产品的贮藏及运输过程中注意温度的控制，提高生产工艺的稳定性与可控性。
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