目的  对比黄芪饮片的性状、气味、指纹图谱、灭菌效果及浸出物、有效成分含量，以考察不同灭菌方式对黄芪饮片质量的影响，进一步优选黄芪饮片的最佳灭菌工艺参数。

方法  对比湿热灭菌、辐照灭菌、干热灭菌对黄芪饮片质量的影响，选择最佳灭菌方式。基于此，以黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、两者总含量和灭菌率为考察指标，灭菌温度、灭菌时间、物料厚度为考察因素，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化黄芪饮片最佳干热灭菌工艺。

结果  选择干热灭菌方式对黄芪饮片进行灭菌；干热灭菌最佳工艺为：灭菌温度113 ℃、灭菌时间5.1 h、物料厚度19 mm。

结 论  综合考虑灭菌效果、对有效成分含量的影响、操作性及经济成本，选择干热灭菌为黄芪饮片的最佳灭菌方式，优选得到的灭菌工艺稳定可行、重复性好，可为其工业化生产提供科学依据。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mong-holicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，味甘，性微温，具有补气固表、利水消肿、生津养血，托毒排脓等功效[1]。中药固体制剂中饮片原粉入药较为常见，而黄芪饮片临床应用广泛，有很多生粉入药的情况，为满足药品微生物限度要求，保证临床用药安全，选择适宜的灭菌方法对保证中药制剂质量具有重要意义[2]。在实际生产中，需要根据药材特点、物性以及有效成分稳定性选择合适的灭菌方式，在灭菌的同时保证有效成分不被破坏[3-4]。但目前关于黄芪灭菌工艺的研究较少，滕宝霞等[5]经过对比不同灭菌方法，发现辐照灭菌效果理想，但辐照灭菌方式存在残留问题且成本较高。故本研究以黄芪饮片为研究对象，考察不同灭菌方式对黄芪饮片质量的影响，选择最佳灭菌方式，并以黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、两者总含量和灭菌率的综合评分为指标，通过响应面法筛选出最佳灭菌工艺参数，为以后黄芪产品开发以及制剂研究提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

Waterse2695型高效液相色谱仪，包括2 998 PDA检测器、C21SMC430G柱温箱（美国Waters公司）；XS105DU型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；MQS0.6型脉动真空灭菌柜（张家港市环宇制药设备有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

黄芪饮片（安国市聚药堂药业有限公司，批号：450222002）经鲁南厚普制药有限公司高级工程师高艳红鉴别为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根；黄芪甲苷（批号：110781-202219，纯度96.2%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201907，纯度96.8%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（批号：20105219）、乙腈（批号：20045077）均购自美国天地有限公司；甲酸（南京化学试剂有限公司，批号：191115647F）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 灭菌方法及样品检查方法

2.1.1 灭菌样品的制备

分别采用湿热灭菌、辐照灭菌、干热灭菌3 种不同方式制备黄芪饮片的灭菌样品。根据平时试验经验及前期预试验，灭菌温度与时间均不可太低，故试验条件设定为：湿热灭菌：脉动真空灭菌柜115  ℃灭菌1 h；干热灭菌：烘箱100 ℃灭菌6 h；辐照灭菌：⁶⁰Co射线6 kGy 辐照灭菌。

2.1.2 微生物限度检查

称取本品20 g至380 mL胰酪大豆胨液体培养基中，浸泡并充分振摇混匀即得1 ∶ 20的供试液，备用。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数采用平皿法计数，控制菌按分别取1 ∶ 10的供试液接种大肠埃希菌、沙门菌和耐胆盐革兰阴性菌按照《中国药典（2020年版）》四部通则1108项下控制菌的检查法进行试验[1, 6]。

2.1.3 其他指标检查

对比灭菌前后黄芪饮片的性状、气味、鉴别项、水分、水溶性浸出物以及有效成分含量[7]。

2.1.4 指纹图谱方法建立

2.1.4.1 供试品溶液的制备

将黄芪饮片粉碎，过四号筛，精密称定黄芪粉末约1 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50  mL，称重，回流4 h，放冷后称重，用甲醇补足重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.4.2 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~3 min，10% A；3~10 min，10%~17% A；10~18 min，17% A；18~22 min，17%~23% A；22~39 min，23% A；39~50 min，23%~43% A；50~60 min，43% A；60~61 min，43%~10% A；61~70 min，10% A）；柱温：25 ℃，检测波长：260 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。

2.1.4.3 精密度试验

取同一份供试品溶液，按“2.1.4.2”项下色谱条件下进样测定6次，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.93%~1.20%（n=6），相对峰面积的RSD为1.25%~2.54%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.4.4 稳定性试验

取供试品溶液，按“2.1.4.2”项下色谱条件下分别于室温下放置0、2、6、10、16、20、24 h后进样测定，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.55%~1.91%（n=7），相对峰面积的RSD为0.57%~1.61%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.5 重复性试验

取同一批样品，按“2.1.4.1”项下方法平行制备6份供试品溶液进样测定，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为1.12%~2.36%（n=6），相对峰面积的RSD为0.84%~2.54%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2 含量测定方法

2.2.1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测条件

采用Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，20%~40% A；20~30 min，40% A）[1]；检测波长：260 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2.2 黄芪甲苷检测条件

采用Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（150  mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水

（32 ∶ 68）[1]；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；蒸发光散射检测器检测（漂移管温度为105 ℃，载气流速为3.0 L/min）。

2.2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷适量，加甲醇分别制成每1 mL含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.020 5 mg和每1 mL含黄芪甲苷0.392 3 mg的对照品溶液，即得。

2.2.4 供试品溶液的制备

参照《中国药典（2020年版）》一部黄芪含量测定项下制备供试品溶液[8]。

2.2.5 线性关系考察

取“2.2.3”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液5、10、20、30、50 mL于100 mL量瓶中，加流动相定容，摇匀，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以进样浓度为横坐标（X，μg/ mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程为Y=36 832X-16  713（r =0.999  5），结果表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在1.025~10.250 μg/mL范围内线性关系良好。

取“2.2.3”项下黄芪甲苷对照品溶液2、3、4、5、6 μL注入液相色谱仪，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，以进样量为横坐标（X， μg）、峰面积对数为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到黄芪甲苷回归方程为Y=0.618 4X-0.866 0（r=1.000 0）。结果表明黄芪甲苷在0.784 6~2.353 8 μg范围内线性关系良好。

2.3 不同灭菌方式对黄芪饮片质量的影响结果

微生物限度检查结果见表1，其他指标检查结果见表2，指纹图谱结果见图1和表3。由结果可知，湿热灭菌对于黄芪饮片各项指标影响均较大；干热灭菌和辐照灭菌对黄芪饮片各项指标影响较小，但辐照灭菌的药效学及毒理学影响尚待研究，且辐照成本相对较高，故选择干热灭菌法对黄芪饮片进行灭菌。

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  表格1 不同灭菌方法黄芪饮片微生物限度检查结果

  Table 1.Results of microbial limit examination of Astragali Radix decoction pieces by different sterilization methods

  

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  表格2 不同灭菌方法各指标检测结果

  Table 2.Detection results of different sterilization methods

  

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  图1 不同灭菌方法指纹图谱

  Figure 1.Fingerprints of different sterilization methods

  注：S1. 未灭菌；S2. 湿热灭菌；S3. 辐照灭菌；S4. 干热灭菌；R. 对照。

  

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  表格3 不同灭菌方法指纹图谱相似度

  Table 3.Similarity of fingerprints of different sterilization methods

  

2.4 干热灭菌工艺优化

2.4.1 灭菌率测定

采用平板计数法对制备的样品菌总数进行测定，该法出自《中国药典（2020年版）》四部1108通则项下的中药饮片微生物限度检测法[1]，计算灭菌率。

样品菌总数=样品细菌总数+霉菌及酵母菌总数

灭菌率=（未处理样品菌总数-处理样品菌总数）/未处理样菌总数

2.4.2 层次分析法确定权重系数

根据《中国药典（2020年版）》一部[8]对黄芪含量测定成 分要求，对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、两者总含量和灭菌率作出权重指标予以量化。将4个指标分为两个层次，确定4 项指标的优先顺序为：两者总含量=灭菌率＞毛蕊异黄酮葡萄糖苷=黄芪甲苷[9]。构建的指标成对比较的判断优先矩阵见表4。

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  表格4 指标成对比较的优先矩阵

  Table 4.Priority matrix for pairwise comparison of indicators

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根据评分结果，层次分析法计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、两者总含量和灭菌率的权重系数分别为0.124 5、0.124 5、0.375 5、0.375 5，一致性比例因子为0 （＜0.1），指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，权重系数有效。

2.4.3 单因素试验

2.4.3.1 灭菌温度考察

在灭菌时间6 h、物料厚度15 mm的条件下，考察不同温度（90、100、110、120、130 ℃）对综合评分的影响，结果见图2。随着温度增高，综合评分先升高，于110 ℃时达到顶峰后略降低。因此，选择100、110、120 ℃进行后续试验。

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  图2 灭菌温度对综合评分的影响（n=5）

  Figure 2.Effect of sterilization temperature on the comprehensive scores (n=5)

  

2.4.3.2 灭菌时间考察

在灭菌温度110 ℃、物料厚度15 mm的条件下，考察不同灭菌时间（3、4、5、6、7 h）对综合评分的影响，结果见图3。随着时间增加，综合评分先增加后趋于平缓，在5 h时灭菌率最高，5 h之后灭菌率基本不变，因此选择4、5、6 h进行后续试验。

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  图3 灭菌时间对综合评分的影响（n=5）

  Figure 3.Effect of sterilization time on the comprehensive scores（n=5）

  

2.4.3.3 物料厚度考察

在灭菌温度110 ℃、灭菌时间5 h的条件下，考察不同物料厚度（10、15、20、25、30 mm）对综合评分的影响，结果见图4。随着物料厚度增大，综合评分降低平缓，到15 mm后灭菌率降低，综合评分降低明显，因此选择15、20、25 mm进行后续试验。

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  图4 物料厚度对综合评分的影响（n=5）

  Figure 4.Effect of material thickness on comprehensive scores（n=5）

  

2.4.4 响应面优化Box-Behnken试验设计和结果

依据响应面试验设计原理，结合单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表5，设计及结果见表6和表7。

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  表格5 干热灭菌因素水平表

  Table 5.Table of dry heat sterilization factor levels

  

利用Design-Expert 8.0.6 软件进行二次多元回归分析，得到响应值与各因素的回归方程Y=79.21+3.06A+0.63B-0.70C-0.12AB+0.25AC-0.017BC-5.09A²-1.77B²-1.78C²，方差分析结果见表6。模型的F为26.42、P＜0.000 1，说明模型极显著；失拟项P为0.108 6，影响不显著，说明非试验因素对试验结果影响不大，模型成立。其中A（灭菌温度）对综合评分有极显著影响，B（灭菌时间）和C（物料厚度）对综合评分无显著差异，二次项A²、B²、C²均达到显著水平（P ＜0.05）。各因素的影响顺序依次为灭菌温度＞物料厚度＞灭菌时间，交互作用的响应面和等高线图见图5~图7。

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  表格6 Box-Behnken响应面实验设计及结果

  Table 6.Experimental design and results of Box-Behnken response surface

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  表格7 响应面二次回归方程方差分析结果

  Table 7.Anova results of quadratic regression equation for response surfaces

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  图5 灭菌温度和灭菌时间对黄芪饮片灭菌工艺综合评分的影响

  Figure 5.Effects of sterilization temperature and sterilization time on the comprehensive scores of sterilization process of Astragali Radix decoction pieces

  

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  图6 灭菌温度和物料厚度对黄芪饮片灭菌工艺综合评分的影响

  Figure 6.Effects of sterilization temperature and material thickness on the comprehensive scores of the sterilization process of Astragali Radix decoction pieces

  

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  图7 灭菌时间和物料厚度对黄芪饮片灭菌工艺综合评分的影响

  Figure 7.The effect of sterilization time and material thickness on the comprehensive scores of the sterilization process of Astragali Radix decoction pieces

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2.4.5 验证试验

根据响应面模型和结果分析，得到最佳灭菌工艺参数为：灭菌温度112.94 ℃，灭菌时间5.08  h，物料厚度19.12 mm，在此条件下计算得到的综合评分为79.78。结合实际生产及可操作性，将灭菌条件修正为灭菌温度113 ℃,灭菌时间5.1h，物料厚度19 mm，在此条件下进行3次验证试验，结果见表8。由结果可知，3次验证试验平均综合评分为79.74，表明该工艺稳定、可行、重复性好，可作为黄芪饮片的灭菌工艺。

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  表格8 平行验证试验结果（n=3）

  Table 8.Results of parallel verification test (n=3)

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3 讨论

随着中医药的发展，人们对中药饮片及中药制剂的需求量日益增加，而且伴随很多中药材生粉直接入药的情况，药材原粉入药极易带入微生物造成污染，为保证临床用药安全，选择适宜的灭菌方法对保证中药制剂质量具有重要意义[10]。目前，常用的中药材灭菌方式有干热灭菌、湿热灭菌、60Co辐照灭菌、乙醇灭菌、微波灭菌、紫外灭菌等多种方式，不同的药材因其性质的不同所适用的灭菌方式也不相同[11-12]。

本文选择干热灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌方法进行对比，结果发现3种方法的灭菌效果均较好；湿热灭菌不但对黄芪饮片的性状有影响，而且使水溶性浸出物含量以及指标成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷含量降低较为明显；辐照灭菌对黄芪饮片质量评价各个指标几乎没有影响，但操作成本高，必须有专用的设备和环境，无企业参考执行标准，而且辐照灭菌应用于传统中药的历史较短，基础研究较少，人们对其安全性仍持有怀疑[13]。干热灭菌法对黄芪饮片性状、气味、指标成分含量等质量评价指标影响较小，而且操作简便，适合工业大生产，故选择干热灭菌法进行黄芪饮片的灭菌方法。

Box-Behnken设计-响应面法作为常用的优选工具，设计方法简单，数学模型预测性好，结果直观便于分析，试验精确度较高[14]。本研究在单因素基础上，采用响应面法优选得到干热灭菌的最佳工艺为灭菌温度113 ℃、灭菌时间5.1 h、物料厚度19 mm，优选的灭菌工艺稳定可行，在灭菌的同时保证了黄芪饮片质量，为黄芪饮片后续制剂研提供依据。

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